Summary
クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。
Abstract
生物の細胞表現型を発現させるには、生細胞がそれに応じて遺伝子発現を行い、転写プログラムは遺伝子発現において中心的な役割を果たす。細胞転写機械とそのクロマチン修飾タンパク質は、転写を調節するために調整する。分子レベルで転写調節を分析するために、電気泳動性シフト、一過性レポーターおよびクロマチン免疫沈殿(ChIP)アッセイなどのいくつかの実験方法が利用可能である。この記事では、ヒストン修飾と細胞内のタンパク質とDNAの相互作用を直接示す利点があるため、改変されたChIPアッセイについて詳しく説明します。成功したChIPアッセイの重要なステップの1つは、クロマチン剪断です。超音波処理は、一般的にクロマチンを剪断するために使用されますが、再現可能な条件を識別することは困難です。超音波処理によるクロマチンの剪断の代わりに、微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)による酵素消化を利用して、より再現性の高い結果を得ました。この記事では、MNase を使用した簡単な ChIP アッセイ プロトコルを提供します。
Introduction
哺乳類細胞における遺伝子発現は、緊密かつ動的に調節され、転写は重要なステップの1つである。遺伝子転写は、主に転写因子およびヒストンによって調節される。転写因子は、特定のDNA配列に結合し、遺伝子転写を制御するタンパク質です。これらの因子は、RNAポリメラーゼII(PolII)の募集を促進または阻害するかのいずれかであり、これは、テンプレート1としてゲノムDNAからのmRNA合成を開始する。ヒストンテール残基のアセチル化およびメチル化などのヒストン修飾は、クロマチン構造2を変化させ、遺伝子転写にプラスおよび悪影響を及ぼす。遺伝子発現の変化は細胞の文脈に影響を与えるので、転写が調節される分子機構を調べることが不可欠である。
現在までに、遺伝子転写の調節を調るためのいくつかの方法が利用可能である。電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)は、ゲルシフトアッセイとも呼ばれ、タンパク質DNA相互作用3を分析するために使用される。目的の細胞からの核抽出物を放射性同位元素(例えば、32P)標識DNAプローブでインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その自動ラジオグラムは、DNAタンパク質複合体がゲル中のプローブよりも遅く移行することを示しています。タンパク質に対する抗体の存在下では、DNAタンパク質抗体複合体は、DNAタンパク質複合体よりもゆっくりとゲル中に移行する。この超シフトバンドは、DNAとタンパク質の間の特異的な結合を明らかにする。しかし、EMSAは、細胞のないシステムにおける特定のDNAタンパク質相互作用のみを決定するため、相互作用が生細胞内の転写を制御するかどうかは不明です。一般にルシフェラーゼレポーターアッセイと呼ばれる一過性レポーターアッセイは、細胞における遺伝子発現調節に対処するために開発されました。典型的には、目的の遺伝子の上流ゲノム領域がレポータープラスミドに挿入され、一時的に細胞にトランスフェクトされ、レポーター活性が測定される。様々な欠失変異体により、遺伝子調節を担う領域の同定が可能になります。レポーターアッセイは転写因子を同定し、転写を制御する結合DNA配列を特定するのに有用なツールですが、この方法はレポータープラスミドがクロマチン構造を含んでおらず、「本物」を反映していないという点で大きな欠点があります。転写機械。さらに、ヒストン修正の変更はシステムによって決定できません。
クロマチン免疫沈殿(ChIP)法の開発は、ホルムアルデヒドを用いた「全細胞」固定がクロマチン構造4、5であるというジャクソンとチョークリーの報告に基づいていた。それ以来、多くの関連技術が開発され、6.ChIPアッセイでは、細胞はホルムアルデヒドで固定され、DNAとタンパク質を架け取ります。クロマチンは断片化され、次いで目的の抗体で免疫沈殿する。免疫複合体を洗浄し、DNAを精製します。ゲノムの特定の領域を標的とするプライマーによるPCR増幅は、ゲノムに関心のあるタンパク質の占有率を明らかにする。
ChIPは転写因子や改変ヒストンなどのタンパク質とDNAとの相互作用を識別するための強力なツールですが、この方法は実際にはクロマチン断片化ステップなどのいくつかの困難を伴います。超音波処理は、広くクロマチンを剪断するために使用されています。ただし、再現可能な条件を特定するのは面倒です。微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)治療は、クロマチン剪断のための代替方法である。MNaseは、二本鎖、一本鎖、円形および線形DNAおよびRNAを消化するエンドエキゾヌクレアーゼです。クロマチンと酵素の量、温度、インキュベーション時間を含む条件を決定することは比較的容易であり、最適なクロマチン断片化を行う。既存のプロトコルを変更および簡素化し、簡単で再現可能な方法を確立しました。本論文では、哺乳動物細胞におけるMNaseを用いてChIPアッセイのプロトコルを提供する。
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Protocol
1. 試薬の調製
- 18.5% パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を作ります。PFAの0.925 g、水の4.8 mL(プロトコル全体で超精製水を使用)、50 mL円錐形プラスチックチューブに1 M KOHの35 μLを追加します。キャップをしっかりと閉め、電子レンジで約200mLの水を含む400~600mLのガラスビーカーでチューブを加熱します。水が沸騰し始める前にチューブを取り外し、PFAを溶解するためにチューブを渦。PFAを室温まで冷却し、氷の上に保存します。
注:PFAが完全に溶解するまで加熱と混合を繰り返します。架橋の直前に PFA ソリューションを準備します(手順 2.1.3)。 - 1.25 Mグリシン溶液を作ります。150 mLの水に14.07gのグリシンを溶解し、0.22 μmの細孔サイズのフィルターを通して濾過します。4 °Cで保存します。
- ChIP 細胞のリシス バッファーを作成します。378 mgのパイプ、10.6 mLの2M KCl、および1.25gの分岐オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノールを水中に溶解する。pHを4°Cで1M KOHで8.0に調整し、最大250 mLにします。0.22 μmの細孔サイズのフィルターを通してフィルターを下し、4 °Cで保存します。
- 微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)消化バッファーを作ります。1 mL を作成するには、10x MNase 消化バッファーの 0.1 mL、100x BSA 溶液の 10 μL、0.1 M ジチオスレイトールの 10 μL、および 0.88 mL の水を混合します。
- 1 M NaHCO3を作成します。NaHCO3の4.2gを50mLの水に溶かし、0.22 μmの細孔サイズのフィルターを通して濾過します。室温で保管してください。
- 10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を作ります。50 mLの水に5gのSDSを溶かします。室温で保管してください。
- 溶出バッファを作成します。1 M NaHCO3の 15 μL、10% SDS の 15 μL、および 120 μL の水を混合して、1 つのサンプルに対して 150 μL の溶出バッファーを得ます。
注:サンプルの数に応じて、ボリュームを比例して増やします。 - 3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)溶液を作ります。アセテートナトリウムの24.6gを水に溶かします。酢酸でpHを5.2に調整し、100 mLを構成します。0.22 μmの細孔サイズのフィルターを通してフィルターを下し、室温で保存します。
2. MNase消化条件の決定
注:プロトコルのステップ2では、VCaPを用いる例として、ヒト前立腺癌細胞が提示される。任意の哺乳類の細胞株を使用することができます。「手順のメモ」を参照してください。
- 架橋クロマチンの調製
- 二酸化炭素インキュベーターで37°Cで10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したDME高グルコースのVCaP細胞を維持する。4 x 106細胞でシードVCaP細胞を6cm皿中4mLの培養培養物および培養物で3日間培養した。
注:各セルラインに適切な培養培養媒体を使用します。10 x 106細胞まで6 cmまたは10 cm皿で播種することができる。懸濁細胞の場合、T25フラスコ中の種子細胞。料理やフラスコの数は、MNase消化のためにテストされる用量の数に依存します。4用量をテストする場合は、6皿またはフラスコを準備します。手順 2.2 も参照してください。 - トリプシンを使用して1皿からVCaP細胞を切り離し、細胞を数えます。1皿でセル番号を計算します。懸濁細胞の場合は、1つのフラスコから少量の細胞懸濁液を除去し、セル数をカウントします。
- 18.5%PFAの0.229 mLを1%の最終濃度で培養培養培養機の4mLで6cm皿に加えます。穏やかに、しかし徹底的にPFAを均等に配布するために皿やフラスコを旋回。室温で10分間インキュベートします。
注:このステップでは、クロマチンとタンパク質が架橋されます。PFAは有毒であるので、化学ヒュームフードでこのステップを実行し、適切な個人的な保護装置を使用してください。 - 10分後、125mMの最終濃度で1.25Mグリシン溶液の0.47mLを加えます。室温で5分間インキュベートします。
注:グリシンは、さらなる架橋を停止するために余分なPFAを中和します。 - ホルムアルデヒド/グリシン/培養培養メディアを吸引する。リン酸緩衝生理食べ物(PBS)を4mL加えて細胞を2回洗う。懸濁細胞の場合は、細胞懸濁液を室温で5分間300×gの15mL円錐管と遠心分離機に移します。上清を吸引し、PBSの1つの媒体ボリュームを追加し、完全に中断します。この手順を繰り返します。ホルムアルデヒドが含まれているため、液体廃棄物を適切に処分してください。
- プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(PIC)を含むPBSをPBSに100x PICの1/100体積を加えて調剤する。皿からPBSを吸引し、PICを含むPBSの皿ごとに1 mLを追加します。細胞を掻き取り、細胞懸濁液を1.5mLマイクロ遠心管に移す。懸濁細胞の場合は、サスペンションを1.5mLチューブに移すだけで済みます。
- 室温で5分間3,000 x gの遠心管を用いて細胞ペレットを回収する。ピペットを使用してPBSを完全に取り外します。チューブあたりのセル番号を記録し、-80 °Cでセルペレットを保存します。
- 二酸化炭素インキュベーターで37°Cで10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したDME高グルコースのVCaP細胞を維持する。4 x 106細胞でシードVCaP細胞を6cm皿中4mLの培養培養物および培養物で3日間培養した。
- 細胞のうりとMNase消化
注:以下のステップにおける試薬量は、6 x 106細胞を含む1つのチューブに基づいている。細胞数に応じて試薬の容積を比例的に調整する。1つのチューブに2 x 106セルが含まれている場合は、100 μLのChIP細胞リシスバッファー(ステップ2.2.1)、MNase消化バッファ(ステップ2.2.3)、およびChIP希釈バッファー(ステップ2.2.5)、および0.5 M EDTAの10 μL(pH 8.4)を使用します(ステップ2.2.4)。- 氷上のステップ2.1.7で調製した貯蔵された細胞ペレット(VCaP細胞、チューブあたり6 x 106細胞を含む)を解凍する。100x PICの1/100体積をバッファーに加えてPICを補充したChIP細胞リシスバッファーを調べなさい。PICを補充したChIP細胞リシスバッファーの300 μLを追加し、ペレットを徹底的に再中断します。チューブを15sで渦にし、氷の上に懸濁液を10分間インキュベートします。
- 4°Cで3分間9,000 x gで遠心分離機を使用し、上清を完全に除去します。MNase消化バッファーの300μLでペレットを再中断します。
- MNase消化バッファーを使用した希釈MNase(2,000ゲル単位/μL)を使用して、MNaseの0、0.5、1、2、4 μLを懸濁液に加え、37°Cで37°Cでインキュベートし、2.5分ごとに混合します。
注:表1は、複数の細胞株におけるMNaseの最適な量を示す。 - MNase消化と渦を短時間終了するために、0.5 M EDTA(pH 8.0)の30 μLを追加します。氷の上で5分間インキュベートします。4°Cで5分間9,000 x gで遠心分離機を使用し、上清を完全に除去します。
- 100x PICの1/100ボリュームをバッファーに追加してPICを補充したChIP希釈バッファーを準備します。PICを補充したChIP希釈バッファーの300μLでペレットを再中断する。
- マイクロチッププローブを装備したソニオレーターを使用して、氷上の懸濁液を超音波処理します。次の超音波処理条件を使用します:振幅2、処理時間15s、パルスON 5s、パルスOFF 30s。懸濁液の1 μLを取り、スライドガラスにスポットし、顕微鏡を使用してそれらを観察します。セル構造がほぼ壊れていることを確認します。
注:図1Aは、超音波処理前後のVCaP細胞懸濁液の代表的なマイクロ写真を示す。このステップは、核膜を破壊することによって上清に消化されたクロマチンを放出するための.電源設定は最大電力の5%未満に調整し、30秒以上の間隔で5秒3回超音波処理を試みる必要があります。ワット数制御が可能な場合は、電源設定を5Wに調整し、上記のように合計15sのサンプルを処理して、70-75 J. セル構造が壊れているかどうかを確認します。十分でない場合は、もう一度繰り返します。上記の条件は、試験されたすべての細胞株に実質的に適用される。 - 4°Cで10分間9,000 x gの遠心分離機を新しい1.5 mLマイクロセントリクファージチューブに移し、消化されたクロマチンの20 μLをステップ2.3に保存します。残りを-80 °Cに保管してください。
- 逆架橋、DNAの精製、消化クロマチンの解析
- 水の75 μL、5 M NaCl の 4 μL、および 1.5 mL ねじ管にプロテネーゼ K の 1 μL を追加します。ステップ2.2.7で調製した様々なMNase消化条件から消化されたクロマチンを20μLを水、NaCl、およびプロテアーナーゼを含むチューブに加え、キャップをしっかりと閉じ、完全に混合し、一晩65°Cでチューブをインキュベートします。
注:このステップは、タンパク質とDNAとの架橋の除去を目的としています。 - 条件ごとに2本の1.5mLマイクロ遠心分離管を準備します。フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)(PCI)を1本の1.5mLチューブに加えます。3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)の10 μLと2μLのグリコーゲンを別のチューブに加えます。
注:クロロホルムの使用:イソアミルアルコールは必要ありません7.体積を増やすと、エタノール沈殿後のDNA回収が少なくなる可能性があります8. - ステップ2.3.1から消化クロマチンを含むチューブを短時間遠心分離し、100 μLのPCIを加えます。キャップをしっかりと閉じ、渦を激しくしてエマルションを形成します。最高速度(例えば、20,000 x g)でチューブを室温で30sに遠心分離します。
- DNAを含む上相を慎重に取り、ステップ2.3.2で調製したPCIを含むチューブに追加します。渦は激しく、ステップ2.3.3としてチューブを遠心分離します。
注:下相が汚染されている場合は、チューブを再度遠心分離するか、最初に下相の大部分を取り外し、チューブを遠心分離し、上相を取る。 - ステップ2.3.4に記載されているように上相を慎重に取り、ステップ2.3.2で調製した酢酸ナトリウムとグリコーゲンを含むチューブに追加します。エタノールを250μL加えます。反転して混合し、室温で10分間インキュベートします。4 °Cで30分間、チューブを最高速度(例えば、20,000 x g)で遠心分離します。
注:室温での溶液のインキュベーションはDNA回収8、9に影響を与えない。 - チューブの底面のペレットを確認します。ペレットを邪魔しないように上清を慎重に取り出し、70%エタノールの500μLを加えます。4 °Cで5分間、チューブを最高速度(例えば、20,000 x g)で遠心分離します。
- 上清を完全に取り出し、室温で約5分間ペレットを乾燥させます。10 mMトリスの20 μLでペレットを溶解·HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE)。UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。
- 0.5 μgのDNAをゲルローディング色素と混合し、2%のアガロースゲルに適用します。三酢酸-EDTAバッファーで100Vのサンプルを電気フォロースし、紫色の色素がゲルの3分の2に移行し、0.5 μg/mLの臭化物でゲルを10分間染色します。ゲルの写真を撮る。
注:詳細については、図 2を参照してください。
- 水の75 μL、5 M NaCl の 4 μL、および 1.5 mL ねじ管にプロテネーゼ K の 1 μL を追加します。ステップ2.2.7で調製した様々なMNase消化条件から消化されたクロマチンを20μLを水、NaCl、およびプロテアーナーゼを含むチューブに加え、キャップをしっかりと閉じ、完全に混合し、一晩65°Cでチューブをインキュベートします。
3. クロマチン免疫沈殿
- 消化クロマチンの調製
- セルを準備します。付着細胞の場合、2皿(6cmまたは10cm)の皿あたり2-10 x 106細胞を治療群ごとに播種し、1日以上皿の底に付着させる細胞を可能にする。懸濁細胞の場合、治療群当たり2T25フラスコ中の種子を用いる。必要に応じてセルを扱います。
- 各グループから 1 つの皿またはフラスコを取り、ステップ 2.1.2 で説明されているようにセル番号をカウントします。ステップ2.1.3-2.1.7で述べたように架橋クロマチンを調製する。
- ステップ2.2.1-2.2.7に記載されているように、細胞ペレットとMNase消化をlyseします。MNaseの最適な量を使用して、ステップ2で決定されたクロマチンを消化します。消化されたクロマチンを-80°Cで保存します。
- 消化クロマチンの逆架化20 μLを逆化し、ステップ2.3.8に記載されているようにDNAを精製します。ステップ 2.3.7 で説明したように、DNA 濃度を測定します。2%アガロースゲル中のサンプルを電気フォラーゼし、ステップ2.3で述べたように消化クロマチンの大きさを確認する。
注:DNA濃度は、ステップ3.1.3で調製された貯蔵された消化クロマチンの濃度と同一である。 - ステップ3.1.4から逆クロスリンク消化クロマチンサンプルを希釈し、水で10 ng/μLを与え、連続的に希釈して-20°Cで1、0.1、0.01 ng/μLの濃度を作ります。
注:これらのサンプルは、リアルタイムのPCR規格に使用されます。
- 免疫沈殿
注:プロトコルのステップ3.2〜3.5では、VCaP細胞における抗トリメチル化ヒストンH3リジン4(H3K4me3)の占有率が決定される。図3も参照してください。- ステップ3.1.3から消化されたクロマチンを解凍する。すべてのサンプルを氷の上に保管してください。
- 100x PICの1/100ボリュームをバッファーに追加してPICを補充したChIP希釈バッファーを準備します。消化されたクロマチンをPICで補充したChIP希釈バッファーを使用して5μg/500 μLに希釈します。非免疫IgG(コントロールIgG)、(2)Ip(H3K4me3)を使用したIPに対して、1,000 μLプラス余分な準備をします。
- 入力サンプルとして1.5 mLネジチューブに5 μg/500 μL消化クロマチンを5μL(1IPの1%)として追加します。サンプルを-80 °Cに保存します。
- IPサンプルとして1.5 mLネジチューブに5μg/500 μL消化クロマチンをそれぞれ500μLを追加します。チューブに2 μgの抗体を追加します。キャップを閉じ、ロッキングプラットフォームを使用して穏やかな混合で一晩4°Cでチューブをインキュベートします。
注:最適な抗体量は経験的に決定する必要がありますが、最初はIPあたり2μgが推奨されます。 - IPあたりのChIPグレードタンパク質G磁気ビーズを30μL添加します。揺れプラットフォームを使用して穏やかな混合と4 °Cでチューブを2時間インキュベートします。
注:磁気ビーズのプレウォッシュは必要ありません。
- 免疫複合体の洗浄と架橋の反転
- ステップ 3.2.5 からチューブを短時間スピンダウンします。ネオジニウム磁石を含むポリエチレンラックにチューブを1分間置き、吸引によって上清を慎重に取り除きます。
- 低塩免疫複合体洗浄バッファーのチューブあたり0.5 mLを追加します。チューブを軽くタップまたは短時間ボルテックスしてビーズを分散させます。揺れプラットフォームを使用して穏やかな混合で5分間4°Cでチューブをインキュベートします。5 分後、ステップ 3.3.1 を繰り返します。
- チューブあたり0.5 mLの高塩免疫複合洗浄バッファーを追加します。ステップ3.3.2としてビーズを分散して洗います。洗浄後、ステップ3.3.1を繰り返します。
- チューブあたり0.5 mLのLiCl免疫複合体洗浄バッファーを追加します。ステップ3.3.2としてビーズを分散して洗います。洗浄後、ステップ3.3.1を繰り返します。
- チューブを磁気ラックに1分間入れ、残りの上清を完全に取り外します。
- チューブに溶出バッファーの150 μLを追加します。チューブを渦にしてビーズを完全に分散させます。キャップを閉じ、チューブを65°Cで30分間インキュベートし、5分ごとに反転または渦で混合し、ビーズを完全に分散させます。
- インキュベーション中に、1.5 mLネジチューブを調製し、ステップ3.2.3で調製した1%の入力サンプルを5M NaClの6μLと2μLのプロテインナーゼK.解凍1%入力サンプルを追加します。溶出バッファーの150 μL、5 M NaCl の 6 μL、およびプロテネーゼ K の 2 μL を 1% の入力サンプルに加えます。
- インキュベーションの後、チューブをスピンダウンします。チューブを磁気ラックに1分間入れ、ステップ3.3.7で調製したNaClとプロテネーゼKを含むスクリューチューブに上清を移します。
- キャップと渦を閉じて、すべてのIPサンプルと入力サンプルを完全に混合します。チューブを一晩65°Cでインキュベートします。
- DNA精製
- 2.3.2で説明されているようにチューブを準備し、100 μLの代わりにPCIの150 μLを追加します。別のチューブに、3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)の12μLと2μLのグリコーゲンを加えます。
- インキュベーターからチューブを取り外します。チューブをスピンダウンし、PCIの150 μLを追加します。
- 渦はエマルションを形成するためにチューブを激しく形成する。室温で30sの最高速度(例えば20,000 x g)で管を遠心分離する。
- 上相の140 μLをステップ3.4.1で調製したPCIを含むチューブに慎重に移します。手順 3.4.3 を繰り返します。
注:手順 2.3.4 の注も参照してください。 - ステップ3.4.1で調製した酢酸ナトリウムとグリコーゲンを含むチューブに上相の120 μLを慎重に移します。
注:手順 2.3.4 の注も参照してください。 - エタノールを300μL加えます。反転して混合し、室温で10分間インキュベートします。
- 4 °Cで30分間、チューブを最高速度(例えば、20,000 x g)で遠心分離します。手順 2.3.6 に記載されているようにペレットを洗浄します。
- 工程2.3.7に記載のペレットを乾燥させた後、TEの50μLでペレットを溶解する。-20 °C.で保存します。
- リアルタイムPCRを用いてDNA断片を検出
- 次のサンプルを解凍: (1) コントロール IgG の IP、 (2) アンチ H3K4me3 の IP、(3) 1% 入力サンプル。また、ステップ3.1.5(合計7サンプル)で調製した基準の4用量を解凍する。
注:入力およびIPサンプル中のDNA量の定量に同じグループの標準を使用します。 - 8つのサンプルのためのPCR働く解決を作る。2xリアルタイムPCRスーパーミックスの40 μL、4 μM前方およびリバースプライマーのそれぞれ8μL、および水の8 μLを混合します。
注:1つのPCR反応混合物は、2倍のリアルタイムPCRスーパーミックスの5μL、4 μM前方および逆プライマーのそれぞれ1μL、および水の1 μLを含む。プライマー シーケンスは表2に示されています。 - PCR処理液のアリコート8 μLをPCRプレートの1つのウェルに入れる。ステップ 3.4.8 またはステップ 3.1.5 から標準からサンプルの 2 μL を追加します。
- PCRプレートをシールし、次の条件を使用してPCRを実行する:1) 95 °C 初期退化のための3分間、2)95 °C(10s用)、3)56°C(アニーリング用30s用)、4)拡張およびデータ収集用の30s用72 °C55サイクルの手順2)~4)を繰り返します。サイクリング後、PCR製品の溶融曲線を測定します。データを分析します。
注:図 3の生データを表 3に示します。標準曲線を使用してサンプルの開始数量 (SQ) を計算します。1% 入力で SQ に 100 を掛け、1% の入力サンプルの SQ を 1 つの IP に調整して、入力で調整された SQ を与えます(Eq. 1)。IP サンプルの SQ を入力の調整済み SQ で除算して、%入力値 (パーセント入力方法、Eq. 2) を指定します。フォールドエンリッチメントを計算するには、コントロールIgG(フォールドエンリッチメント法、Eq.3)でIPでアンチH3K4me3を使用してIpでSQを分割します。
入力で調整された SQ = (1% 入力の SQ) x 100 (1)
H3K4me3 = 100 x (反 H3K4me3 の IP での SQ) / (入力中の調整済み SQ) (2)
H3K4me3 = (アンチH3K4me3を持つIPのSQ) / (コントロールIgGを持つIPのSQ) (3)
- 次のサンプルを解凍: (1) コントロール IgG の IP、 (2) アンチ H3K4me3 の IP、(3) 1% 入力サンプル。また、ステップ3.1.5(合計7サンプル)で調製した基準の4用量を解凍する。
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Representative Results
クロマチンの消化は、ChIPアッセイの重要なステップの1つです。MNaseを使用してクロマチンを消化し、ヌクレオソームオリゴマーの混合物を得た。MNase消化ステップでは、MNaseは核膜を通過し、クロマチンを消化することができます。しかし、消化されたクロマチンは膜を通過することができず、核中に残ります。消化されたクロマチンを核から放出するには、簡単な超音波処理が必要である。図1Aは、VCaP細胞懸濁液の超音波処理前後のマイクロ写真を示す。超音波処理なしでは、細胞構造はそのまま残り、クロマチンが核内に存在することを示す。簡単な超音波処理は、細胞構造を破壊し、マイクロフォトで細胞をチェックすることは、短い超音波処理条件を決定するのに役立ちます。また、ヒトB細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株、REH細胞(図1C)及びヒト前立腺癌細胞株であるLNCaP(図1D)における293T細胞における簡潔な超音波処理の他の例も述べた。
図2Aは、VCaP細胞における異なる量のMNaseによる処理後のクロマチン断片化を示す。消化バッファーの0、50、100、200ゲル単位のMNaseを300μLで37°Cで10分間処理した。消化クロマチンを精製した後、500ngのDNAを2%アガロースゲルで分析し、臭化エチジウムで染色した。MNaseを添加することなく、非常に高い分子量を有するスミアパターンが現れた(レーン1)。MNaseの添加は、はしごパターン(N;単核球体ユニット)を与え、MNaseが内生代を消化することを示した(レーン2-5)。図2Bは、不適切な消化パターンを示す。過剰消化は主に単核球体産生をもたらした(図2B、レーン7)。クロマチン断片を900bp(1~5ヌクレオソーム、例えばレーン5)まで生成する適切な条件を見つける必要があります。
ChIPアッセイが適切に実行されているかどうかを確認するには、アッセイに適切なコントロールを持つことが不可欠です。免疫沈殿の場合、目的の抗体と同じ種からの非免疫IgGは、同じ領域への非特異的結合を示す対照として使用される(議論参照)。さらに、正と負の両方の領域におけるタンパク質(占有率)の結合を測定することをお勧めします。H3K4me3の占有率は、転写開始部位10,11の上流と下流の約1キロベース(kb)の間に分布していることが広く受け入れられている。AR陽性VCaP細胞におけるAR転写開始部位(AR-TSS)の下流約20kb上流から12kbのARゲノムにおけるH3K4me3占有率を測定した。本実験で用いられるVCaP細胞におけるクロマチンの消化パターンを図3Aに示し、クロマチンの適切な消化を示す。H3K4me3の最も高い占有率は、AR-TSSの周りとAR-TSSの0.5 kbおよび1 kbの上流で観察された(図3B)。遺伝子が転写活性である限り、TSSは「陽性領域」でありうる。ただし、AR-TSSの上流19kbと8kb、下流12kbのリージョンでは、H3K4me3(図3B)の占有率がほとんどなく、「負の領域」として使用できることを示しています。
アンドロゲンは、超音波処理12、13によるシェアクロマチンを用いたLNCaP細胞におけるPSAプロモーターおよびエンハンサーにおけるRNAポリメラーゼII占有率を増加させることが示されている。したがって、我々は、活性RNAポリメラーゼII占有率(セリン5でリン酸化RNAポリメラーゼII)を測定することによって、我々のプロトコルの有効性をテストしました。細胞内のPolII(pS5)。同じ実験を行い、その再現性を確認した。LNCaP細胞をステロイド飢餓培地で3日間培養し、4時間用の車両または10nMジヒドロテストステロン(DHT)で刺激し、抗PolII(pS5)による免疫沈殿により測定し、続いてリアルタイムPCRを行った。図4Aは、3つの独立した実験におけるLNCaP細胞からのクロマチンの再現可能な消化パターンを示す。図4Bに示すように、DHTはパーセント入力方法を用いたときにPSAプロモーターおよびエンハンサーにおけるPolII(pS5)占有率を有意に増加させた。また、折りたたみ濃縮法(図4C)を用いて占有率を算出し、DHT治療の有無にかかわらずPSAプロモーターにおけるPolII(pS5)に有意差が認められなかったことを明らかにした。DHT は、以前に公開された14のように GAPDH プロモーターの占有率に影響を与えなかった。重要なことに、我々のデータは、超音波処理せちクロマチンサンプル12、13から得られたものと類似していた。
図 1:超音波処理の前後に架橋された細胞ペレットの代表的なマイクロ写真。架橋VCaP(A)、293T(B)、REH(C)およびLNCaP(D)細胞ペレットをMNaseで処理し、ペレットをChIP希釈バッファーで再懸濁した。超音波処理の前後に、懸濁液の写真が撮影されました。スケールバー = 200 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:消化クロマチンの代表的なアガロースゲル分析。(A)架橋クロマチンをVCaP細胞から調製し、ステップ2.2に記載の通り様々な量のMNaseで消化した。消化されたクロマチンを逆架橋し、精製し、2%アガロースゲルで分析した。N;単核球体ユニット。(B)VCaP細胞のクロマチンを250ゲル単位のMNaseを37°Cで20分間37°Cで250ゲル単位で消化し、分析した(Aに記載)。MNaseの量が多く、インキュベーション時間が長いため、クロマチンのほぼ完全な消化がモノ核球を形成する(150 bp)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:ARゲノムにおけるH3K4me3占有率。消化クロマチンをVCaP細胞から調製した。(A)消化パターンをアガロースゲルを用いて分析した。(B) 消化されたクロマチンの5 μgは、ステップ3.1およびステップ3.2に記載されているように、正常ウサギIgGまたは抗H3K4me3抗体の2μgで免疫沈殿させた。免疫複合体をビーズから洗浄してeltし、逆架橋した。精製されたDNA断片は、表2にリストされたプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを用いて分析した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:アンドロゲンは、PSAプロモーターおよびエンハンサーにおける活性RNAポリメラーゼII占有率を増加させた。ステロイド飢餓LNCaP細胞を4時間10nM DHTの有無にかかわらず処理し、消化クロマチンを調製した。(A) LNCaP細胞からのクロマチンの消化パターンを3回の独立実験で行った。(B,C)消化されたクロマチンを抗PolII(pS5)抗体で免疫沈殿させ、DNA断片を図3に記載するように精製した。PSAプロモーターにおける活性RNAポリメラーゼIIの占有率は、パーセント入力(B)およびフォールドエンリッチメント(C)として、表2にリストされたプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを用いて決定した。示された結果は、3つの独立した実験の平均±SEである。(*);p<0.05, (**);p < 0.01 対 0 nM DHT 治療。NS;0 nM DHT に対して有意ではありません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| セルライン | バッファーの100 μLの200万細胞あたりのゲル単位、10分間の37 °C |
| LNCaP | 267の |
| VCaP | 66.7歳 |
| 293T | 450名 |
| レフ | 134の |
| 22Rv1 | 400人 |
表 1:様々な細胞株における微小コッカルヌクレアーゼの最適量。この値は、バッファーの 100 μL で 2 x 106セルあたりの MNase の量を表し、10 分間で 37 °C です。
| プライマー名 | シーケンス | |
| AR (-18.8kb) | Fwd | アットッガアクトマクガキャット |
| 牧師 | カクトクツクツククト | |
| AR (-8.8kb) | Fwd | タアカグストTTGCATCAGT |
| 牧師 | タガアトググガクタアグカ | |
| AR (-8.2kb) | Fwd | カググツットクツトガック |
| 牧師 | TTGGACTGGCTCTCTTGA | |
| AR-TSS (0 kb) | Fwd | GCAAAACTGTTATTTTTC |
| 牧師 | GGCCCTTTTCCCTCTCTC | |
| AR (0.6 kb) | Fwd | カッカッCGCCTTタグ |
| 牧師 | タガガッカックガクトアクトCTTTC | |
| AR (+1.0kb) | Fwd | CCGCAAGTTTTCTCTGG |
| 牧師 | CTCCCACCTAACTG | |
| AR (+11.8kb) | Fwd | CCTTTTTGTGGGタグ |
| 牧師 | TTTTGTGTGTGC | |
| PSAプロモーター | Fwd | チャタガトガグトカッチャクタカ |
| 牧師 | グッガッガガグタグチャクト | |
| PSA エンハンサー | Fwd | GCCTGGATCTガガガタツカツ |
| 牧師 | アカストットTTTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT | |
| ギャップド | Fwd | タッタググットッタッグッグ |
| 牧師 | TCGAアガガガガガガ |
表 2:ChIP アッセイに使用されるペアプライマー シーケンス。
| AR (-18.8kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 23.49年 | 0.815円 | 81.5歳 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 27.68円 | 0.051年 | 0.051年 | 0.062 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 22.48円 | 1.590件 | 1.590件 | 1.951件 | 31.4歳 |
| AR (-8.8kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 23.22年 | 0.586円 | 58.6歳 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 26.81円 | 0.052年 | 0.052年 | 0.088 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 23.74の | 0.414 | 0.414 | 0.706 | 8.0年 |
| AR (-8.2kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 23.19年 | 0.643 | 64.3歳 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 26.99年 | 0.048円 | 0.048円 | 0.075 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 23.63年 | 0.47700 | 0.47700 | 0.742 | 9.9年 |
| AR-TSS (0 kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 25.06年 | 0.657 | 65.7歳 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 28.63円 | 0.050年 | 0.050年 | 0.077 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 20.70年 | 15.064年 | 15.064年 | 22.944の | 299.8年 |
| AR (0.6 kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 23.86円 | 0.716 | 71.6年 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 26.67年 | 0.106 | 0.106 | 0.147 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 19.15年 | 17.787円 | 17.787円 | 24.840円 | 168.6年 |
| AR (+1.0kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 23.51年 | 0.73000 | 73.0年 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 25.94年 | 0.125 | 0.125 | 0.171 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 19.06年 | 18.486円 | 18.486円 | 25.335の | 147.8年 |
| AR (+11.8kb) | Cq | 平方 | 1 つの IP に調整 | パーセント入力 | フォールドエンリッチメント |
| 1% 入力 | 24.54年 | 0.876円 | 87.6歳 | 100人 | |
| コントロール IgG を使用した IP | 29.14年 | 0.033 | 0.033 | 0.037 | 1 |
| アンチH3K4me3を持つIP | 24.47年 | 0.918円 | 0.918円 | 1.048件 | 27.97年 |
表 3:図3の定量的PCR分析からの生データ。Cq: しきい値サイクル番号、 SQ: 標準曲線を使用して計算された開始数量, 1 つの IP に調整: 1% 入力で SQ を 100 で乗算します 100 PCR に使用されます, % 入力: 入力で調整された SQ によって IP サンプルの SQ を分割, フォールドエンリッチメント: コントロール IgG を使用して IP でアンチ H3K4me3 を使用して Ip で SQ を分割します。
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Discussion
超音波処理は、断片化したクロマチンを得るために一般的に使用されますが、再現可能な条件を識別するために時間がかかり、面倒です。このプロトコルでは、酵素消化が再現可能な条件を識別しやすくなるので、MNase消化を使用しました。MNase消化後の短い超音波処理ステップ(ステップ2.2を参照)は、細胞膜を破壊し、消化されたクロマチンを放出するために必要であった。したがって、私たちのプロトコルの超音波処理能力は、可能な限り低くする必要があります。私たちは、膜の完全な内訳を得るために、私たちが採用したすべての細胞(図1と表1を参照)に同じ超音波処理条件を使用します。
MNaseによるクロマチンの消化は、我々のプロトコルの重要なステップであり、したがって、我々は細胞内のクロマチンの消化のための条件を最適化するために多大な努力を行っています。消化活性は、酵素および基板(クロマチン)および潜伏時間の量によって決定される。また、細胞間でploidyは異なるため、細胞種ごとにMNase消化に最適な条件を特定する必要があります。一旦確立されると、細胞治療に関係なく同じ条件を適用することができる。図2A、レーン5に示すように、消化パターンがChIPアッセイに適していることを確認するために、各実験で常にクロマチン消化パターンをチェックします。
いくつかの要因は、ChIPアッセイの結果に影響を与えます。私たちのプロトコルで消化クロマチンの適切な量を使用することが重要です。多くのプロトコルでは、1つのIPに対するクロマチンの量ではなく、セル番号が15、16を示している。これらの実験条件は、プロイディ差による細胞間のクロマチン量に高い変動性を生じる。アッセイでは、5 μgのクロマチンと2μgの抗体をアッセイに使用するため、当社のプロトコルは他のプロトコルよりも簡単で明確ですが、IPに最適な量の抗体が必要になる場合があります。抗体の選択も重要です。ChIPアッセイ検証抗体を使用します。
ChIP PCR データを分析するには、パーセント入力方法とフォールド エンリッチメント方法の 2 つの方法があります。パーセント入力方法では、IPサンプルからの信号は、IPサンプル中の全クロマチンからの信号で除算されます。フォールドエンリッチメント法では、H3K4me3などの特定の抗体を持つIPからの信号は、制御IgGを用いたIPからの信号によって分割される。後の方法は、制御IgGを有するIPからの信号が類似し、異なる生理学的条件下で複数の標的または同一の標的で再現可能である場合にのみ適用可能である。実際には、信号レベルは変化するので、フォールドエンリッチメント値は図4Cに示すように高い変動性を持っています。したがって、折り目エンリッチメント法を使用して、この方法で ChIP データを表すことをお勧めしません。
MNaseはユークロマチンの「オープン」環境を好み、ヘテロクロマチン構造にはアクセスできないので、MNase消化はいくつかのバイアスを生み出す可能性があることを示唆している。ラミンA相互作用クロマチンドメインの濃縮は、超音波処理せんか、MNase消化クロマチン製剤17との間で異なっていると報告されている。したがって、ChIPアッセイにおけるMNase消化は、ラミンA/Cおよび特殊ATリッチ配列結合タンパク質1(SATB1)などの核構造関連分子を解析するのに適さない場合がある。
下流マイクロアレイ(ChIP-on-chip)またはシーケンシング(ChIP-seq)解析用に設計されたChIPアッセイプロトコルでは、RNaseはDNA精製工程中に使用されますが、PCR分析用に設計されたプロトコルではありません18。当社のプロトコルがChIPオンチップおよびChIP-seq分析と互換性があるかどうかをテストしていませんが、サンプルをRNaseで処理する場合、当社のプロトコルが適用可能であると仮定しています。RNase治療が必要な場合は、ステップ3.3でプロテパナーゼKの代わりに10mg/mL DNaseフリーRNase Aの2 μLを使用し、一晩65°Cでインキュベートします。DNAを精製する前に(ステップ3.4)、プロテパネアーゼKを追加し、60°Cでさらに1時間インキュベートします。
我々は、ここで説明する方法を用いて改変ヒストンおよび転写因子を用いてChIPアッセイを日常的に行い、クロマチンリモデリング因子であるAT-リッチインタラクションドメイン5BがPolIIの占有率を変化させることによってAR遺伝子発現を調節することを示した(arプロモーター19におけるpS5)およびH3K4me3。私たちは、私たちのプロトコルは、他のChIPアッセイよりも技術的に簡単であり、分子生物学の研究で広く受け入れ可能であると信じています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、ジェネンテックのホープ市へのロイヤリティによって支えられている。この研究は、国立衛生研究所の全部または一部をサポートしていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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