Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromatin Immunoprecipitation assay ved hjælp af Mikrococcal-nukleaser i pattedyrsceller

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59375
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Chromatin immunopræcipitation (ChIP) er et effektivt værktøj til at forstå de molekylære mekanismer i genreguleringen. Men metoden indebærer vanskeligheder med at opnå reproducerbar kromatin fragmentering ved mekanisk klipning. Her giver vi en forbedret protokol til en ChIP analyse ved hjælp af enzymatisk fordøjelse.

Abstract

At udtrykke cellulære fænotyper i organismer, levende celler udføre genekspression i overensstemmelse hermed, og transkriptionelle programmer spiller en central rolle i genekspression. De cellulære transkriptionelle maskiner og dets kromatin modificerings proteiner koordinerer for at regulere transkriptionen. For at analysere transkriptional regulering på molekylær niveau er der flere eksperimentelle metoder såsom elektroforetisk mobilitets Skift, forbigående reporter og kromatin chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays. Vi beskriver en modificeret spån analyse i detaljer i denne artikel på grund af dens fordele i direkte at vise Histon modifikationer og samspillet mellem proteiner og DNA i celler. Et af de vigtigste trin i en vellykket spån analyse er kromatin klipning. Selvom sonikering er almindeligt anvendt til klipning af kromatin, er det vanskeligt at identificere reproducerbare betingelser. I stedet for at klippe kromatin ved sonikering udnyttede vi enzymatisk fordøjelse med micrococcal nuclease (mnase) for at opnå mere reproducerbare resultater. I denne artikel, vi leverer en ligetil ChIP assay protokol ved hjælp af MNase.

Introduction

Genekspression i pattedyrsceller reguleres stramt og dynamisk, og transkriptionen er et af de vigtigste trin. Gen transkriptionen reguleres hovedsageligt af transkriptionsfaktorer og histoner. En transkriptionsfaktor er et protein, der binder til specifikke DNA-sekvenser og kontrollerer gen transskription. Disse faktorer enten fremme eller hæmme rekrutteringen af RNA polymerase II (PolII), som initierer mRNA syntese fra genomisk DNA som en skabelon1. Histon modifikationer såsom acetylering og methylering af Histon hale rester positivt og negativt påvirke gen transkriptionen ved at ændre kromatin struktur2. Da ændringer i genekspression påvirker cellulære sammenhæng, er det vigtigt at undersøge de molekylære mekanismer, som transskription er reguleret.

Til dato er der flere metoder til at undersøge reguleringen af gentransskription. Elektroforetisk mobilitets Skift-analyse (EMSA), også kaldet en gel-Shift-analyse, anvendes til analyse af en protein-DNA-interaktion3. En nuklear ekstrakt fra celler af interesse er inkuberet med en radioaktiv isotop (for eksempel 32P)-mærket DNA-sonde og elektro phoresed på en polyacrylamid gel. Dens autoradiogram viser, at DNA-protein komplekset migrerer langsommere end sonden i en gel. I nærværelse af et antistof mod proteinet, migrerer DNA-protein-antistof-komplekset i en gel langsommere end DNA-protein komplekset. Dette Super forskudt bånd afslører specifik binding mellem DNA og protein. EMSA afgør dog kun et specifikt DNA-protein-samspil i et celle frit system, og det er derfor stadig ukendt, om interaktionen kontrollerer transkriptionen i levende celler. Den forbigående reporter-analyse, almindeligvis kaldet der reporter assay, blev udviklet for at adressere regulering af genekspression i celler. Typisk indsættes en opstrømsgenisk region af et gen af interesse i en reporter plasmid, transitivt transficeret i celler, og indberetteren aktivitet måles. En række forskellige sletnings mutanter gør det muligt at identificere de regioner, der er ansvarlige for gen-reguleringen. Selv om en reporter assay er et nyttigt redskab til at identificere transkriptionsfaktorer og bindende DNA-sekvenser kontrollerer transkriptionen, denne metode har en stor ulempe i, at en reporter plasmid er fri for kromatin struktur og ikke afspejler "reelle" transskriptions maskiner. Desuden kan ændringer i Histon modifikationer ikke bestemmes af systemet.

Udviklingen af kromatin chromatinimmunpræcipitation (ChIP) metode var baseret på Jackson og chalkley's rapporter om, at "hele cellen" fiksering med formaldehyd bevaret kromatin struktur4,5. Siden da, mange relaterede teknikker er blevet udviklet og forbedret6. I ChIP assays, er cellerne fastgjort med formaldehyd til Cross-link DNA og proteiner. Kromatin er fragmenteret og derefter immunoprecipitated med antistoffer af interesse. Immun komplekset vaskes, og DNA renses. PCR amplifikation med primere målrettet mod en bestemt region af genomet afslører belægningen af proteiner af interesse i genomet.

Selvom ChIP er et kraftfuldt værktøj til at identificere samspillet mellem proteiner som transkriptionsfaktorer og modificerede histoner med DNA, indebærer metoden nogle vanskeligheder, såsom et kromatin-fragmenterings trin i praksis. Sonikering er blevet almindeligt anvendt til klipning af kromatin; Det er imidlertid besværligt at identificere reproducerbare betingelser. Mikrococcal nuclease (MNase) behandling er en alternativ metode til kromatin klipning. MNase er en endo-exonuclease, der fordøjer dobbelt-strandede, enkelt-strandede, cirkulære og lineære DNA og RNA. Det er relativt nemt at bestemme betingelserne, herunder mængden af kromatin og enzym, temperatur, og inkubationstid, for optimal kromatin fragmentering. Vi har ændret og forenklet de eksisterende protokoller, og vi har etableret en enkel og reproducerbar metode. Dette papir giver protokollen for en ChIP assay ved hjælp af MNase i pattedyrceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargøring af reagenser

  1. Lav 18,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning. Tilsæt 0,925 g PFA, 4,8 mL vand (brug ultrapurificeret vand i hele protokollen) og 35 μL af 1 M KOH i et 50 mL konisk plastik rør. Luk hætten stramt og Opvarm røret i et 400-600 mL glasbæger, der indeholder ca. 200 mL vand ved hjælp af en mikrobølgeovn. Fjern røret, før vandet begynder at koge, og vortex røret for at opløse PFA. Lad PFA køle af til stuetemperatur og opbevares på is.
    Bemærk: Gentag opvarmning og blanding, indtil PFA opløses helt. Forbered PFA-opløsningen umiddelbart før tværbinding (trin 2.1.3).
  2. Lav 1,25 M Glycin opløsning. 14,07 g glycin opløses i 150 mL vand og filtreres gennem et pore størrelses filter på 0,22 μm. Opbevares ved 4 °C.
  3. Lav ChIP cellelyse buffer. 378 mg rør opløses, 10,6 mL 2 M KCl og 1,25 g forgrenet octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol i vand. Justér pH til 8,0 med 1 M KOH ved 4 °C og lav op til 250 mL. Filtrer gennem et 0,22 μm pore størrelses filter og opbevares ved 4 °C.
  4. Gør mikrococcal nuclease (MNase) fordøjelses buffer. Til fremstille 1 ml blandes 0,1 ml 10x mnase-fordøjelses buffer, 10 μl 100x BSA-opløsning, 10 μl 0,1 M ditiotreitol og 0,88 ml vand.
  5. Lav 1 M NaHCO3. 4,2 g NaHCO3 opløses i 50 ml vand og filtreres gennem et pore størrelses filter på 0,22 μm. Opbevares ved stuetemperatur.
  6. Lav 10% natriumdodecylsulfat (SDS). 5 g SDS opløses i 50 mL vand. Opbevares ved stuetemperatur.
  7. Foretag elueringsbuffer. Bland 15 μL 1 M NaHCO3, 15 μl 10% SDS og 120 μl vand for at opnå 150 μl elueringsbuffer til én prøve.
    Bemærk: Forøg mængderne proportionalt afhængigt af antallet af prøver.
  8. Lav 3 M natriumacetat (pH 5,2) opløsning. 24,6 g natriumacetat, vandfri, opløses i vand. PH-værdien justeres til 5,2 med eddikesyre og udgør 100 mL. Filtrer gennem et 0,22 μm pore størrelses filter og opbevares ved stuetemperatur.

2. bestemmelse af vilkårene for multi-fordøjelse

Bemærk: I trin 2 af protokollen, et eksempel ved hjælp af VCaP, humane prostatacancer celler præsenteres. Enhver pattedyrscelle linjer kan anvendes; Se note på trinene.

  1. Fremstilling af tværbundet kromatin
    1. Vedligeholde VCaP-celler i DME-høj glukose suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) ved 37 °C i en carbondioxid inkubator. Seed VCaP celler ved 4 x 106 celler i seks 6 cm retter i 4 ml kultur medier og kultur i 3 dage.
      Bemærk: Brug passende kultur medier til hver cellelinje. Op til 10 x 106 celler kan seedede i en 6 cm eller 10 cm parabol. For suspenderede celler, frøceller i T25-kolber. Antallet af retter eller kolber afhænger af, hvor mange doser der testes for multi-fordøjelse. Hvis 4 doser testes, Forbered 6 retter eller kolber. Se også trin 2,2.
    2. Frigør VCaP-cellerne fra en skål ved hjælp af trypsin, og Tæl cellen. Beregn celle nummer i en skål. For suspenderede celler, fjerne en lille mængde af cellesuspension fra en kolbe og tælle celle nummer.
    3. Der tilsættes 0,229 mL 18,5% PFA til en 6 cm skål i 4 mL kultur medier i en slutkoncentration på 1%. Drej forsigtigt en skål eller kolbe for at fordele PFA jævnt. Inkuber ved stuetemperatur i præcis 10 minutter.
      Bemærk: I dette trin er kromatin og proteiner tværbundet. Da PFA er giftigt, skal du udføre dette trin i en kemisk røg hætte og bruge passende personlige værnemidler.
    4. Efter 10 min, tilsættes 0,47 mL 1,25 M Glycin opløsning i en endelig koncentration på 125 mM. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
      Bemærk: Glycin neutraliserer overskydende PFA at stoppe yderligere crosslinking.
    5. Aspirere formaldehyd/glycin/Culture Media. Cellerne vaskes ved at tilsætte 4 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) to gange. For suspenderede celler overføres cellesuspensionen til et 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirér supernatanten og tilsæt en medium volumen PBS og helt suspendere. Gentag dette trin. Bortskaf flydende affald korrekt, da det indeholder formaldehyd.
    6. Der forberedes PBS indeholdende proteasehæmmere og fosfatasehæmmer cocktail (PIC) ved tilsætning af 1/100 volumen 100x PIC til PBS. Aspirere PBS fra en skål og tilsæt 1 mL pr. skål af PBS, der indeholder PIC. Cellerne skrabes og overføres cellesuspensionen til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. For suspenderede celler skal du blot overføre suspensionen til et 1,5 mL rør.
    7. Centrifugerør ved 3.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at genvinde celle pellet. Fjern PBS helt ved hjælp af en pipette. Registrer celle nummeret pr. tube, og opbevar celle pellet ved-80 °C.
  2. Cellelyse og MNase fordøjelse
    Bemærk: Reagens volumenet i følgende trin er baseret på et rør, der indeholder 6 x 106 celler. Justere reagens volumen proportionalt afhængigt af celle nummer; Hvis en tube indeholder 2 x 106 celler, skal du bruge 100 μl chip cellelyse buffer (trin 2.2.1), mnase-fordøjelses buffer (trin 2.2.3) og spån fortyndingsbuffer (trin 2.2.5) og 10 ΜL 0,5 M EDTA (pH 8,0) (trin 2.2.4).
    1. Tø den lagrede celle pellet (VCaP celler, indeholdende 6 x 106 celler per tube) forberedt i trin 2.1.7 på is. Forbered ChIP cellelyse buffer suppleret med PIC ved at tilføje 1/100 volumen af 100x PIC til bufferen. Tilsæt 300 μL ChIP cellelyse buffer suppleret med PIC og resuspendere pellet grundigt. Vortex røret i 15 s og Inkuber suspensionen på is i 10 minutter.
    2. Centrifugeres ved 9.000 x g i 3 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes helt. Resuspension af pellet i 300 μL af MNase fordøjelses buffer.
    3. Fortyndet MNase (2.000 gel enhed/μL) med MNase-fordøjelses buffer til at give 50 gel enheder/μL. Tilsæt 0, 0,5, 1, 2, 4 μL af 50 gel enheder/μL MNase til suspensionen og Inkuber ved 37 °C i præcis 10 min, blanding ved inversion hver 2,5 min.
      Bemærk: tabel 1 viser optimale mængder af mnase i flere cellelinjer.
    4. Tilsæt 30 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) for at afbryde opblanding af MNase og vortex kortvarigt. Inkuber i 5 min på is. Centrifugeres ved 9.000 x g i 5 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes helt.
    5. Forbered ChIP fortyndingsbuffer suppleret med PIC ved at tilføje 1/100 volumen af 100x PIC til bufferen. Opslæmmer pellet i 300 μL ChIP fortyndingsbuffer suppleret med PIC.
    6. Sonicate suspensionen på is ved hjælp af en sonicator udstyret med en mikrotip sonde. Brug følgende sonikering betingelser: amplitude 2, forarbejdet tid 15 s, puls på 5 s, Pulse OFF 30 s. Tag 1 μL af suspensionen og spot på et dias glas og observere dem ved hjælp af et mikroskop. Sørg for, at cellestrukturen er næsten brudt.
      Bemærk: Figur 1a viser repræsentative mikrofotografier af VCAP-cellesuspensionen før og efter sonikering. Dette trin er for at frigive fordøjet kromatin i supernatanten ved at bryde Atom membraner. En strømindstilling skal justeres til mindre end 5% af maksimal effekt og prøv sonikering for 5 s tre gange med mere end et 30 s interval. Hvis watt Control er tilgængelig, skal du justere strømindstillingen til 5 W og behandle prøverne for total 15 s som nævnt ovenfor for at give total effekt på 70-75 J. Kontroller, om cellestrukturen er brudt som nævnt ovenfor. Hvis ikke nok, Gentag en gang til. Betingelsen beskrevet ovenfor er praktisk anvendt på alle cellelinjer testet.
    7. Centrifugeres ved 9.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifuge glas, og spar 20 μl af den Ford øjede kromatin i trin 2,3. Resten opbevares ved-80 °C.
  3. Omvendt crosslinking, rensning af DNA og analyse af fordøjet kromatin
    1. Der tilsættes 75 μL vand, 4 μL 5 M NaCl og 1 μL proteinase K til et 1,5 mL skrue rør. Der tilsættes 20 μL fordøjet kromatin fra forskellige MNase-fordøjelses betingelser, som er fremstillet i trin 2.2.7 til rør indeholdende vand, NaCl og proteinase K. Luk hætten stramt, bland helt, og Inkubér røret ved 65 °C natten over.
      Bemærk: Dette trin er til fjernelse af binding mellem protein og DNA.
    2. Forbered to 1,5 mL mikrocentrifuge glas pr. tilstand. Tilsæt 100 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1) (PCI) til et 1,5 mL rør. Tilsæt 10 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2 μL glykogen til et andet rør.
      Bemærk: Anvendelse af chloroform: isoamylalkohol er ikke nødvendig7. Stigende volumen kan resultere i lav DNA opsving efter ethanol nedbør8.
    3. Centrifuger røret, der indeholder fordøjet kromatin fra trin 2.3.1, kortvarigt, og tilsæt 100 μL PCI. Luk hætten stramt, og vortex kraftigt til dannelse af emulsion. Centrifuger røret ved maksimal hastighed (f. eks. 20.000 x g) i 30 s ved stuetemperatur.
    4. Tag forsigtigt den øvre fase, der indeholder DNA, og tilsæt til det rør, der indeholder PCI, tilberedt i trin 2.3.2. Vortex kraftigt og centrifugeres røret som trin 2.3.3.
      Bemærk: Hvis den nedre fase er forurenet, centrifugeres røret igen, eller det meste af den nederste fase først fjernes, centrifugeres røret og tages i den øvre fase.
    5. Tag forsigtigt den øvre fase som beskrevet i trin 2.3.4 og tilsæt til røret indeholdende natriumacetat og glykogen fremstillet i trin 2.3.2. Tilsæt 250 μL ethanol. Bland efter inversion og Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifugeglasset centrifugeres ved maksimal hastighed (f. eks. 20.000 x g) i 30 minutter ved 4 °c.
      Bemærk: Inkubation af opløsningen ved stuetemperatur påvirker ikke DNA-genvinding8,9.
    6. Bekræft pellets på bunden af røret. Fjern forsigtigt supernatanten for ikke at forstyrre pellet og tilsæt 500 μL 70% ethanol. Centrifugeglasset centrifugeres ved maksimal hastighed (f. eks. 20.000 x g) i 5 minutter ved 4 °c.
    7. Fjern supernatanten helt og tør pellet i ca. 5 minutter ved stuetemperatur. Pellet opløses i 20 μL 10 mM Tris · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et UV-Spektrofotometer.
    8. Bland 0,5 μg DNA med en gel-indlæsnings farve og Påfør 2% agantet gel. Elektrophorese prøverne på 100 V i Tris-acetat-EDTA buffer indtil lilla farvestof migreret til to-tredjedel af gelen og plette en gel med 0,5 μg/mL ethidium bromid i 10 min. Tag et billede af gelen.
      Bemærk: Se figur 2 for detaljer.

3. Kromatinimmunopræcipitation

  1. Klargøring af fordøjet kromatin
    1. Forbered dem. For vedsiddende celler, frø 2-10 x 106 celler pr. skål i 2 retter (6 cm eller 10 cm) pr. behandlingsgruppe og tillader cellerne at fastgøre til bunden af retterne i mere end 1 dag. For suspenderede celler, frø i 2 T25 kolber pr. behandlingsgruppe. Behandl cellerne som ønsket.
    2. Tag en skål eller kolbe fra hver gruppe og Tæl celle nummer som beskrevet i trin 2.1.2. Forbered tværbundet kromatin som nævnt i trin 2.1.3-2.1.7.
    3. Celle pellet og MNase fordøjelse som beskrevet i trin 2.2.1-2.2.7. Brug den optimale mængde MNase til at fordøje kromatin som bestemt i trin 2. Opbevar fordøjet kromatin ved-80 °C.
    4. Omvendt link 20 μl fordøjet kromatin og rense DNA som beskrevet i trin 2.3.8. Mål DNA-koncentrationen som beskrevet i trin 2.3.7. Elektrophorese prøverne i 2% agopstået gel til at kontrollere størrelsen af fordøjet kromatin som nævnt i trin 2,3.
      Bemærk: DNA-koncentrationen er identisk med den, der findes i den lagrede, fordøjet kromatin, som er fremstillet i trin 3.1.3.
    5. En omvendt tvær kædet, fordøjet kromatin prøve fra trin 3.1.4 fortyndes til 10 ng/μL med vand og fortyndes serielt for at lave koncentrationer på 1, 0,1 og 0,01 ng/μL. opbevares ved-20 °C.
      Bemærk: Disse prøver bruges til real-time PCR standarder.
  2. Chromatinimmunpræcipitation
    Bemærk: i trin 3.2-3.5 af protokollen bestemmes anti-trimethyleret Histon H3 lysin 4 (H3K4me3) belægning i VCAP celler. Se også figur 3.
    1. Tø fordøjet kromatin fra trin 3.1.3. Opbevar alle prøver på is.
    2. Forbered ChIP fortyndingsbuffer suppleret med PIC ved at tilføje 1/100 volumen af 100x PIC til bufferen. Fortyndet, fordøjet kromatin til 5 μg/500 μL med spån fortyndingsbuffer suppleret med PIC. Forbered 1.000 μL plus ekstra for (1) IP med nonimmune IgG (Control IgG), (2) IP med H3K4me3.
    3. Der tilsættes 5 μL 5 μg/500 μL fordøjet kromatin til et 1,5 mL skrue rør som en indgangs prøve (1% af en IP). Prøven opbevares ved-80 °C.
    4. Der tilsættes 500 μL hver 5 μg/500 μL fordøjet kromatin til et 1,5 mL skrue rør som en IP-prøve. Tilsæt 2 μg antistof til røret. Luk hætten og Inkuber røret ved 4 °C natten over med blid blanding ved hjælp af en gynge platform.
      Bemærk: Selv om det optimale antistof beløb skal bestemmes empirisk, anbefales 2 μg pr. IP først.
    5. Tilsæt 30 μL ChIP-grade protein G magnetiske perler pr. IP. Inkuber røret ved 4 °C i 2 timer med blid blanding ved hjælp af en gynge platform.
      Bemærk: Forvask af magnetiske perler er ikke nødvendig.
  3. Vask immunkompleks og vende binding
    1. Drej røret ned fra trin 3.2.5 kortvarigt. Anbring røret i en polyethylen-rack, der indeholder neodinium-magneter i 1 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration.
    2. Tilsæt 0,5 mL pr. rør med lavt salt immunkompleks vaskebuffer. Disperse perlerne ved forsigtigt at tappe eller kort vortexning røret. Inkuber røret ved 4 °C i 5 minutter med blid blanding ved hjælp af en gynge platform. Gentag trin 3.3.1 efter 5 min.
    3. Tilsæt 0,5 mL høj salt immunkompleks vaskebuffer pr. tube. Disperse og vask perlerne som trin 3.3.2. Efter vask gentages trin 3.3.1.
    4. Tilsæt 0,5 mL LiCl immunkompleks vaskebuffer pr. tube. Disperse og vask perlerne som trin 3.3.2. Efter vask gentages trin 3.3.1.
    5. Anbring røret i et magnetisk rack i 1 min. Fjern den resterende supernatanten helt.
    6. Tilsæt 150 μL elueringsbuffer til røret. Vortex røret for at sprede perlerne helt. Luk hætten og Inkuber røret ved 65 °C i 30 min, blanding ved inversion eller vortexning hver 5 min for at sprede perlerne grundigt.
    7. Under inkubationen forberedes et 1,5 mL skrue rør, og der tilsættes 6 μL 5 M NaCl og 2 μL proteinase K. tø 1% indgangs prøve fremstillet i trin 3.2.3. Tilsæt 150 μL elueringsbuffer, 6 μL 5 M NaCl og 2 μL proteinase K til 1% indgangs prøve.
    8. Efter inkubationen, drej røret ned. Røret placeres i et magnetisk rack i 1 min., og supernatanten overføres til det skrue rør, der indeholder NaCl, og proteinase K fremstillet i trin 3.3.7.
    9. Luk hætten og vortex alle IP og input prøver til at blande helt. Inkuber røret ved 65 °C natten over.
  4. DNA rensning
    1. Glasset forberedes som beskrevet i 2.3.2, og der tilsættes 150 μL PCI i stedet for 100 μL. I et andet rør tilsættes 12 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2 μL glykogen.
    2. Fjern røret fra inkubator. Drej røret ned, og tilsæt 150 μL PCI.
    3. Vortex kraftigt røret til dannelse af emulsion. Centrifugeglasset centrifugeres ved maksimal hastighed (f. eks. 20.000 x g) i 30 s ved stuetemperatur.
    4. Overfør forsigtigt 140 μL af den øvre fase til det rør, der indeholder PCI, tilberedt i trin 3.4.1. Gentag trin 3.4.3.
      Bemærk: Se også note i trin 2.3.4.
    5. Overfør forsigtigt 120 μL af den øvre fase til det rør, der indeholder natriumacetat og glykogen, som er fremstillet i trin 3.4.1.
      Bemærk: Se også note i trin 2.3.4.
    6. Tilsæt 300 μL ethanol. Bland efter inversion og Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    7. Centrifugeglasset centrifugeres ved maksimal hastighed (f. eks. 20.000 x g) i 30 minutter ved 4 °c. Du vasker pellet som beskrevet i trin 2.3.6.
    8. Efter tørring af pellet som beskrevet i trin 2.3.7 opløses pellet i 50 μL TE. Opbevares ved-20 °C.
  5. Påvisning af DNA-fragmenter ved hjælp af real-time PCR
    1. Tø følgende prøver: (1) IP med kontrol IgG, (2) IP med anti-H3K4me3, (3) 1% input sample. Tø også 4 doser af standarder tilberedt i trin 3.1.5 (i alt 7 prøver).
      Bemærk: Brug standarder fra samme gruppe til kvantificering af DNA-mængder i input-og IP-prøverne.
    2. Gør PCR arbejds løsning til 8 prøver. Bland 40 μL af 2x real-time PCR supermix, 8 μL hver af 4 μM fremadgående og omvendte primere, og 8 μL vand.
      Bemærk: En PCR-reaktionsblanding indeholder 5 μL 2x real-time PCR supermix, 1 μL hver af 4 μM fremadgående og omvendte primere og 1 μL vand. Primer-sekvenser er angivet i tabel 2.
    3. Aliquot 8 μL PCR-arbejdsopløsning til et godt af en PCR-plade. Tilsæt 2 μL prøver fra trin 3.4.8 eller standarder fra trin 3.1.5.
    4. PCR-pladen Forsegl og køres PCR med følgende betingelser: 1) 95 °C i 3 min for Initial denaturering, 2) 95 °C for 10 s til denaturering, 3) 56 °C for 30 s for annealing, 4) 72 °C for 30 s for udvidelse og dataindsamling , Gentag trin 2) til 4) for 55 cyklusser. Efter cykling måles en smelte kurve for PCR-produktet. Analysere dataene.
      Bemærk: Rå data for figur 3 er vist i tabel 3. Beregn start antal (SQ) af prøverne ved hjælp af en standardkurve. Multiplicer SQ i 1% input af 100 at justere en SQ af 1% input prøve til en IP for at give justeret SQ in input (EQ. 1). Dividerer SQ i IP-prøve ved justeret SQ i input for at give% inputværdi (procent inputmetode, EQ. 2). For at beregne fold berigelse, dividere SQ i IP med anti-H3K4me3 af SQ i IP med kontrol IgG (fold berigelse metode, EQ. 3).
      Justeret SQ in indgang = (SQ in 1% indgang) x 100 (1)
      Procent indgang af H3K4me3 = 100 x (SQ i IP med anti-H3K4me3)/(justeret SQ in indgang) (2)
      Fold berigelse af H3K4me3 = (SQ i IP med anti-H3K4me3)/(SQ i IP med kontrol IgG) (3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordøjende kromatin er et af de vigtige skridt for en ChIP assay. Vi brugte MNase til at fordøje kromatin at opnå en blanding af nukleosome oligomerer. I MNase fordøjelsestrinnet, kan MNase gå gennem den nukleare membran og fordøje kromatin. Men den fordøjet kromatin kan ikke gå gennem membranen og forbliver i kerner. For at frigive den fordøjet kromatin fra kerner, er der behov for kort sonikering. Figur 1a viser mikrofotografier før og efter sonikering af VCAP-cellesuspension. Uden sonikering forbliver cellestrukturen intakt, hvilket indikerer, at kromatin er til stede i kerner. En kort sonikering bryder cellestrukturen, og kontrol af cellerne i mikrofotografier hjælper med at bestemme de korte sonikering betingelser. Vi har også repræsenteret andre eksempler for kort sonikering i 293T celler (figur 1b) den humane B-celle akut lymfoblastær leukæmi cellelinje, Reh celler (figur 1c) og den menneskelige prostatacancer cellelinje, Lncap (figur 1d).

Figur 2a viser kromatin fragmentering efter behandling med forskellige mængder af mnase i VCAP-celler. Vi behandlede 6 x 106 tværbundet VCAP celle piller med 0, 50, 100, 200 gel enheder af mnase i 300 μl fordøjelses buffer i 10 min ved 37 °c. Efter rensning af den fordøjet kromatin blev 500 ng af DNA analyseret på 2% agopstået gel og plettet med ethidium bromid. Uden at tilføje mnase, et smøre mønster med en meget høj molekylvægt dukkede (Lane 1). Tilføjelsen af MNase gav en stige mønster (N; en mononukleosome enhed), der viser, at MNase fordøjer internucleosome (Lanes 2-5). Figur 2b viser et uhensigtsmæssigt fordøjelses mønster. Over fordøjelsen resulterede hovedsagelig i mononukleosom produktion (figur 2b, Lane 7). Vi bør finde de rette betingelser, der producerer kromatin fragmenter op til 900 BP (en til fem nukleosomer; f. eks. Lane 5).

For at kontrollere, om spån analysen udføres korrekt, er det vigtigt at have passende kontrol i analysen. For immunopræcipitation anvendes ikke-immun IgGs fra samme art som de pågældende antistoffer som en kontrol, der viser ikke-specifik binding til samme region (Se diskussion). Desuden anbefales det at måle bindingen af proteinerne (belægning) i både positive og negative regioner. Det er blevet almindeligt accepteret, at H3K4me3 belægning fordeles mellem ca. en kilo base (KB) opstrøms og nedstrøms for transskription start sites10,11. Vi målte H3K4me3 belægning i AR genomet, som spænder over ca. 20 kb opstrøms gennem 12 kb nedstrøms for ar-transskription start site (AR-TSS) i AR-positive VCaP-celler. Fordøjelses mønstret for kromatin i VCaP-celler, der anvendes i dette eksperiment, blev vist i figur 3a, hvilket indikerer korrekt fordøjelse af kromatin. Den højeste belægning af H3K4me3 blev observeret omkring AR-TSS og 0,5 KB og 1 kb opstrøms for AR-TSS (figur 3b). Så længe gener er transskriptivt aktive, kan TSSs være "positive regioner". Regioner beliggende på 19 KB og 8 KB upstream og 12 kb nedstrøms for AR-TSS, men havde lidt belægning på H3K4me3 (figur 3b), hvilket indikerer, at disse kan bruges som "negative regioner".

Det har vist sig, at en androgen øger RNA polymerase II belægning i PSA-promotoren og forstærker i lncap celler ved hjælp af klippet kromatin ved sonikering12,13. Vi testede derfor gyldigheden af vores protokol ved at måle aktiv RNA polymerase II belægning (fosforyleret RNA polymerase II på Serin 5; PolII (pS5)) i cellerne. Vi udførte det samme eksperiment for at kontrollere reproducerbarhed af vores metode. LNCaP celler blev dyrket i steroid-sultet medium for 3 dage og stimuleret med et køretøj eller 10 nM dihydrotestosteron (DHT) for 4 h. aktiv RNA polymerase II belægning blev målt ved immunopræcipitation med anti-PolII (pS5), efterfulgt af real-time PCR. Figur 4a viser et reproducerbart fordøjelses mønster af kromatin fra lncap-celler i tre uafhængige eksperimenter. Som vist i figur 4b, DHT signifikant øget polii (pS5) belægning i PSA-promotoren og forstærker, når du bruger procent inputmetode. Vi beregnede også belægningen ved hjælp af fold berigelse metode (figur 4c) og fandt, at ingen signifikant forskel i Polii (pS5) i PSA-promotoren blev observeret med eller uden DHT behandling. DHT påvirkede ikke belægningen i GAPDH-promotoren som tidligere offentliggjort14. Vigtigere, vores data var magen til den, der opnås fra sonikering-sheared kromatin prøver12,13.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative mikrofotografier af tværbundet celle pellets før og efter sonikering. Crosslinked VCaP (A), 293T (B), Reh (C) og lncap (D) celle pellets blev behandlet med mnase, og pellets blev resuspenderet i ChIP fortyndingsbuffer. Før og efter sonikering blev der taget billeder af suspensionerne. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativ agrose gel analyse af fordøjet kromatin. A) crosslinked kromatin blev fremstillet af VCAP-celler og fordøjet med forskellige mængder af mnase som beskrevet i trin 2,2. Fordøjet kromatin blev omvendt crosslinked, renset, og analyseret i en 2% agopstået gel. N en mononukleosome enhed. B) kromatin af VCAP-celler blev fordøjet med 250 gel-enheder af mnase pr. 2 x 106 celler ved 37 °c i 20 minutter og analyseret (som beskrevet i A). Større mængder af MNase og længere inkubationstider forårsagede næsten fuldstændig fordøjelse af kromatin til dannelse af mononukleosomer (150 BP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: H3K4me3 belægning i ar-genomet. Fordøjet kromatin blev fremstillet af VCaP-celler. (A) fordøjelsesmønsteret blev analyseret ved hjælp af en agrose gel. B) 5 μg fordøjet kromatin var immunopræcipiteret med 2 μg enten normal kanin-IgG eller anti-H3K4me3-antistoffer som nævnt i trin 3,1 og trin 3,2. Immunkomplekser blev vasket og elueret fra perler, og omvendt crosslinked. Rensede DNA-fragmenter blev analyseret ved hjælp af real-time PCR med primeren sæt opført i tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Androgen øget aktiv RNA polymerase II belægning i PSA-promotoren og forstærker. Steroid-sultede LNCaP celler blev behandlet med eller uden 10 nM DHT for 4 h, og fordøjet kromatin blev forberedt. A) nedbrydningsmønster af kromatin fra lncap-celler i tre uafhængige eksperimenter. (B,C) Den Ford øjede kromatin var immunopræcipiteret med anti-PolII (pS5) antistoffer, og DNA-fragmenter blev renset som beskrevet for figur 3. Belægningen af aktiv RNA-polymerase II i PSA-promotoren, Enhancer og GAPDH-promotoren som en procent indgang (B) og fold berigelse (C) blev bestemt ved hjælp af realtids PCR med primer-sættene anført i tabel 2. De viste resultater er gennemsnitlige ± SE af tre uafhængige eksperimenter. (*); p < 0,05, (* *); p < 0,01 versus 0 nM DHT behandling. NS ikke signifikant versus 0 nM DHT. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cellelinje gel-enheder pr. 2.000.000 celler i 100 μL buffer, 37 °C i 10 min.
LNCaP 267
Vcap 66,7
293T 450
REH 134
22Rv1 400

Tabel 1: Optimal mængde mikrococcal nuclease i forskellige cellelinjer. Værdien repræsenterer mængden af MNase pr. 2 x 106 celler i 100 μl buffer, 37 °c i 10 min.

Primer-navn Sekvens
AR (-18,8 KB) Fwd ATTTGGAACTGGGAACATCT
Rev CACCTTCTCTCCTCCACTCT
AR (-8.8 KB) Fwd TAACAGCTTTGCATCCAAGT
Rev TGAAATCTGGGACTAAAGCA
AR (-8.2 KB) Fwd CAGTGCTATTCCCTTGTGAC
Rev TTGGACTGGCTCTATCTTGA
AR-TSS (0 KB) Fwd GCAAACTGTTGCATTTGCTC
Rev GGCCCTTTTTCCCTCTGTC
AR (0,6 KB) Fwd CACGACCCGCCTGGTTAG
Rev TGAAGACCTGACTGCCTTTTC
AR (+ 1,0 KB) Fwd CCGCAAGTTTCCTTCTCTGG
Rev CTTCCCAGCCCTAACTGCAC
AR (+ 11.8 KB) Fwd CCTTGCTTGTGGAACTGTAG
Rev TTTATTGTCTGGTGCTAGGC
PSA-promotor Fwd CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA
Rev GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG
PSA forstærker Fwd GCCTGGATCTGAGAGAGATATCATC
Rev ACACCTTTTTTTTTCTGGATTGTTG
GAPDH Fwd TACTAGCGGTTTTACGGGCG
Rev TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA

Tabel 2: Parrede primer-sekvenser, der anvendes til spån analyse.

AR (-18,8 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 23,49 0,815 81,5 100
IP med kontrol IgG 27,68 0,051 0,051 0,062 1
IP med anti-H3K4me3 22,48 1,590 1,590 1,951 31,4
AR (-8.8 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 23,22 0,586 58,6 100
IP med kontrol IgG 26,81 0,052 0,052 0,088 1
IP med anti-H3K4me3 23,74 0,414 0,414 0,706 8,0
AR (-8.2 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 23,19 0,643 64,3 100
IP med kontrol IgG 26,99 0,048 0,048 0,075 1
IP med anti-H3K4me3 23,63 0,477 0,477 0,742 9,9
AR-TSS (0 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 25,06 0,657 65,7 100
IP med kontrol IgG 28,63 0,050 0,050 0,077 1
IP med anti-H3K4me3 20,70 15,064 15,064 22,944 299,8
AR (0,6 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 23,86 0,716 71,6 100
IP med kontrol IgG 26,67 0,106 0,106 0,147 1
IP med anti-H3K4me3 19,15 17,787 17,787 24,840 168,6
AR (+ 1,0 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 23,51 0,730 73,0 100
IP med kontrol IgG 25,94 0,125 0,125 0,171 1
IP med anti-H3K4me3 19,06 18,486 18,486 25,335 147,8
AR (+ 11.8 KB) Cq Sq Justeret til én IP- % Input Fold berigelse
1% indgang 24,54 0,876 87,6 100
IP med kontrol IgG 29,14 0,033 0,033 0,037 1
IP med anti-H3K4me3 24,47 0,918 0,918 1,048 27,97

Tabel 3: Rå data fra kvantitativ PCR-analyse for figur 3. CQ: tærskel cyklus nummer, SQ: Start mængde beregnet ved hjælp af en standardkurve, justeret til en IP: Multiplicer SQ i 1% input med 100 som 1% prøvevolumen af en IP bruges til PCR,% input: dividere SQ i IP stikprøve ved justeret SQ i input, fold berigelse : dividere SQ i IP med anti-H3K4me3 af SQ i IP med kontrol IgG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom sonikering almindeligvis anvendes til at opnå fragmenteret kromatin, er det tidskrævende og besværligt at identificere reproducerbare betingelser. I denne protokol, vi brugte MNase fordøjelsen fordi enzym fordøjelsen bør være lettere at identificere reproducerbare betingelser. En kort sonikering trin efter MNase fordøjelse (Se trin 2,2) var nødvendigt at bryde cellemembranen og frigive den fordøjet kromatin. Derfor bør sonikering magt i vores protokol være så lav som muligt. Vi bruger de samme sonikering betingelser for alle celler, vi har ansat (Se figur 1 og tabel 1) for at opnå fuldstændig nedbrydning af membranen.

Fordøjelsen af kromatin af mnase er et kritisk skridt i vores protokol, og derfor har vi udøvet stor indsats for at optimere betingelserne for fordøjelsen af kromatin inde i cellerne. Fordøjelses aktiviteten bestemmes af mængden af enzym og substrat (kromatin) og inkubationstiden. Da Ploidi varierer mellem forskellige celler, skal de optimale betingelser for multi-fordøjelsen desuden identificeres for hver celletype. Når de er etableret, kan de samme betingelser anvendes uanset celle behandlingerne. Vi tjekker altid kromatin fordøjelses mønstrene i hvert eksperiment for at sikre, at fordøjelses mønstrene er velegnede til spån analyser, som vist i figur 2a, Lane 5.

Nogle faktorer påvirker resultaterne af ChIP assays. Det er vigtigt at bruge den rigtige mængde af fordøjet kromatin i vores protokol. I mange protokoller, celle nummeret, men ikke mængden af kromatin for en IP er vist15,16. Disse eksperimentelle betingelser giver stor variation i mængden af kromatin blandt celler på grund af Ploidi forskelle. Vi bruger 5 μg kromatin og 2 μg antistof pr. IP i analysen, og derfor er vores protokol mere ligetil og klarere end andre protokoller, selv om det kan være nødvendigt med optimale mængder af antistof for IP. Udvælgelsen af antistoffer er også vigtig; Brug ChIP assay-validerede antistoffer.

Der er to metoder til at analysere ChIP PCR data: procent inputmetode og fold berigelse metode. I procent inputmetode, signaler fra IP-prøver er divideret med signaler fra den totale kromatin i IP-stikprøven. I fold berigelse metode, signaler fra IP med et specifikt antistof såsom H3K4me3 er divideret med signaler fra IP med kontrol IgG. Den senere metode er kun anvendelig, når signaler fra IP med kontrol-IgG er ens og reproducerbare ved flere mål eller identiske mål under de forskellige fysiologiske forhold. I praksis varierer signal niveauerne, så folde berignings værdien har en høj variabilitet som vist i figur 4c. Derfor anbefaler vi ikke at bruge fold berigelse metode til at repræsentere ChIP data i vores metode.

MNase favoriserer en euchromatin ' åben ' miljø og er ikke tilgængelig for en heterokromatin struktur, tyder på, at MNase fordøjelsen kan producere nogle bias. Det er blevet rapporteret, at berigelse af Lamin A-interagerende kromatin domæner er forskellige i mellem sonikering-sheared og MNase-fordøjet kromatin præparater17. Således, MNase fordøjelsen i ChIP assay kan ikke være egnet til at analysere nukleare struktur-associerede molekyler såsom Lamin A/C og særlige ved-rige sekvens binding protein 1 (SATB1).

I spån analyseprotokoller, der er konstrueret til downstream-mikroarray (ChIP-on-chip) eller sekvensering (ChIP-SEQ)-analyser, anvendes RNase under DNA-rensnings trinnet, dog ikke i protokoller designet til PCR-analyser18. Vi har ikke testet, om vores protokol er kompatibel med ChIP-on-chip og ChIP-SEQ-analyser, men vi antager, at vores protokol gælder, når prøverne behandles med RNase. Hvis det er nødvendigt at behandle RNase, skal der anvendes 2 μL 10 mg/mL DNase-fri RNase A i stedet for proteinase K i trin 3,3 og inkubatorer ved 65 °C natten over. Før rensning af DNA (trin 3,4) tilsættes proteinase K og inkubatorer i yderligere 1 t ved 60 °C.

Vi rutinemæssigt udføre ChIP assays med modificeret Histon og transkriptionsfaktorer ved hjælp af den beskrevne metode og har vist, at kromatin remodeling faktor, AT-rige interaktion domæne 5B, regulerer AR genekspression ved at ændre belægning af PolII ( pS5) og H3K4me3 i AR-initiativtageren19. Vi mener, at vores protokol er teknisk lettere end andre ChIP assays og er almindeligt acceptabel i molekylær biologi forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning er støttet af Genentech royalties til City of Hope. Dette arbejde støttes ikke helt eller delvist af de nationale institutter for sundhed.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2x iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Tags

Genetik genregulering Histon modifikation kromatin immunopatcipitation micrococcal nuclease RNA polymerase II trimethyleret Histon H3 lysin 4
Kromatin Immunoprecipitation assay ved hjælp af Mikrococcal-nukleaser i pattedyrsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin… More

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter