Summary
الكروماتين المناعية الترسيب (ChIP) هو أداة قوية لفهم الآليات الجزيئية لتنظيم الجينات. ومع ذلك، فإن الطريقة تنطوي على صعوبات في الحصول على تجزئة الكروماتين القابلة للاستنساخ عن طريق القص الميكانيكي. هنا، نحن نقدم بروتوكول محسن ة لـ ChIP باستخدام الهضم الأنزيمي.
Abstract
للتعبير عن الأنماط الظاهرية الخلوية في الكائنات الحية، تقوم الخلايا الحية بتنفيذ التعبير الجيني وفقا لذلك، وتلعب البرامج النسخية دورا ً محورياً في التعبير الجيني. وتنسق الآلات الخلوية النسخية وبروتينات تعديل الكروماتين لتنظيم النسخ. لتحليل التنظيم النسخي على المستوى الجزيئي، تتوفر العديد من الطرق التجريبية مثل تحول التنقل الكهربائي، ومراسل عابر واختبارات الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP). نحن نصف فحص ChIP المعدلة بالتفصيل في هذه المقالة بسبب مزاياه في إظهار مباشرة تعديلات الهيستون والتفاعلات بين البروتينات والحمض النووي في الخلايا. واحدة من الخطوات الرئيسية في اختبار ChIP ناجحة هو القص الكروماتين. على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة لقص الكروماتين، فمن الصعب تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. بدلا من القص الكروماتين عن طريق سونيكيشن، استخدمنا الهضم الأنزيمي مع نوكليسال ميكروكوكال (MNase) للحصول على نتائج أكثر استنساخا. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول CHIP مباشرة باستخدام MNase.
Introduction
يتم تنظيم التعبير الجيني في خلايا الثدييات بشكل محكم وديناميكي، والنسخ هو واحد من الخطوات الرئيسية. يتم تنظيم النسخ الجيني بشكل رئيسي من قبل عوامل النسخ والنغمات. عامل النسخ هو البروتين الذي يربط تسلسل اتّساط الحمض النووي المحدد ويتحكم في نسخ الجينات. هذه العوامل إما تعزيز أو تثبيط تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (PolII)، الذي يبدأ توليف الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الجيني كقالب1. تعديلات الهيستون مثل الأسيتيل ومثيلة مخلفات ذيل الهيستون تؤثر بشكل إيجابي وسلبي على نسخ الجينات عن طريق تغيير هيكل الكروماتين2. وبما أن التعديلات في التعبير الجيني تؤثر على السياق الخلوي، فمن الضروري فحص الآليات الجزيئية التي يتم من خلالها تنظيم النسخ.
وحتى الآن، تتوفر عدة طرق للتحقيق في تنظيم النسخ الجيني. يتم استخدام فحص التحول التنقل الكهربائي (EMSA)، ويسمى أيضا اختبار التحول هلام، لتحليل التفاعل بين البروتين والحمض النووي3. يتم احتضان استخراج نووي من الخلايا ذات الأهمية مع نظير مشع (على سبيل المثال، 32P) المسمى الحمض النووي التحقيق والكهربائي على هلام polyacrylamide. يظهر الرسم البياني التلقائي أن مجمع بروتين الحمض النووي يهاجر أبطأ من المسبار في هلام. في وجود جسم مضاد ضد البروتين، يهاجر مركب الحمض النووي البروتيني والأجسام المضادة في هلام ببطء أكثر من مجمع بروتين الحمض النووي. هذه الفرقة supershifted يكشف عن ربط محددة بين الحمض النووي والبروتين. ومع ذلك، EMSA يحدد فقط تفاعل الحمض النووي البروتين محددة في نظام خال من الخلايا، وبالتالي فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان التفاعل يتحكم في النسخ في الخلايا الحية. تم تطوير اختبار المراسل العابر، الذي يُطلق عليه عادة ً اختبار مراسل لوسيفيراز، لمعالجة تنظيم التعبير الجيني في الخلايا. عادة، يتم إدخال منطقة جينية في المنبع من جين ذات أهمية في بلازميد مراسل، يتم نقلها بشكل عابر إلى الخلايا، ويتم قياس نشاط المراسل. مجموعة متنوعة من المسوخ الحذف يسمح بتحديد المناطق المسؤولة عن تنظيم الجينات. على الرغم من أن اختبار مراسل هو أداة مفيدة لتحديد عوامل النسخ وتسلسل الحمض النووي ملزمة السيطرة على النسخ، وهذا الأسلوب لديه عيب كبير في أن بلازميد مراسل خال من بنية الكروماتين ولا يعكس "حقيقي" آلات النسخ. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تحديد التغييرات في تعديلات الهستون من قبل النظام.
ويستند تطوير طريقة الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP) على تقارير جاكسون وتشاكلي أن "خلية كاملة" التثبيت مع الفورمالديهايد الحفاظ على هيكل الكروماتين4،5. ومنذ ذلك الحين، تم تطوير وتحسين العديد من التقنيات ذات الصلة6. في اختبارات ChIP، يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد لعبور ربط الحمض النووي والبروتينات. الكروماتين مجزأة ومن ثم مناعية مع الأجسام المضادة للاهتمام. يتم غسل المجمع المناعي، ويتم تنقية الحمض النووي. ويكشف تضخيم PCR مع المواد التمهيدية الموجهة إلى منطقة معينة من الجينوم عن شغل البروتينات ذات الأهمية في الجينوم.
على الرغم من أن ChIP هو أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتينات مثل عوامل النسخ وتعديل النغمات مع الحمض النووي، فإن الطريقة تنطوي على بعض الصعوبات، مثل خطوة تجزئة الكروماتين، في الممارسة العملية. وقد استخدمت سونيكيشن على نطاق واسع لقص الكروماتين. ومع ذلك، فمن المرهق تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. علاج النوكليس ميكروكوكال (MNase) هو طريقة بديلة لقص الكروماتين. MNase هو بطانة exonuclease أن يهضم مزدوجة تقطعت بهم السبل، واحدة تقطعت بهم السبل، والحمض النووي الدائري والخطي والحمض النووي الريبي. فمن السهل نسبيا لتحديد الظروف، بما في ذلك كميات الكروماتين والانزيم، ودرجة الحرارة، ووقت الحضانة، لتجزئة الكروماتين الأمثل. قمنا بتعديل وتبسيط البروتوكولات القائمة، وأنشأنا طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ. توفر هذه الورقة بروتوكولًا لـ ChIP باستخدام MNase في خلايا الثدييات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- جعل 18.5٪ بارافورمالدهايد (PFA) الحل. إضافة 0.925 غرام من PFA، 4.8 مل من الماء (استخدام المياه فائقة النقاء في جميع أنحاء البروتوكول) و 35 درجة مئوية من 1 M KOH في أنبوب بلاستيكي مخروطي 50 مل. أغلق الغطاء بإحكام وسخن الأنبوب في كوب زجاجي سعة 400-600 مل يحتوي على حوالي 200 مل من الماء باستخدام الميكروويف. إزالة الأنبوب قبل أن يبدأ الماء الغليان ودوامة الأنبوب لإذابة PFA. السماح PFA لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: كرر التدفئة والخلط حتى يذوب PFA تماما. إعداد حل PFA مباشرة قبل الربط (الخطوة 2.1.3). - جعل 1.25 M الجلايسين الحل. حل 14.07 غرام من الجلايسين في 150 مل من الماء وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر حجم المسام. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- جعل ChIP خلية lysis المخزن المؤقت. حل 378 ملغ من الأنابيب، 10.6 مل من 2 مل كيلو كل، و 1.25 غرام من بولي أوكتيلفينوكسي المتفرعة (إيثيلينأوكسي) الإيثانول في الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع 1 M KOH في 4 درجة مئوية وجعل ما يصل إلى 250 مل. قم بالتصفية من خلال فلتر بحجم المسام بمقدار 0.22 م والمخزن عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- جعل النوكليس ميكروكوكال (MNase) التخزين المؤقت الهضم. لجعل 1 مل، مزيج 0.1 مل من 10X MNase التخزين المؤقت الهضم، 10 درجة مئوية من 100X BSA الحل، 10 ميكرولتر من 0.1 M dithiothreitol و 0.88 مل من الماء.
- جعل 1 M NaHCO3. إذابة 4.2 غرام من NaHCO3 في 50 مل من الماء وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر حجم المسام. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- جعل 10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS). حل 5 غرام من SDS في 50 مل من الماء. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- جعل الإنيلوتيون العازلة. مزيج 15 ميكرولتر من 1M NaHCO 3، 15 ميكرولتر من 10٪ SDS، و 120 ميكرولتر من الماء للحصول على 150 ميكرولتر من العازلة elution لعينة واحدة.
ملاحظة: زيادة وحدات التخزين بشكل متناسب اعتمادا على عدد العينات. - جعل 3 M خلات الصوديوم (الحموضة 5.2) الحل. حل 24.6 غرام من خلات الصوديوم اللامائية في الماء. ضبط الحموضة إلى 5.2 مع حمض الخليك ويشكلون 100 مل. قم بتصفية من خلال فلتر بحجم المسام بسعة 0.22 متر والمخزن في درجة حرارة الغرفة.
2. تحديد ظروف الهضم MNase
ملاحظة: في الخطوة 2 من البروتوكول، يتم تقديم مثال باستخدام VCaP، خلايا سرطان البروستاتا البشرية. ويمكن استخدام أي خطوط خلايا ثديية؛ راجع ملاحظة في الخطوات.
- إعداد الكروماتين عبر مرتبط
- الحفاظ على خلايا VCaP في الجلوكوز DME عالية تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. خلايا VCaP البذور في 4 × 106 خلايا في ستة أطباق 6 سم في 4 مل من وسائل الإعلام والثقافة الثقافية لمدة 3 أيام.
ملاحظة: استخدم وسائط الثقافة المناسبة لكل سطر خلية. يمكن بذر ما يصل إلى 10 × 106 خلايا في طبق 6 سم أو 10 سم. للخلايا المعلقة، خلايا البذور في قوارير T25. عدد الأطباق أو قوارير يعتمد على عدد الجرعات التي يتم اختبارها لهضم MNase. إذا تم اختبار 4 جرعات، إعداد 6 أطباق أو قوارير. انظر أيضاً الخطوة 2-2. - فصل خلايا VCaP من طبق واحد باستخدام التربسين وعد الخلية. حساب رقم الخلية في طبق واحد. بالنسبة للخلايا المعلقة، قم بإزالة كمية صغيرة من تعليق الخلايا من قارورة واحدة ورقم خلية العد.
- إضافة 0.229 مل من 18.5٪ PFA إلى طبق 6 سم في 4 مل من وسائل الإعلام الثقافة في تركيز نهائي من 1٪. بلطف ولكن بدقة دوامة طبق أو قارورة لتوزيع PFA بالتساوي. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بالضبط.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم ربط الكروماتين والبروتينات. كما PFA سامة، وتنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائية واستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. - بعد 10 دقائق، إضافة 0.47 مل من 1.25 M محلول الجلايسين في تركيز نهائي من 125 mM. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: الجلايسين تحييد PFA الزائدة لوقف مزيد من الربط. - أسكات الفورمالديهايد / غليسين / وسائل الإعلام الثقافة. غسل الخلايا عن طريق إضافة 4 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) مرتين. بالنسبة للخلايا المعلقة، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بمعدل 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant وإضافة حجم واحد متوسط من PBS وتعليق تماما. كرر هذه الخطوة. التخلص من النفايات السائلة بشكل صحيح لأنها تحتوي على الفورمالديهايد.
- إعداد PBS التي تحتوي على البروتياز وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز (PIC) عن طريق إضافة حجم 1/100 من 100X الموافقة المسبقة عن علم إلى PBS. يستنشق PBS من طبق وإضافة 1 مل لكل طبق من PBS التي تحتوي على الموافقة المسبقة عن علم. كشط الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. بالنسبة للخلايا المعلقة، ما عليك سوى نقل التعليق إلى أنبوب 1.5 مل.
- أنابيب الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لاستعادة بيليه الخلية. إزالة PBS تماما باستخدام ماصة. تسجيل رقم الخلية لكل أنبوب وتخزين بيليه الخلية في -80 درجة مئوية.
- الحفاظ على خلايا VCaP في الجلوكوز DME عالية تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. خلايا VCaP البذور في 4 × 106 خلايا في ستة أطباق 6 سم في 4 مل من وسائل الإعلام والثقافة الثقافية لمدة 3 أيام.
- اللبة الخلوية وهضم MNase
ملاحظة: وحدة تخزين الكاشف في الخطوات التالية تستند إلى أنبوب واحد يحتوي على 6 × 106 خلايا. ضبط حجم الكاشف بشكل متناسب اعتمادا على رقم الخلية؛ عندما يحتوي أنبوب واحد على 2 × 106 خلايا، استخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لخلايا ChIP (الخطوة 2.2.1)، المخزن المؤقت للهضم MNase (الخطوة 2.2.3)، والمخزن المؤقت لتخفيف ChIP (الخطوة 2.2.5)، و10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (pH 8.0) (الخطوة 2.2.4).- إذابة بيليه الخلية المخزنة (خلايا VCaP، التي تحتوي على 6 × 106 خلايا لكل أنبوب) أعدت في الخطوة 2.1.7 على الجليد. إعداد ChIP خلية lysis المخزن المؤقت المكمل مع الموافقة المسبقة عن علم بإضافة 1/100 وحدة تخزين 100x PIC إلى المخزن المؤقت. إضافة 300 درجة مئوية من ChIP خلية lysis العازلة تستكمل مع الموافقة المسبقة عن علم وإعادة تعليق بيليه تماما. دوامة أنبوب ل 15 s واحتضان التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي في 9000 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant تماما. إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من MNase التخزين المؤقت الهضم.
- تمييع MNase (2000 وحدة هلام / ميكرولتر) مع MNase التخزين المؤقت الهضم لإعطاء 50 وحدة هلام / ميكرول إضافة 0، 0.5، 1، 2، 4 ميكرولتر من 50 وحدة هلام / ميكرول من MNase إلى تعليق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة بالضبط، وخلط عن طريق الانعكاس كل 2.5 دقيقة.
ملاحظة: يعرض الجدول 1 الكميات المثلى من MNase في عدة خطوط خلوية. - إضافة 30 درجة مئوية من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0) لإنهاء الهضم MNase ودوامة لفترة وجيزة. الحضانة لمدة 5 دقائق على الجليد. الطرد المركزي في 9000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant تماما.
- إعداد المخزن المؤقت لتخفيف ChIP المكمل بالموافقة المسبقة عن علم بإضافة حجم 1/100 من 100x PIC إلى المخزن المؤقت. إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من المخزن المؤقت تخفيف ChIP تستكمل مع الموافقة المسبقة عن علم.
- سونيكات التعليق على الجليد باستخدام sonicator مجهزة التحقيق microtip. استخدام شروط sonication التالية: السعة 2، معالجة الوقت 15 ثانية، نبض على 5 ثانية، نبض قبالة 30 ثانية. خذ 1 ميكرولتر من التعليق وبقعة على زجاج الشريحة ومراقبة لهم باستخدام المجهر. تأكد من أن بنية الخلية مكسورة تقريبا.
ملاحظة: يظهر الشكل 1A الصور الدقيقة التمثيلية لتعليق خلية VCaP قبل وبعد sonication. هذه الخطوة هي لإطلاق الكروماتين المهضوم في supernatant عن طريق كسر الأغشية النووية. يجب ضبط إعداد الطاقة إلى أقل من 5٪ من الطاقة القصوى ومحاولة sonication لمدة 5 ثوان ثلاث مرات مع أكثر من فاصل زمني 30 ق. إذا كان التحكم بالوتد متاحًا، قم بضبط إعداد الطاقة إلى 5 واط وعالج العينات لإجمالي 15 ق كما ذكر أعلاه لإعطاء الطاقة الإجمالية من 70-75 J. تحقق ما إذا كان هيكل الخلية مكسورة كما ذكر أعلاه. إذا لم يكن كافيا، كرر مرة أخرى. يتم تطبيق الشرط الموضح أعلاه عملياً على جميع خطوط الخلايا التي تم اختبارها. - الطرد المركزي في 9000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية، ونقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة، وحفظ 20 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم للخطوة 2.3. تخزين الباقي في -80 درجة مئوية.
- عكس الربط المتبادل، وتنقية الحمض النووي، وتحليل الكروماتين المهضوم
- إضافة 75 ميكرولتر من الماء، 4 ميكرولتر من 5 M NaCl، و 1 ميكرولتر من بروتيناز K إلى أنبوب المسمار 1.5 مل. إضافة 20 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم من مختلف ظروف الهضم MNase أعدت في الخطوة 2.2.7 إلى أنابيب تحتوي على الماء، NaCl، وproteinase K. إغلاق الغطاء بإحكام، ومزيج تماما، واحتضان الأنبوب في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: هذه الخطوة هي لإزالة الربط بين البروتين والحمض النووي. - إعداد اثنين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل لكل شرط. إضافة 100 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: إيزواميللالكحول (25:24:1) (PCI) إلى أنبوب واحد 1.5 مل. إضافة 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2 ميكرولتر من الجليكوجين إلى أنبوب آخر.
ملاحظة: استخدام الكلوروفورم: isoamylalcohol ليس من الضروري7. زيادة حجم قد يؤدي إلى انخفاض استعادة الحمض النووي بعد هطول الأمطار الإيثانول8. - طرد مركزي الأنبوب الذي يحتوي على الكروماتين المهضوم من الخطوة 2.3.1 لفترة وجيزة وإضافة 100 ميكرولتر من PCI. أغلق الغطاء بإحكام، ودوامة بقوة لتشكيل مستحلب. طرد مركزي الأنبوب في أقصى سرعة (على سبيل المثال، 20،000 × ز) لمدة 30 ق في درجة حرارة الغرفة.
- خذ بعناية المرحلة العليا التي تحتوي على الحمض النووي وإضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي على PCI أعدت في الخطوة 2.3.2. دوامة بقوة والطرد المركزي الأنبوب كخطوة 2.3.3.
ملاحظة: إذا كانت المرحلة السفلى ملوثة، الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى، أو إزالة معظم المرحلة السفلى أولا، الطرد المركزي الأنبوب، واتخاذ المرحلة العليا. - تأخذ بعناية المرحلة العليا كما هو موضح في الخطوة 2.3.4 وإضافة إلى أنبوب يحتوي على خلات الصوديوم والجليكوجين أعدت في الخطوة 2.3.2. إضافة 250 درجة مئوية من الإيثانول. مزيج من انعكاس واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. طرد مركزي الأنبوب بأقصى سرعة (على سبيل المثال، 20000 × ز) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: حضانة الحل في درجة حرارة الغرفة لا يؤثر على استعادة الحمض النووي8،9. - تأكيد الكريات على الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية supernatant حتى لا يزعج بيليه وإضافة 500 درجة مئوية من الإيثانول 70٪. طرد مركزي الأنبوب بأقصى سرعة (على سبيل المثال، 20000 × ز) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- إزالة supernatant تماما وتجفيف بيليه لمدة 5 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة. حل بيليه في 20 درجة مئوية من 10 MM تريس · HCl/1 m EDTA (رقم الهيدروجيني 8.0) (TE). قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
- اخلط 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي مع صبغة تحميل هلامي وطبق على جل أغاروز 2%. الكهربائي العينات في 100 V في تريس خلات إدتا العازلة حتى الصبغ الأرجواني هاجر إلى ثلثي هلام ووصمة عار هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم لمدة 10 دقيقة. التقاط صورة للهلام.
ملاحظة: انظر الشكل 2 للاطلاع على التفاصيل.
- إضافة 75 ميكرولتر من الماء، 4 ميكرولتر من 5 M NaCl، و 1 ميكرولتر من بروتيناز K إلى أنبوب المسمار 1.5 مل. إضافة 20 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم من مختلف ظروف الهضم MNase أعدت في الخطوة 2.2.7 إلى أنابيب تحتوي على الماء، NaCl، وproteinase K. إغلاق الغطاء بإحكام، ومزيج تماما، واحتضان الأنبوب في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3. الكروماتينالمناعيه
- إعداد الكروماتين المهضوم
- جهزوا الخلايا بالنسبة للخلايا الملتصقة، قم بزرع 2-10 × 106 خلايا لكل طبق في طبقين (6 سم أو 10 سم) لكل مجموعة علاج والسماح للخلايا بإرفاق الجزء السفلي من الأطباق لأكثر من يوم واحد. للخلايا المعلقة، والبذور في 2 T25 قوارير لكل مجموعة العلاج. علاج الخلايا على النحو المطلوب.
- خذ طبق واحد أو قارورة من كل مجموعة وعد رقم الخلية كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. إعداد الكروماتين عبر المرتبطة كما هو مذكور في الخطوات 2.1.3-2.1.7.
- Lyse بيليه الخلية والهضم MNase كما هو موضح في الخطوات 2.2.1-2.2.7. استخدم الكمية المثلى من MNase لهضم الكروماتين كما هو محدد في الخطوة 2. تخزين الكروماتين المهضوم عند -80 درجة مئوية.
- عكس crosslink 20 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم وتنقية الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2.3.8. قياس تركيز الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2-3-7. الكهربائي العينات في هلام أجاروز 2٪ للتحقق من حجم الكروماتين المهضوم كما هو مذكور في الخطوة 2.3.
ملاحظة: ويتطابق تركيز الحمض النووي مع تركيز الكروماتين المهضوم المخزن المعد المعد في الخطوة 3-1-3. - تخفيف عينة كروماتين مهضومة عكسية عبر مرتبطة من الخطوة 3-1-4 لإعطاء 10 نانوغرام/ميكرولتر بالماء ومخففة تسلسلياً لجعل تركيزات 1 و0.1 و0.01 نانوغرام/ميكرولتر.
ملاحظة: وتستخدم هذه العينات لمعايير PCR في الوقت الحقيقي.
- الأمطار المناعية
ملاحظة:في الخطوات 3.2-3.5 من البروتوكول، يتم تحديد الإشغال H3 الليستين H3 (H3K4me3) المضادة لثلاثي الميثيل. انظر أيضا الشكل 3.- إذابة هضم الكروماتين من الخطوة 3.1.3. احتفظ بجميع العينات على الثلج
- إعداد المخزن المؤقت لتخفيف ChIP المكمل بالموافقة المسبقة عن علم بإضافة حجم 1/100 من 100x PIC إلى المخزن المؤقت. تمييع الكروماتين المهضوم إلى 5 ميكروغرام/500 ميكرولتر مع عازل تخفيف ChIP المكمّل بالموافقة المسبقة عن علم. إعداد 1000 درجة مئوية بالإضافة إلى إضافية ل (1) IP مع IgG غير المناعية (IgG التحكم)، (2) IP مع H3K4me3.
- إضافة 5 ميكرولتر من 5 ميكروغرام/500 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم إلى أنبوب المسمار 1.5 مل كعينة مدخلات (1٪ من بروتوكول الإنترنت واحد). تخزين العينة في -80 درجة مئوية.
- إضافة 500 ميكرولتر كل من 5 ميكروغرام /500 ميكرولتر هضم الكروماتين إلى أنبوب المسمار 1.5 مل كعينة IP. إضافة 2 ميكروغرام من الأجسام المضادة إلى الأنبوب. أغلق الغطاء واحتضن الأنبوب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع خلط لطيف باستخدام منصة هزازة.
ملاحظة: على الرغم من أنه ينبغي تحديد كمية الأجسام المضادة المثلى تجريبياً، يوصى بـ 2 ميكروغرام لكل بروتوكول ملكية الفكرية في البداية. - إضافة 30 درجة مئوية من البروتين ChIP الصف G الخرز المغناطيسي في IP. احتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع خلط لطيف باستخدام منصة هزاز.
ملاحظة: غسل مسبق من الخرز المغناطيسي ليس من الضروري.
- غسل مركب المناعة وعكس الربط
- تدور أسفل الأنبوب من الخطوة 3.2.5 لفترة وجيزة. ضع الأنبوب في رف البولي إثيلين الذي يحتوي على مغناطيس النيودينيوم لمدة دقيقة واحدة.
- إضافة 0.5 مل لكل أنبوب من انخفاض الملح مجمع المناعة الغسيل العازلة. تفريق الخرز عن طريق التنصت بلطف أو دوامة لفترة وجيزة الأنبوب. احتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف باستخدام منصة هزاز. بعد 5 دقائق، كرر الخطوة 3.3.1.
- إضافة 0.5 مل من الملح العالي الملح مجمع غسل العازلة لكل أنبوب. تفريق وغسل الخرز كما الخطوة 3.3.2. بعد الغسيل، كرر الخطوة 3.3.1.
- إضافة 0.5 مل من LiCl مجمع المناعة غسل العازلة لكل أنبوب. تفريق وغسل الخرز كما الخطوة 3.3.2. بعد الغسيل، كرر الخطوة 3.3.1.
- ضع الأنبوب في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
- إضافة 150 درجة مئوية من العازلة elution إلى الأنبوب. دوامة أنبوب لتفريق الخرز تماما. أغلق الغطاء واحتضن الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ويخلط بانعكاس أو دوامة كل 5 دقائق لتفريق الخرز بدقة.
- أثناء الحضانة، قم بإعداد أنبوب المسمار 1.5 مل وإضافة 6 ميكرولتر من 5 M NaCl و 2 ميكرولتر من proteinase K. Thaw 1% عينة الإدخال المعدة في الخطوة 3.2.3. إضافة 150 درجة مئوية من العازلة elution، 6 ميكرولتر من 5 M NaCl و 2 ميكرولتر من proteinase K إلى 1٪ عينة الإدخال.
- بعد الحضانة، تدور أسفل الأنبوب. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ونقل supernatant إلى أنبوب المسمار الذي يحتوي على NaCl وproteinase K أعدت في الخطوة 3.3.7.
- إغلاق الغطاء ودوامة جميع عينات IP والمدخلات لخلط تماما. احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تنقية الحمض النووي
- إعداد الأنبوب كما هو موضح في 2.3.2 وإضافة 150 ميكرولتر من PCI بدلاً من 100 درجة مئوية. في أنبوب آخر، إضافة 12 درجة مئوية من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2 ميكرولتر من الجليكوجين.
- إزالة الأنبوب من الحاضنة. تدور أسفل الأنبوب وإضافة 150 درجة مئوية من PCI.
- دوامة بقوة أنبوب لتشكيل مستحلب. الطرد المركزي الأنبوب في السرعة القصوى (على سبيل المثال 20،000 × ز) لمدة 30 ق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل بعناية 140 درجة مئوية من المرحلة العليا إلى الأنبوب الذي يحتوي على PCI أعدت في الخطوة 3.4.1. كرر الخطوة 3.4.3.
ملاحظة: راجع أيضًا ملاحظة في الخطوة 2.3.4. - نقل بعناية 120 درجة مئوية من المرحلة العليا إلى أنبوب يحتوي على خلات الصوديوم والجليكوجين أعدت في الخطوة 3.4.1.
ملاحظة: راجع أيضًا ملاحظة في الخطوة 2.3.4. - إضافة 300 درجة مئوية من الإيثانول. مزيج من انعكاس واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- طرد مركزي الأنبوب بأقصى سرعة (على سبيل المثال، 20000 × ز) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. غسل بيليه كما هو موضح في الخطوة 2.3.6.
- بعد تجفيف بيليه كما هو موضح في الخطوة 2.3.7، حل بيليه في 50 درجة مئوية من TE. تخزين في -20 درجة مئوية.
- الكشف عن شظايا الحمض النووي باستخدام PCR في الوقت الحقيقي
- إذابة العينات التالية: (1) IP مع IgG التحكم، (2) IP مع المضادة للH3K4me3، (3) 1٪ عينة الإدخال. ذوبان أيضا 4 جرعات من المعايير المعدة في الخطوة 3.1.5 (ما مجموعه 7 عينات).
ملاحظة: استخدام معايير من نفس المجموعة لتحديد كمية كميات الحمض النووي في المدخلات وعينات IP. - جعل PCR حل العمل ل8 عينات. مزيج 40 درجة مئوية من 2X في الوقت الحقيقي PCR supermix، 8 ميكرولتر كل من 4 μM إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 8 ميكرولتر من الماء.
ملاحظة: يحتوي خليط تفاعل PCR واحد على 5 ميكرولتر من 2X في الوقت الحقيقي PCR supermix، 1 μL كل من 4 μM إلى الأمام والتمهيديات العكسية، و1 ميكرولتر من الماء. وترد في الجدول 2سلسلة الأحرف التمهيدية. - Aliquot 8 μL من PCR حل العمل في بئر واحد من لوحة PCR. إضافة 2 μL من العينات من الخطوة 3.4.8 أو المعايير من الخطوة 3.1.5.
- ختم لوحة PCR وتشغيل PCR باستخدام الشروط التالية: 1) 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق للإزالة الأولية، 2) 95 درجة مئوية لمدة 10 s للإزالة، 3) 56 درجة مئوية لمدة 30 s للصلب، 4) 72 درجة مئوية لمدة 30 s للتمديد وجمع البيانات ، كرر الخطوات من 2) إلى 4) لمدة 55 دورة. بعد ركوب الدراجات، قياس منحنى ذوبان المنتج PCR. تحليل البيانات.
ملاحظة: وترد البيانات الأولية للشكل 3 في الجدول3. حساب كمية البداية (SQ) للعينات باستخدام منحنى قياسي. ضرب SQ في 1٪ المدخلات بنسبة 100 لضبط عينة مدخلات SQ من 1٪ إلى IP واحد لإعطاء SQ المعدلة في الإدخال (Eq. 1). تقسيم SQ في عينة IP بواسطة SQ المعدلة في الإدخال لإعطاء قيمة الإدخال ٪ (طريقة الإدخال في المائة، Eq. 2). لحساب إثراء أضعاف، تقسيم SQ في الملكية الفكرية مع المضادة H3K4me3 بواسطة SQ في الملكية الفكرية مع IgG السيطرة (أضعاف طريقة التخصيب، مكافئ 3).
SQ المعدلة في الإدخال = (SQ في 1٪ الإدخال) × 100 (1)
النسبة المئوية للمدخلات من H3K4me3 = 100 x (SQ في الملكية الفكرية مع المضادة لH3K4me3) / (SQ المعدلة في الإدخال) (2)
إثراء أضعاف H3K4me3 = (SQ في الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3) / (SQ في الملكية الفكرية مع IgG التحكم) (3)
- إذابة العينات التالية: (1) IP مع IgG التحكم، (2) IP مع المضادة للH3K4me3، (3) 1٪ عينة الإدخال. ذوبان أيضا 4 جرعات من المعايير المعدة في الخطوة 3.1.5 (ما مجموعه 7 عينات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هضم الكروماتين هي واحدة من الخطوات الهامة لاختبار ChIP. استخدمنا MNase لهضم الكروماتين للحصول على خليط من oligomers النيوكليوسوم. في خطوة الهضم MNase، MNase يمكن أن تذهب من خلال الغشاء النووي وهضم الكروماتين. ومع ذلك، فإن الكروماتين المهضوم لا يمكن أن تذهب من خلال الغشاء ويبقى في النوى. للافراج عن الكروماتين المهضوم من النوى ، هناك حاجة إلى سونيكيشن قصيرة. الشكل 1A يظهر الصور الدقيقة قبل وبعد sonication من تعليق الخلية VCaP. دون سونيكيشن، هيكل الخلية لا تزال سليمة، مما يدل على أن الكروماتين موجود في النوى. سونيكيشن قصيرة يكسر بنية الخلية، والتحقق من الخلايا في الصور الدقيقة يساعد على تحديد ظروف sonication وجيزة. كما مثلنا أمثلة أخرى لسونيكيشن قصيرة في الخلايا 293T (الشكل1B)الإنسان B-الخلية الحادة سرطان الدم اللمفاوي خط الخلية، وخلايا REH (الشكل1C)وخط الخلايا سرطان البروستاتا البشرية، LNCaP (الشكل1D).
ويبين الشكل 2A تجزئة الكروماتين بعد العلاج مع كميات مختلفة من MNase في خلايا VCaP. تعاملنا 6 × 106 عبر ربط الكريات الخلية VCaP مع 0، 50، 100، 200 وحدة هلام من MNase في 300 درجة مئوية من المخزن المؤقت الهضم لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد تنقية الكروماتين المهضوم، تم تحليل 500 نانوغرام من الحمض النووي على 2٪ هلام أغاروز وملطخة ببروميد الإيثيديوم. دون إضافة MNase، ظهر نمط تشويه مع وزن جزيئي مرتفع جدا (حارة 1). أعطى الإضافة من [منس] سلم أسلوب ([ن]; [مونوكليوسوم] وحدة), يبدي أنّ [منس] يهضم [إينترنوكليوسوم] (ممرات 2-5). يظهر الشكل 2B نمط هضم غير مناسب. الإفراط في الهضم أدى أساسا في إنتاج mononucleosome (الشكل2B،حارة 7). وينبغي أن نجد الظروف المناسبة التي تنتج شظايا الكروماتين تصل إلى 900 نقطة في الثانية (واحد إلى خمسة نيوكليوسومات؛ على سبيل المثال، حارة 5).
للتحقق مما إذا كان يتم إجراء فحص ChIP بشكل صحيح، من الضروري أن يكون لديك عناصر تحكم مناسبة في الفحص. بالنسبة لهطول الأمطار المناعية، تُستخدم الـ IgGs غير المناعية من نفس الأنواع مثل الأجسام المضادة ذات الأهمية كعنصر تحكم يظهر ربطًا غير محدد لنفس المنطقة (انظر المناقشة). وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن لقياس ربط البروتينات (الإشغال) في كل من المناطق الإيجابية والسلبية. وقد تم قبول على نطاق واسع أن يتم توزيع H3K4me3 الإشغال بين ما يقرب من كيلوباسي واحد (كيلوبايت) المنبع والمصب من مواقع بدء النسخ10،11. قمنا بقياس الإشغال H3K4me3 في جينوم AR الذي يمتد على ما يقرب من 20 كيلو بايت من المنبع من خلال 12 كيلو بايت أسفل مجرى موقع بدء النسخ AR (AR-TSS) في خلايا VCaP الإيجابية AR. وقد ظهر نمط الهضم من الكروماتين في خلايا VCaP المستخدمة في هذه التجربة في الشكل 3A، مما يشير إلى الهضم السليم للكروماتين. وقد لوحظ أعلى إشغال H3K4me3 حول AR-TSS و 0.5 كيلوبايت و 1 كيلو بايت من المنبع AR-TSS (الشكل3B). طالما أن الجينات نشطة بشكل نسخي، يمكن أن تكون TSSS "مناطق إيجابية". المناطق الواقعة في 19 كيلوبايت و 8 كيلوبايت المنبع و 12 كيلو بايت المصب من AR-TSS، ومع ذلك، كان شغل القليل من H3K4me3 (الشكل3B)،مما يشير إلى أن هذه يمكن استخدامها كـ "مناطق سلبية".
وقد تبين أن الاندروجين يزيد من الإشغال RNA بوليميراز الثاني في المروج PSA ومحسن في خلايا LNCaP باستخدام الكروماتين معتص من قبل sonication12,13. لذلك اختبرنا صلاحية بروتوكولنا عن طريق قياس الإشغال النشط للبوليميراز الثاني من الحمض النووي الريبي (بوليميراز الحمض النووي الريبي الفوسفوري الثاني في سيرين 5; PolII (pS5)) في الخلايا. لقد قمنا بنفس التجربة للتحقق من قابلية إعادة إنتاج أسلوبنا. تم استزراع خلايا LNCaP في المتوسط تجويع الستيرويد لمدة 3 أيام وحفزت مع سيارة أو 10 nM ديهدروتستوسترون (DHT) لمدة 4 ح. تم قياس شغل بوليميراز الثاني RNA النشطة عن طريق الترسيب المناعي مع المضادة للPolII (pS5)، تليها PCR في الوقت الحقيقي. يظهر الشكل 4A نمط هضم قابل للاستنساخ من الكروماتين من خلايا LNCaP في ثلاث تجارب مستقلة. كما هو مبين في الشكل 4B، DHT زيادة كبيرة في شغل PolII (pS5) في المروج PSA ومحسن عند استخدام طريقة الإدخال في المئة. كما قمنا بحساب الإشغال باستخدام طريقة الإثراء الطي (الشكل4C)ووجدنا أنه لم يتم ملاحظة أي فرق كبير في PolII(pS5) في مروج PSA مع أو بدون علاج DHT. لم تؤثر DHT على الإشغال في المروج GAPDH كما نشرت سابقا14. الأهم من ذلك، كانت بياناتنا مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من عينات الكروماتين sonication-sared12،13.
الشكل 1: الصور الدقيقة التمثيلية لكريات الخلايا المتقاطعة قبل وبعد سونيكيشن. تم التعامل معالكريات الخلية عبر ربطVCaP (A)، 293T (B)، REH (C) وLNCaP (D) مع MNase، وأعيد تعليق الكريات في المخزن المؤقت تخفيف ChIP. قبل وبعد سونيكيشن، تم التقاط صور للتعليق. شريط مقياس = 200 درجة.
الشكل 2: تحليل هلام أغاروز ممثل من الكروماتين المهضوم. (أ) تم إعداد الكروماتين المترابط من خلايا VCaP وتم هضمه بكميات مختلفة من MNase كما هو موضح في الخطوة 2.2. تم عكس الكروماتين المهضوم عبر ربطها، وتنقيتها، وتحليلها في هلام أغاروز 2٪. N; وحدة mononucleosome. (B) تم هضم كروماتين من خلايا VCaP مع 250 وحدة هلام من MNase لكل 2 × 106 خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتحليلها (كما هو موضح في A). كميات أكبر من MNase وأطول أوقات الحضانة تسبب الهضم الكامل تقريبا من الكروماتين لتشكيل mononucleosomes (150 bp). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: H3K4me3 شغل في الجينوم AR. تم إعداد الكروماتين المهضوم من خلايا VCaP. (أ) تم تحليل نمط الهضم باستخدام هلام أغاروز. (B) 5 ميكروغرام من الكروماتين المهضوم كان مناعياً مع 2 ميكروغرام من أي إيغ الأرنب العادي أو الأجسام المضادة للH3K4me3 كما هو مذكور في الخطوة 3.1 والخطوة 3.2. تم غسل المجمعات المناعية وeluted من الخرز، وعكس crosslinked. تم تحليل شظايا الحمض النووي النقي باستخدام PCR في الوقت الحقيقي مع مجموعات التمهيدي المدرجة في الجدول 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاندروجين زيادة نشطة RNA بولميراز الثاني الإشغال في المروج PSA ومحسن. تم التعامل مع خلايا LNCaP تجويع الستيرويد مع أو بدون 10 NM DHT لمدة 4 ساعة, وتم إعداد الكروماتين هضمها. (أ) نمط الهضم من الكروماتين من خلايا LNCaP في ثلاث تجارب مستقلة. (باء،جيم) تم تسريع الكروماتين المهضوم بجسم مضاد للPolII(pS5)، وتم تنقية شظايا الحمض النووي كما هو موضح في الشكل 3. تم تحديد شغل بوليميراز RNA النشط الثاني في مروج PSA، محسن، والمروج GAPDH كمدخل في المئة (B) وإثراء أضعاف (C) باستخدام PCR في الوقت الحقيقي مع مجموعات التمهيدي المدرجة في الجدول 2. النتائج المعروضة هي يعني ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. (*); p<0.05, (**); p < 0.01 مقابل 0 nM DHT العلاج. NS; ليست كبيرة مقابل 0 nM DHT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خط الخلية | وحدات هلام لكل مليوني خلية في 100 درجة مئوية من المخزن المؤقت، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة |
| LNCaP | 267 |
| VCaP | 66.7 |
| 293T | 450 |
| REH | 134 |
| 22Rv1 | 400 |
الجدول 1: الكمية المثلى من النوكالإيجار ية في مختلف خطوط الخلايا. تمثل القيمة كميات MNase لكل 2 × 106 خلايا في 100 درجة مئوية من المخزن المؤقت، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
| اسم التمهيدي | تسلسل | |
| AR (-18.8كيلو بايت) | FWD | ATTTGGAACTGAACATCT |
| القس | في الفرنسيّة | |
| AR (-8.8 كيلوبايت) | FWD | TAACAGCTTTGCATAAGT |
| القس | TGAACTGGGACTAAAGCA | |
| AR (-8.2 كيلوبايت) | FWD | في هذا الـ401 |
| القس | TTGGACTCTCTATTTGA | |
| AR-TSS (0 kb) | FWD | GCAAACTGTGCATGCTC |
| القس | في هذا الـ10 | |
| AR (0.6 kb) | FWD | في الفرنسيّة |
| القس | TGAAGACCTGACTGCCTTTC | |
| AR (+1.0 كيلوبايت) | FWD | في ما إذا كان هذا هو العام |
| القس | CTTCCCAGCCCTAACTGCAC | |
| AR (+11.8 كيلوبايت) | FWD | CCTTGCTTGTGTAACTGTAG |
| القس | TTTATTGTGTGTGCGTGC | |
| بي إس إيه المروج | FWD | CCTAGGAAGTCTCCATGAGCTACA |
| القس | جيغاغاغاغتاغاكتت | |
| محسن PSA | FWD | مجلس التعاون الخليجي |
| القس | ACACCTTTTTTTGTGTGTGTTG | |
| في هذا الـ41 | FWD | تاكتاغغغتتتاغ غغ جي جي جي جي |
| القس | في هذا الـ15 |
الجدول 2: تسلسل التمهيدي المقترنة المستخدمة في CHIP.
| AR (-18.8كيلو بايت) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 23.49 | 0.815 | 81.5 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 27.68 | 0.051 | 0.051 | 0.062 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 22.48 | 1.590 جنيه | 1.590 جنيه | 1.951 | 31.4 |
| AR (-8.8 كيلوبايت) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 22.22 | 0.586 | 58.6 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 26.81 | 0.052 | 0.052 | 0.088 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 23.74 | 0.414 | 0.414 | 0.706 | 7.0 |
| AR (-8.2 كيلوبايت) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 23.19 | 0.643 | 64.3 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 26.99 | 0.048 | 0.048 | 0.075 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 23.63 | 0.477 | 0.477 | 0.742 | 9.9 |
| AR-TSS (0 kb) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 25.06 | 0.657 | 65.7 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 28.63 | 0.050 | 0.050 | 0.077 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 20.70 | 15.064 | 15.064 | 22.944 | 299.8 |
| AR (0.6 kb) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 23.86 | 0.716 | 71.6 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 26.67 200.00 | 0.106 | 0.106 | 0.147 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 19.15 | 17.787 | 17.787 | 24.840 | 168.6 |
| AR (+1.0 كيلوبايت) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 23.51 | 0.730 | 73.0 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 25.94 | 0.125 | 0.125 | 0.171 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 19.06 | 18.486 | 18.486 | 25.335 | 147.8 |
| AR (+11.8 كيلوبايت) | Cq | ميدان | تم ضبطه وفقًا لـ IP واحد | النسبة المئوية للإدخال | إثراء أضعاف |
| 1% إدخال | 24.54 | 0.876 | 87.6 | 100 | |
| الملكية الفكرية مع IgG التحكم | 29.14 | 0.033 | 0.033 | 0.037 | 1 |
| الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 | 24.47 | 0.918 | 0.918 | 1.048 | 27.97 |
الجدول 3: البيانات الخام المستمدة من التحليل الكمي لـ PCR للشكل 3. Cq: رقم دورة العتبة، SQ: كمية البدء المحسوبة باستخدام منحنى قياسي، معدلة إلى IP واحد: ضرب SQ في 1٪ الإدخال بنسبة 100 كما يتم استخدام حجم عينة 1٪ من IP واحد لPCR، ٪ الإدخال: تقسيم SQ في عينة الملكية الفكرية عن طريق تعديل SQ في الإدخال، أضعاف الإثراء تقسيم SQ في الملكية الفكرية مع المضادة للH3K4me3 من قبل SQ في الملكية الفكرية مع IgG السيطرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة للحصول على الكروماتين مجزأة، فإنه من تستغرق وقتا طويلا ومرهقة لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. في هذا البروتوكول، استخدمنا هضم MNase لأن هضم الإنزيم يجب أن يكون أسهل لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. كانت خطوة سونيكيشن قصيرة بعد الهضم MNase (انظر الخطوة 2.2) ضرورية لكسر غشاء الخلية والإفراج عن الكروماتين المهضوم. لذلك، يجب أن تكون قوة sonication في بروتوكولنا منخفضة قدر الإمكان. نحن نستخدم نفس شروط الصوت لجميع الخلايا التي استخدمناها (انظر الشكل 1 والجدول 1)للحصول على انهيار كامل للغشاء.
هضم الكروماتين من قبل MNase هو خطوة حاسمة في بروتوكولنا، وبالتالي بذلنا جهدا كبيرا لتحسين الظروف لهضم الكروماتين داخل الخلايا. يتم تحديد نشاط الهضم من خلال كميات الإنزيم والركيزة (الكروماتين) ووقت الحضانة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ ploidy يختلف بين خلايا مختلفة، يجب تحديد الظروف المثلى لهضم MNase لكل نوع الخلية. وبمجرد تحديدها، يمكن تطبيق نفس الشروط بغض النظر عن علاجات الخلايا. نحن دائما التحقق من أنماط الهضم الكروماتين في كل تجربة للتأكد من أن أنماط الهضم هي مناسبة لتجارب ChIP، كما هو مبين في الشكل 2A،حارة 5.
بعض العوامل تؤثر على نتائج الاختبارات ChIP. من المهم استخدام الكمية الصحيحة من الكروماتين المهضوم في بروتوكولنا. في العديد من البروتوكولات، يظهر رقم الخلية ولكن ليس كمية الكروماتين لIP واحد15،16. هذه الظروف التجريبية تنتج تباينا كبيرا في كمية الكروماتين بين الخلايا بسبب الاختلافات ploidy. نحن نستخدم 5 ميكروغرام من الكروماتين و 2 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل بروتوكول ملكية الفكرية في عملية الضبط، وبالتالي فإن بروتوكولنا أكثر وضوحاً ووضوحاً من البروتوكولات الأخرى، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى كميات مثالية من الأجسام المضادة للملكية الفكرية. ومن المهم أيضا اختيار الأجسام المضادة؛ استخدام الأجسام المضادة ChIP التحقق من صحة.
هناك طريقتان لتحليل بيانات PCR ChIP: طريقة الإدخال النسبة المئوية وطريقة إثراء الطي. في طريقة الإدخال في المائة، يتم تقسيم الإشارات من عينات IP بواسطة إشارات من مجموع الكروماتين في عينة IP. في طريقة إثراء أضعاف، يتم تقسيم إشارات من IP مع جسم مضاد معين مثل H3K4me3 بواسطة إشارات من IP مع IgG التحكم. الطريقة اللاحقة تنطبق فقط عندما تكون الإشارات من IP مع IgG التحكم متشابهة وقابلة للاستنساخ في أهداف متعددة أو أهداف متطابقة في ظل الظروف الفسيولوجية المختلفة. ومن الناحية العملية، تختلف مستويات الإشارة بحيث تكون قيمة الإثراء القابلة للطي عالية التغير كما هو مبين في الشكل 4C. ولذلك، لا نوصي باستخدام طريقة إثراء أضعاف لتمثيل بيانات ChIP في أسلوبنا.
MNase تفضل بيئة "مفتوحة" euchromatin ولا يمكن الوصول إليها لهيكل heterochromatin, مما يشير إلى أن الهضم MNase قد تنتج بعض التحيز. وقد أفيد أن إثراء المجالات الكروماتين اللامين A-التفاعل يختلف في ما بين sonication-sared وMNase هضمها الاستعدادات الكروماتين17. وهكذا، قد لا يكون هضم MNase في تحليل ChIP مناسبًا لتحليل الجزيئات المرتبطة بالبنية النووية مثل Lamin A/C والبروتين الملزم للتسلسل الخاص الغني بـ AT (SATB1).
في بروتوكولات اختبار ChIP المصممة لmicroarray المصب (ChIP على رقاقة) أو تحليل التسلسل (ChIP-seq)، يتم استخدام RNase خلال خطوة تنقية الحمض النووي، وإن لم يكن في البروتوكولات المصممة لتحليل PCR18. لم نختبر ما إذا كان بروتوكولنا متوافقًا مع تحليلات ChIP-on-chip وChIP-seq، ولكننا نفترض أن بروتوكولنا ينطبق عند معالجة العينات مع RNase. إذا كانت هناك حاجة إلى علاج RNase، استخدم 2 ميكرولتر من 10 ملغ /مل DNase خالية من RNase A بدلا من proteinase K في الخطوة 3.3 وحضانة في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قبل تنقية الحمض النووي (الخطوة 3.4)، أضف بروتينK وحضانة لمدة ساعة إضافية عند 60 درجة مئوية.
نقوم بشكل روتيني بإجراء اختبارات ChIP مع الهيستون المعدلة وعوامل النسخ باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، وقد أظهرت أن عامل إعادة عرض الكروماتين، مجال التفاعل الغنية بـ AT 5B، ينظم التعبير الجيني AR عن طريق تغيير شغل PolII( pS5) وH3K4me3 في المروج AR19. ونحن نعتقد أن بروتوكولنا هو أسهل من الناحية الفنية من غيرها من اختبارات ChIP ومقبولة على نطاق واسع في بحوث البيولوجيا الجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا البحث من قبل الإتاوات Genentech إلى مدينة الأمل. وهذا العمل لا تدعمه المعاهد الوطنية للصحة كلياً أو جزئياً.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P.
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K.
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L.
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
