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Genetics

क्रोमैटिन इम्यूनोएमिनेशन असेसे मैमलियन सेल में माइक्रोकोकल न्यूक्लेस का उपयोग करते हुए

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59375
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन (ChIP) जीन विनियमन के आणविक तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, विधि यांत्रिक कतरनी द्वारा reproduible क्रोमैटिन विखंडन प्राप्त करने में कठिनाइयों शामिल है। यहाँ, हम एंजाइमी पाचन का उपयोग कर एक ChIP परख के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Abstract

जीवों में सेलुलर phenotypes व्यक्त करने के लिए, जीवित कोशिकाओं के अनुसार जीन अभिव्यक्ति निष्पादित, और प्रतिलेखन कार्यक्रम जीन अभिव्यक्ति में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. सेलुलर ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी और इसके क्रोमैटिन संशोधन प्रोटीन प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए समन्वय करते हैं। आणविक स्तर पर प्रतिलेखनात्मक विनियमन का विश्लेषण करने के लिए, कई प्रयोगात्मक तरीकों जैसे इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता बदलाव, क्षणिक रिपोर्टर और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन (ChIP) परख उपलब्ध हैं। हम इस लेख में विस्तार से एक संशोधित ChIP परख का वर्णन है क्योंकि सीधे histone संशोधनों और कोशिकाओं में प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत दिखा में अपने फायदे के. एक सफल ChIP परख में महत्वपूर्ण चरणों में से एक क्रोमैटिन कतरनी है. हालांकि sonication आमतौर पर क्रोमैटिन कतरनी के लिए प्रयोग किया जाता है, यह reproduible शर्तों की पहचान करने के लिए मुश्किल है। sonication द्वारा chromatin कतरनी के बजाय, हम और अधिक reproduible परिणाम प्राप्त करने के लिए micrococcal nuclease (MNase) के साथ एंजाइमी पाचन का उपयोग किया। इस आलेख में, हम MNase का उपयोग कर एक सीधा ChIP परख प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Introduction

स्तनधारी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति कसकर और गतिशील रूप से विनियमित है, और प्रतिलेखन महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। जीन प्रतिलेखन मुख्य रूप से प्रतिलेखन कारकों और histones द्वारा विनियमित है. एक प्रतिलेखन कारक एक प्रोटीन है कि विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है और जीन प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है. ये कारक या तो आरएनए पॉलिमरेज II (पोलीआई) की भर्ती को बढ़ावा देते हैं या रोकते हैं, जो जीनोमिक डीएनए से एमआरएनए संश्लेषण को टेम्पलेट1के रूप में शुरू करता है। हिस्टोन संशोधन जैसे हिस्टोन टेल अवशेषों के एसिटाइलेशन और मिथाइलेशन सकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं और क्रोमैटिन संरचना2को बदलकर जीन प्रतिलेखन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं . चूंकि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन सेलुलर संदर्भ को प्रभावित करते हैं, इसलिए आणविक तंत्र की जांच करना आवश्यक है जिसके द्वारा प्रतिलेखन को नियंत्रित किया जाता है।

तारीख करने के लिए, जीन प्रतिलेखन के विनियमन की जांच के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं. इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (EMSA), यह भी एक जेल पारी परख कहा जाता है, एक प्रोटीन डीएनए बातचीत का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है3. ब्याज की कोशिकाओं से एक परमाणु निकालने एक रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ incubated है (उदाहरण के लिए, 32पी) लेबल डीएनए जांच और एक polyacrylamide जेल पर electrophoresed. इसके autoradiogram से पता चलता है कि डीएनए प्रोटीन परिसर एक जेल में जांच की तुलना में धीमी माइग्रेट. प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी की उपस्थिति में, डीएनए प्रोटीन-एंटीबॉडी परिसर डीएनए प्रोटीन परिसर की तुलना में अधिक धीरे-धीरे जेल में स्थानांतरित हो जाता है। इस supershifted बैंड डीएनए और प्रोटीन के बीच विशिष्ट बंधन से पता चलता है. हालांकि, EMSA केवल एक सेल मुक्त प्रणाली में एक विशिष्ट डीएनए प्रोटीन बातचीत निर्धारित करता है, और इसलिए यह अज्ञात रहता है कि क्या बातचीत रहने वाले कोशिकाओं में प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है. क्षणिक रिपोर्टर परख, आमतौर पर luciferase रिपोर्टर परख कहा जाता है, कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विनियमन पता करने के लिए विकसित किया गया था. आमतौर पर, ब्याज की एक जीन के एक अपस्ट्रीम जीनोमिक क्षेत्र एक पत्रकार प्लाज्मिड में डाला जाता है, क्षणिक कोशिकाओं में transfected, और रिपोर्टर गतिविधि मापा जाता है. विलोपन उत्परिवर्ती की एक किस्म क्षेत्रों है कि जीन विनियमन के लिए जिम्मेदार हैं की पहचान की अनुमति देता है. हालांकि एक पत्रकार परख प्रतिलेखन कारकों और बाध्यकारी डीएनए दृश्यों प्रतिलेखन को नियंत्रित करने की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, इस विधि में एक बड़ा नुकसान है कि एक पत्रकार प्लाज्मिड क्रोमैटिन संरचना से मुक्त है और प्रतिबिंबित नहीं करता है "असली" प्रतिलेखन मशीनरी. इसके अलावा, histone संशोधनों में परिवर्तन प्रणाली द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है.

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेंस (चिप) विधि का विकास जैक्सन और चॉकली की रिपोर्ट पर आधारित था कि फॉर्मेल्डिहाइड संरक्षित क्रोमैटिन संरचना4,5के साथ "पूरे सेल" निर्धारण । तब से, कई संबंधित तकनीकों को विकसित किया गया है औरसुधार 6. ChIP assays में, कोशिकाओं को पार से डीएनए और प्रोटीन को जोड़ने के लिए formaldehyde के साथ तय कर रहे हैं. क्रोमैटिन खंडित होता है और फिर ब्याज के एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा। प्रतिरक्षा परिसर धोया जाता है, और डीएनए शुद्ध है। जीनोम के एक विशेष क्षेत्र के लिए लक्षित प्राइमर के साथ पीसीआर प्रवर्धन जीनोम में ब्याज के प्रोटीन के अधिभोग का पता चलता है।

हालांकि ChIP इस तरह के प्रतिलेखन कारकों और डीएनए के साथ संशोधित histones के रूप में प्रोटीन की बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विधि कुछ कठिनाइयों शामिल है, इस तरह के एक chromatin विखंडन कदम के रूप में, व्यवहार में. Sonication व्यापक रूप से क्रोमैटिन कतरनी के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, यह reproduible शर्तों की पहचान करने के लिए बोझिल है। माइक्रोकोकल न्यूक्लेस (MNase) उपचार क्रोमैटिन कतरनी के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। MNase एक endo-exonuclease है कि डबल-स्ट्रेंड्ड, एकल फैला हुआ, परिपत्र और रैखिक डीएनए और आरएनए को पचा ताक. इष्टतम क्रोमैटिन विखंडन के लिए, क्रोमैटिन और एंजाइम, तापमान, और ऊष्मायन समय की मात्रा सहित शर्तों को निर्धारित करना अपेक्षाकृत आसान है। हमने मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित और सरलीकृत किया है, और हमने एक सरल और पुन: उत्पादनीय विधि की स्थापना की है। इस कागज स्तनधारी कोशिकाओं में MNase का उपयोग कर एक ChIP परख के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है.

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 18.5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) समाधान बनाएं। पीएफए के 0.925 ग्राम, 4.8 एमएल पानी जोड़ें (प्रोटोकॉल के दौरान अल्ट्राप्यूल्यूड वाटर का उपयोग करें) और 50 एमएल शंकु प्लास्टिक ट्यूब में 1 एम KOH का 35 डिग्री सेल्सियस। टोपी को कसकर बंद करें और ट्यूब को 400-600 एमएल ग्लास बीकर में गर्म करें जिसमें माइक्रोवेव का उपयोग करके लगभग 200 एमएल पानी होता है। पानी उबलने शुरू होने से पहले ट्यूब निकालें और पीएफए को भंग करने के लिए ट्यूब को भ्रमित करें। पीएफए कमरे के तापमान को ठंडा करने और बर्फ पर स्टोर करने की अनुमति दें।
    नोट: दोहराएँ हीटिंग और मिश्रण जब तक पीएफए पूरी तरह से घुल. क्रॉसलिंकिंग (चरण 2.1.3) से ठीक पहले पीएफए समाधान तैयार करें।
  2. 1ण्25 एम ग्लाइसिन विलयन बनाइए। 150 एमएल पानी में 14.07 ग्राम ग्लिसिन को भंग करें और 0ण्22 डिग्री मीटर छिद्र-आकार फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ChIP सेल lysis बफर बनाओ. पानी में 378 मिलीग्राम PIPES, 10.6 एमएल 2 एम केसीएल, और 1.25 ग्राम शाखाओं वाले ऑक्टाइलफेनॉक्सी पॉली (एथिलौक्सी)इथेनॉल को भंग करें। पीएच को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम KOH के साथ 8.0 तक समायोजित करें और 250 एमएल तक बनाएं। एक 0.22 डिग्री मीटर pores आकार फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. माइक्रोकोकल न्यूक्लेस (MNase) पाचन बफर बनाओ। 1 एमएल बनाने के लिए, 10x MNase पाचन बफर के 0.1 एमएल मिश्रण, 100x बीएसए समाधान के 10 डिग्री एल, 0.1 M dithiothreitol के 10 डिग्री और पानी की 0.88 एमएल.
  5. बनाओ 1 एम NaHCO3| 50 एमएल पानी में 4.2 ह नाहको3 को भंग करें और 0ण्22 डिग्री मीटर छिद्र-आकार फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  6. 10% सोडियम डोडिसिल सल्फेट (एसडीएस) बनाएं। 50 एमएल पानी में 5 ग्राम एसडीएस को भंग करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  7. elution बफर बनाओ. 1 एम नाहको3के 15 डिग्री एल, 10% एसडीएस के 15 डिग्री एल, और 120 डिग्री सेल्सियस पानी के 150 डिग्री सेल्सियस को एक नमूने के लिए इलुशन बफर के 150 डिग्री सेल्सियस प्राप्त करने के लिए मिलाएं।
    नोट: नमूनों की संख्या के आधार पर आनुपातिक मात्रा बढ़ाएँ।
  8. 3 एम सोडियम ऐसीटेट (पीएच 5-2) समाधान बनाएं। 24.6 ग्राम सोडियम ऐसीटेट एनहाइड्रोस को पानी में घोलें। एसिटिक एसिड के साथ 5.2 करने के लिए पीएच पीएच समायोजित करें और 100 एमएल बनाते हैं। एक 0.22 m pores आकार फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर स्टोर.

2. MNase पाचन शर्तों का निर्धारण

नोट: प्रोटोकॉल के चरण 2 में, VCaP का उपयोग कर एक उदाहरण, मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं प्रस्तुत किया है. किसी भी स्तनधारी सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है; चरणों पर ध्यान दें देखें.

  1. क्रॉसलिंक्ड क्रोमैटिन की तैयारी
    1. DME-उच्च ग्लूकोज में VCaP कोशिकाओं को बनाए रखने के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) पर 37 डिग्री सेल्सियस एक कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में. 3 दिनों के लिए संस्कृति मीडिया और संस्कृति के 4 एमएल में छह 6 सेमी व्यंजन में 4 x 106 कोशिकाओं में बीज VCAP कोशिकाओं.
      नोट: प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया का उपयोग करें. 10 x 106 कोशिकाओं को 6 सेमी या 10 सेमी डिश में बीज दिया जा सकता है। निलंबित कोशिकाओं के लिए, T25 फ्लास्क में बीज कोशिकाओं. व्यंजन या फ्लास्क की संख्या निर्भर करता है कि कितने खुराक MNase पाचन के लिए परीक्षण कर रहे हैं. यदि 4 खुराक का परीक्षण किया जाता है, तो 6 व्यंजन या फ्लास्क तैयार करें। यह भी कदम 2.2 देखें.
    2. trypsin का उपयोग कर एक डिश से VCaP कोशिकाओं को अलग करें और सेल गिनती. एक डिश में सेल नंबर की गणना करें। निलंबित कक्षों के लिए, एक फ्लास्क से सेल निलंबन की एक छोटी राशि निकालें और सेल नंबर की गणना करें।
    3. संस्कृति मीडिया के 4 एमएल में एक 6 सेमी पकवान के लिए 18.5% पीएफए के 0.229 एमएल जोड़ें 1% की अंतिम एकाग्रता पर. धीरे लेकिन अच्छी तरह से एक डिश या फ्लास्क घूमता पीएफए समान रूप से वितरित करने के लिए. बिल्कुल 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      नोट: इस चरण में, क्रोमैटिन और प्रोटीन क्रॉसलिंक किए जाते हैं। के रूप में पीएफए विषाक्त है, एक रासायनिक धूआं हुड में इस कदम को बाहर ले जाने और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण का उपयोग करें.
    4. 10 मिनट के बाद, 125 m की एक अंतिम एकाग्रता में 1.25 M ग्लिसिन समाधान के 0.47 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      नोट: ग्लिसिन आगे क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए अतिरिक्त पीएफए को बेअसर करता है।
    5. ऐस्पायरेट फॉर्मलडिहाइड/ग्लीसिन/संस्कृति मीडिया। 4 एमएल फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) को दो बार जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। निलंबित कोशिकाओं के लिए, कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 15 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रण के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करें। सुपरनेंट को प्रेरित करें और पीबीएस की एक मध्यम मात्रा जोड़ें और पूरी तरह से निलंबित करें। इस चरण को दोहराएँ. तरल अपशिष्टों को ठीक से निपटान करें क्योंकि उनमें फार्मेल्डिहाइड होता है।
    6. पीबीएस के लिए 100x तस्वीर के 1/100 मात्रा जोड़कर प्रोटीज़ और फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी) युक्त पीबीएस तैयार करें। एक डिश से पीबीएस Aspirate और तस्वीर युक्त पीबीएस के पकवान प्रति 1 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को स्क्रैप करें और सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। निलंबित कोशिकाओं के लिए, बस एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण.
    7. सेल गोली ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब। एक पिपेट का उपयोग कर पूरी तरह से PBS निकालें. प्रति ट्यूब कोशिका संख्या को अभिलेखित करें तथा कोशिका गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित कीजिए।
  2. सेल lysis और MNase पाचन
    नोट: निम्नचरणों में अभिकर्मक मात्रा 6 x 106 कोशिकाओं वाली एक ट्यूब पर आधारित होती है। कक्ष संख्या के आधार पर अनुपातिक रूप से अभिकर्मक वॉल्यूम समायोजित करें; जब एक ट्यूब 2 x 106 कोशिकाओं में शामिल हैं, ChIP सेल lysis बफर के 100 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें (चरण 2.2.1), MNase पाचन बफर (चरण 2.2.3), और ChIP कमजोर पड़ने बफर (चरण 2.2.5), और 0.5 M EDTA के 10 $L (pH 8.0) (चरण 2.2.4).
    1. संग्रहीत सेल गोली (VCaP कोशिकाओं, युक्त 6 x 106 ट्यूब प्रति कोशिकाओं) बर्फ पर चरण 2.1.7 में तैयार thaw. 1/100 मात्रा 100x PIC को बफर में जोड़कर PIC के साथ पूरक ChIP सेल lysis बफर तैयार करें। तस्वीर के साथ पूरक ChIP सेल lysis बफर के 300 $L जोड़ें और गोली अच्छी तरह से resuspend. 15 s के लिए ट्यूब भंवर और 10 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन इनक्यूबेट.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और सुपरनेंट को पूरी तरह से हटा दें। MNase पाचन बफर के 300 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित.
    3. 50 जेल इकाइयों को देने के लिए MNase पाचन बफर के साथ Dilute MNase (2,000 जेल इकाई /जेडएल) जोड़ें 0, 0.5, 1, 2, 50 जेल इकाइयों के 4 $L /
      नोट: तालिका 1 कई कक्ष पंक्तियों में MNase के इष्टतम मात्रा दिखाता है।
    4. MNase पाचन और भंवर संक्षेप में समाप्त करने के लिए 0.5 M EDTA (पीएच 8.0) के 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant पूरी तरह से हटा दें।
    5. तैयार ChIP तहलका बफर करने के लिए 100x तस्वीर के 1/100 मात्रा जोड़कर तस्वीर के साथ पूरक. PIC के साथ पूरक ChIP कमजोर पड़ने बफर के 300 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित करें।
    6. एक microtip जांच के साथ सुसज्जित एक sonicator का उपयोग कर बर्फ पर निलंबन Sonicate. आयाम 2, संसाधित समय 15 एस, पल्स पर 5 एस, पल्स बंद 30 एस: निम्नलिखित sonication शर्तों का उपयोग करें। निलंबन के 1 डिग्री सेल्सियस ले लो और एक स्लाइड ग्लास पर हाजिर और उन्हें एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण. सुनिश्चित करें कि सेल संरचना लगभग टूट गया है.
      नोट: चित्र1A से पहले और sonication के बाद VCaP सेल निलंबन के प्रतिनिधि microphotographs से पता चलता है. यह कदम परमाणु झिल्ली को तोड़ने के द्वारा supernatant में पचा क्रोमैटिन जारी करने के लिए है. एक शक्ति सेटिंग अधिकतम शक्ति का कम से कम 5% करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए और एक से अधिक 30 s अंतराल के साथ 5 s तीन बार के लिए sonication का प्रयास करें। यदि वाटेज नियंत्रण उपलब्ध है, तो पावर सेटिंग को 5 W पर समायोजित करें और ऊपर बताए गए अनुसार कुल 15 s के लिए नमूनों को संसाधित करें ताकि 70-75 J. की कुल शक्ति प्रदान की जा सके कि सेल संरचना जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है। यदि पर्याप्त नहीं है, तो एक बार और दोहराएँ. ऊपर वर्णित शर्त व्यावहारिक रूप से परीक्षण सभी सेल लाइनों के लिए लागू किया जाता है.
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और चरण 2.3 के लिए डाइजेस्ट क्रोमैटिन के 20 डिग्री एल को बचाएं। -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष को संग्रहीत करें।
  3. रिवर्स क्रॉसलिंकिंग, डीएनए की शुद्धि, और पचाक्रोटिन का विश्लेषण
    1. एक 1.5 एमएल पेंच ट्यूब में 75 डिग्री सेल्सियस पानी, 5 एम NaCl के 4 डिग्री एल, और 1 प्रोटीने K के 1 $L जोड़ें। पानी युक्त ट्यूबों के लिए चरण 2.2.7 में तैयार विभिन्न MNase पाचन स्थितियों से पचा क्रोमैटिन के 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और प्रोटीने के टोपी को कसकर बंद करें, पूरी तरह से मिश्रण, और ट्यूब को 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम प्रोटीन और डीएनए के बीच crosslinking को हटाने के लिए है.
    2. प्रति स्थिति दो 1.5-एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें। एक 1.5 एमएल ट्यूब में 100 डिग्री सेल्सियस फीनॉल:क्लोरोफॉर्म:आइसोऐमिलकोल्कोल्कोल्कोहल (25:24:1) (पीसीआई) जोड़ें। 3 एम सोडियम ऐसीटेट (पीएच 5-2) के 10 डिग्री सेल्सियस और ग्लाइकोजन के 2 डिग्री एल को अन्य ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: क्लोरोफॉर्म का उपयोग: isoamylalcohol आवश्यक नहीं है7. आयतन में वृद्धि के परिणामस्वरूप एथेनोल वर्षण8के बाद कम डीएनए वसूली हो सकती है .
    3. चरण 2ण्3ण्1 से डाइजेस्ट क्रोमैटिन युक्त ट्यूब को संक्षिप्त रूप से सेंट्रीफ्यूज करें और PCI के 100 डिग्री एल जोड़ें। टोपी कसकर बंद करो, और भंवर तेजी से पायस बनाने के लिए. कमरे के तापमान पर 30 s के लिए अधिकतम गति (उदाहरण के लिए, 20,000 x g) पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    4. ध्यान से डीएनए युक्त ऊपरी चरण लेने के लिए और चरण 2.3.2 में तैयार PCI युक्त ट्यूब में जोड़ें। भंवर जोरदार और 2.3.3 कदम के रूप में ट्यूब centrifuge.
      नोट: यदि निचले चरण दूषित है, तो ट्यूब को फिर से अपकेंद्रण करें, या पहले निचले चरण के अधिकांश को हटा दें, ट्यूब को अपकेंद्रण करें, और ऊपरी चरण लें।
    5. ध्यान से ऊपरी चरण लेने के रूप में चरण 2.3.4 में वर्णित है और सोडियम एसीटेट और ग्लाइकोजन युक्त ट्यूब में जोड़ने के चरण 2.3.2 में तैयार. इथेनॉल के 250 $L जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए व्युत्क्रम और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स। अधिकतम गति पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें (उदाहरण के लिए, 20,000 x g) 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: कमरे के तापमान पर समाधान की इनक्यूबेशन डीएनए वसूली8,9को प्रभावित नहीं करती है .
    6. ट्यूब के तल पर छर्रों की पुष्टि करें. सावधानी से supernatant निकालें ताकि गोली परेशान नहीं है और 70% इथेनॉल के 500 $L जोड़ें. अधिकतम गति पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें (उदाहरण के लिए, 20,000 x g) 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    7. supernatant पूरी तरह से निकालें और कमरे के तापमान पर लगभग 5 मिनट के लिए गोली सूखी. 10 एमएम ट्राइस के 20 डिग्री एल में गोली भंग एचसीएल/1 एमएम EDTA (पीएच 8.0) (टीई)। एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता को मापने।
    8. एक जेल लोड हो रहा डाई के साथ डीएनए के 0.5 डिग्री ग्राम मिक्स और 2% agarose जेल के लिए लागू होते हैं. इलेक्ट्रोफोरीज़ ट्राइस-ऐसीटेट-EDTA बफर में 100 वी पर नमूने जब तक बैंगनी रंग जेल के दो तिहाई करने के लिए चले गए और 10 मिनट के लिए 0.5 g/mL ethidium ब्रोमाइड के साथ एक जेल दाग. जेल की एक तस्वीर ले लो.
      नोट: विवरण के लिए चित्र 2 देखें.

3. क्रोमैटिनइम्युनेमप्रीसेक्स

  1. पचा क्रोमैटिन की तैयारी
    1. कोशिकाओं को तैयार करें। अनुयायी कोशिकाओं के लिए, बीज 2-10 x 106 कोशिकाओं प्रति पकवान में 2 व्यंजन (6 सेमी या 10 सेमी) प्रति उपचार समूह और कोशिकाओं से अधिक 1 दिन के लिए व्यंजन के नीचे करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं। निलंबित कोशिकाओं के लिए, उपचार समूह प्रति 2 T25 फ्लास्क में बीज. कोशिकाओं को वांछित के रूप में समझो।
    2. प्रत्येक समूह से एक डिश या फ्लास्क लें और चरण 2.1.2 में वर्णित कक्ष संख्या की गणना करें। 2.1.3-2.1.7 में उल्लिखित क्रॉसलिंक्ड क्रोमैटिन तैयार करें।
    3. 2-2-2-7 के खंड में वर्णित कोशिका गोली तथा मानस पाचन का वर्णन किया गया है। चरण 2 में निर्धारित के रूप में क्रोमैटिन पचाने के लिए MNase की इष्टतम राशि का उपयोग करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर पचा क्रोमैटिन स्टोर करें।
    4. अपरिवर्स क्रॉसलिंक 20 डिग्री सेल्सियस पचा क्रोमैटिन और शुद्ध डीएनए के रूप में चरण 2.3.8 में वर्णित है। उपाय डीएनए एकाग्रता के रूप में चरण 2.3.7 में वर्णित. इलेक्ट्रोफोरीज़ 2% agarose जेल में नमूने पचा क्रोमैटिन के आकार की जांच के रूप में चरण 2.3 में उल्लेख किया है.
      नोट: डीएनए एकाग्रता चरण 3.1.3 में तैयार संग्रहीत पचा क्रोमैटिन के समान है।
    5. एक रिवर्स क्रॉस से जुड़े पचा क्रोमैटिन नमूना चरण 3.1.4 से पतला करने के लिए पानी के साथ 10 एनजी /
      नोट: इन नमूनों वास्तविक समय पीसीआर मानकों के लिए उपयोग किया जाता है.
  2. प्रतिरक्षण
    नोट:प्रोटोकॉल के चरण 3-2-3.5 में, VCaP कोशिकाओं में एंटी-ट्राइमेथिलेट हिस्टोन H3 lysine 4 (H3K4me3) अधिभोग निर्धारित किया जाता है। चित्र 3भी देखें .
    1. चरण 3.1.3 से थोव पचा क्रोमैटिन। बर्फ पर सभी नमूने रखें.
    2. तैयार ChIP तहलका बफर करने के लिए 100x तस्वीर के 1/100 मात्रा जोड़कर तस्वीर के साथ पूरक. Dilute पाचन क्रोमैटिन करने के लिए 5 g/500 $L के साथ ChIP कमजोर पड़ने बफर तस्वीर के साथ पूरक. तैयार 1,000 $L प्लस अतिरिक्त के लिए (1) nonimmune IgG (नियंत्रण IgG), (2) H3K4me3 के साथ आईपी के साथ आईपी.
    3. एक इनपुट नमूने (एक आईपी के 1%) के रूप में एक 1.5 एमएल पेंच ट्यूब में 5 डिग्री ग्राम/500 जेडएल पचा क्रोमैटिन का 5 डिग्री एल जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें।
    4. एक आईपी नमूने के रूप में एक 1.5 एमएल पेंच ट्यूब में 5 डिग्री सेल्सियस से प्रत्येक 5 डिग्री सेल्सियस/ ट्यूब में एंटीबॉडी का 2 डिग्री ग्राम जोड़ें। टोपी बंद करें और एक कमाल मंच का उपयोग कर कोमल मिश्रण के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट।
      नोट: हालांकि इष्टतम एंटीबॉडी राशि अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, आईपी प्रति 2 डिग्री ग्राम पहली बार में सिफारिश की है.
    5. आईपी प्रति ChIP ग्रेड प्रोटीन जी चुंबकीय मोती के 30 डिग्री एल जोड़ें. एक कमाल मंच का उपयोग कर कोमल मिश्रण के साथ 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट करें।
      नोट: चुंबकीय मोती के prewash आवश्यक नहीं है.
  3. प्रतिरक्षा परिसर को धोना और क्रॉसलिंकिंग को उलटना
    1. 3.2.5 से थोड़ी देर के लिए ट्यूब स्पिन. ट्यूब को 1 मिनट के लिए नियोडिनियम मैग्नेट युक्त पॉलीथीन रैक में रखें। आकांक्षा द्वारा सुपरनेट को सावधानी से हटा दें।
    2. कम नमक प्रतिरक्षा जटिल धोने बफर की ट्यूब प्रति 0.5 एमएल जोड़ें. धीरे दोहन या संक्षेप में ट्यूब भंवर द्वारा मोती प्रसारित करें। एक कमाल मंच का उपयोग कर कोमल मिश्रण के साथ 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट। 5 मिनट के बाद, चरण 3.3.1 दोहराएँ.
    3. ट्यूब प्रति उच्च नमक प्रतिरक्षा जटिल धोने बफर के 0.5 एमएल जोड़ें. फैलाने और चरण 3.3.2 के रूप में मोती धोने. धोने के बाद, चरण 3.3.1 दोहराएँ.
    4. ट्यूब प्रति LiCl प्रतिरक्षा जटिल धोने बफर के 0.5 एमएल जोड़ें. फैलाने और चरण 3.3.2 के रूप में मोती धोने. धोने के बाद, चरण 3.3.1 दोहराएँ.
    5. ट्यूब को चुंबकीय रैक में 1 मिनट के लिए रखें। शेष सुपरनेंट को पूरी तरह से हटा दें।
    6. ट्यूब के लिए elution बफर के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. पूरी तरह से मोती फैलाने के लिए ट्यूब भंवर. टोपी बंद करें और 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट, व्युत्क्रम या भंवर द्वारा मिश्रण हर 5 मिनट मोती अच्छी तरह से फैलाने के लिए।
    7. ऊष्मायन के दौरान, एक 1.5 एमएल पेंच ट्यूब तैयार करें और चरण 3.2.3 में तैयार किए गए 1%3.2.3 में तैयार किए गए 1.5 एमएल पेंच ट्यूब और 5 एम NaCl के 6 डिग्री एल और 2 $L प्रोटीन के K. Thaw 1% इनपुट नमूना जोड़ें। एल्यूशन बफर के 150 डिग्री एल, 5 एम NaCl के 6 डिग्री एल और प्रोटीने K के 2 डिग्री एल 1% इनपुट नमूने के लिए जोड़ें।
    8. ऊष्मायन के बाद, ट्यूब नीचे स्पिन. 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक में ट्यूब प्लेस और NaCl और प्रोटीने कश्मीर चरण 3.3.7 में तैयार युक्त पेंच ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण.
    9. टोपी और भंवर पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए सभी आईपी और इनपुट नमूने बंद करें। ट्यूब को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. डीएनए शोधन
    1. ट्यूब को 2ण्3ण्2 में वर्णित कीजिए तथा 100 र्ल के स्थान पर PCI की 150 र्ल ें को जोड़ें। किसी अन्य नली में 3 उ सोडियम ऐसीटेट (पीएच 5-2) तथा ग्लाइकोजन का 2 डिग्री सेल्सियस का 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ना।
    2. इनक्यूबेटर से ट्यूब निकालें। ट्यूब नीचे स्पिन और PCI के 150 $L जोड़ें.
    3. भंवर जोरदार ट्यूब पायस बनाने के लिए। कमरे के तापमान पर 30 s के लिए अधिकतम गति (उदाहरण के लिए 20,000 x g) पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    4. सावधानी से चरण 3.4.1 में तैयार PCI युक्त ट्यूब के लिए ऊपरी चरण के 140 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण। चरण 3.4.3 दोहराएँ.
      नोट: यह भी देखें 2.3.4 चरण में ध्यान दें.
    5. सावधानी से ऊपरी चरण के 120 डिग्री सेल्सियस को 3-4-1 चरण में तैयार सोडियम एसीटेट और ग्लाइकोजन युक्त ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
      नोट: यह भी देखें 2.3.4 चरण में ध्यान दें.
    6. इथेनॉल के 300 $L जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए व्युत्क्रम और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स।
    7. अधिकतम गति पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें (उदाहरण के लिए, 20,000 x g) 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। चरण 2.3.6 में वर्णित के रूप में गोली धो लें.
    8. चरण 2.3.7 में वर्णित के रूप में गोली सुखाने के बाद, टीई के 50 डिग्री एल में गोली भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर डीएनए टुकड़े की जांच
    1. निम्नलिखित नमूने thaw: (1) नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी, (2) विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी, (3) 1% इनपुट नमूना. Thaw भी कदम 3.1.5 में तैयार मानकों की 4 खुराक (कुल 7 नमूने).
      नोट: इनपुट और आईपी नमूनों में डीएनए मात्रा के परिमाण ीकरण के लिए एक ही समूह से मानकों का उपयोग करें.
    2. 8 नमूनों के लिए पीसीआर कार्य समाधान करें। 2x वास्तविक समय पीसीआर supermix के 40 डिग्री एल मिक्स, 8 $L प्रत्येक के 4 डिग्री सेल्सियस आगे और रिवर्स प्राइमर, और पानी के 8 डिग्री एल.
      नोट: एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण 2x वास्तविक समय पीसीआर supermix के 5 डिग्री एल, 4 डिग्री एम आगे और रिवर्स प्राइमर के प्रत्येक 1 $L, और पानी के 1 डिग्री एल शामिल हैं। प्राइमर अनुक्रमों को सारणी 2में सूचीबद्ध किया गया है।
    3. एक पीसीआर प्लेट के एक कुएं में पीसीआर कार्य समाधान के अलीकोट 8 डिग्री सेल्सियस। चरण 3.4.8 या चरण 3.1.5 से मानकों से नमूनों की 2 $L जोड़ें.
    4. पीसीआर प्लेट को सील करें और निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग करके पीसीआर को चलाएं: 1) प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 2) 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 s के लिए विकृतीकरण के लिए, 3) 56 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 एस के लिए, 4) 72 डिग्री सेल्सियस विस्तार और डेटा संग्रह के लिए 30 s के लिए , 55 चक्रों के लिए चरण 2) से 4) दोहराएँ. साइकिल चालन के बाद, पीसीआर उत्पाद के पिघलने वक्र को मापें। डेटा का विश्लेषण करें.
      नोट: चित्र 3 के कच्चे आंकडे़ सारणी 3में दिखाए गए हैं। एक मानक वक्र का उपयोग कर नमूने की प्रारंभिक मात्रा (SQ) की गणना. 100 से 1% इनपुट में गुणा SQ इनपुट में समायोजित SQ देने के लिए एक आईपी करने के लिए 1% इनपुट नमूने की एक SQ समायोजित करने के लिए (EQ. 1). IP नमूने में विभाजित SQ द्वारा इनपुट में समायोजित SQ % इनपुट मान देने के लिए (प्रतिशत इनपुट विधि, EQ. 2). गुना संवर्धन की गणना करने के लिए, नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी में SQ द्वारा विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी में वर्ग वर्ग विभाजित (गुना संवर्धन विधि, EQ. 3).
      इनपुट में समायोजित SQ - (एसक्यू में 1% इनपुट) x 100 (1)
      H3K4me3 का प्रतिशत इनपुट - 100 x (विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी में SQ) /
      H3K4me3 के तह संवर्धन ( विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी में SQ) /

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Representative Results

क्रोमैटिन डाइजेस्ट िंग एक ChIP परख के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। हमने क्रोमैटिन को पचाने के लिए MNase का उपयोग न्यूक्लिओसम ओलिगोमर का मिश्रण प्राप्त करने के लिए किया। MNase पाचन चरण में, MNase परमाणु झिल्ली के माध्यम से जा सकते हैं और क्रोमैटिन पचाने. हालांकि, पचा क्रोमैटिन झिल्ली के माध्यम से नहीं जा सकता है और नाभिक में रहता है। नाभिक से पचा क्रोमैटिन जारी करने के लिए, संक्षिप्त sonication की जरूरत है। चित्रा 1A से पहले और VCaP सेल निलंबन के sonication के बाद microphotographs से पता चलता है. sonication के बिना, सेल संरचना बरकरार रहती है, यह दर्शाता है कि क्रोमैटिन नाभिक में मौजूद है। एक संक्षिप्त sonication सेल संरचना टूट जाता है, और microphotographs में कोशिकाओं की जाँच संक्षिप्त sonication शर्तों को निर्धारित करने में मदद करता है। हम भी 293T कोशिकाओं में संक्षिप्त sonication के लिए अन्य उदाहरण का प्रतिनिधित्व किया (चित्र 1B) मानव बी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया सेल लाइन, REH कोशिकाओं (चित्र 1C) और मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइन, LNCaP (चित्र 1D) .

चित्र ाहा 2क VCaP कक्षों में MNase की विभिन्न मात्राओं के साथ उपचार के बाद क्रोमैटिन विखंडन दिखाता है। हम इलाज 6 x 106 crosslinked VCaP सेल छर्रों के साथ 0, 50, 100, 200 जेल इकाइयों MNase के 300 डिग्री एल में पाचन बफर के 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर. पचा क्रोमैटिन की शुद्धि के बाद, डीएनए के 500 एनजी का विश्लेषण 2% अगारोस जेल पर किया गया था और एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग दिया गया था। MNase जोड़ने के बिना, एक बहुत ही उच्च आणविक वजन के साथ एक स्मीयर पैटर्न (लेन 1) दिखाई दिया. MNase के अलावा एक सीढ़ी पैटर्न दिया (एन; एक mononucleosome इकाई), दिखा रहा है कि MNase internucleosome (लेन 2-5) को पचाता है. चित्र 2ख एक अनुचित पाचन पैटर्न से पता चलता है. अतिपाचन के परिणामस्वरूप मुख्य रूप से एकाएक्लोसोम उत्पादन हुआ (चित्र 2 ख, लेन 7)। हमें उचित परिस्थितियों का पता लगाना चाहिए जो क्रोमैटिन के टुकड़ों का उत्पादन 900 बीपी तक (एक से पांच न्यूक्लिओसोम; उदा., लेन 5)।

जाँच करने के लिए कि क्या ChIP परख ठीक से किया जाता है, यह परख में उचित नियंत्रण के लिए आवश्यक है. प्रतिरक्षा के लिए, ब्याज के एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से nonimmune IgGs एक नियंत्रण है कि एक ही क्षेत्र के लिए nonspecific बाध्यकारी से पता चलता है के रूप में उपयोग किया जाता है (चर्चा देखें). इसके अलावा, यह दोनों सकारात्मक और नकारात्मक क्षेत्रों में प्रोटीन (आवास) की बाइंडिंग को मापने के लिए सिफारिश की है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि H3K4me3 अधिभोग लगभग एक किलोबेस (केबी) अपस्ट्रीम और प्रतिलेखन प्रारंभ स्थलों के बहाव के बीच वितरित किया जाता है10,11. हम एआर-सकारात्मक VCaP कोशिकाओं में एआर प्रतिलेखन प्रारंभ साइट (एआर-टीएसएस) के 12 केबी बहाव के माध्यम से लगभग 20 केबी अपस्ट्रीम फैले एआर जीनोम में H3K4me3 अधिभोग मापा। इस प्रयोग में प्रयुक्त वीसीएपी कोशिकाओं में क्रोमैटिन का पाचन पैटर्न चित्र 3कमें दिखाया गया था, जो क्रोमैटिन के उचित पाचन को दर्शाता है। H3K4me3 का उच्चतम अधिभोग AR-TSS और 0.5 kb और 1 kb के आसपास AR-TSS के ऊपर देखा गया था (चित्र 3B)। जब तक जीन transcriptionally सक्रिय हैं, TSSs हो सकता है "सकारात्मक क्षेत्रों". 19 kb और 8 kb अपस्ट्रीम और AR-TSS के 12 kb डाउनस्ट्रीम पर स्थित क्षेत्रों, हालांकि, H3K4me3 का थोड़ा अधिभोग था (चित्र 3B),यह दर्शाता है कि इन "नकारात्मक क्षेत्रों" के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

यह दर्शाया गया है कि पीएसए प्रवर्तक में एण्ड्रोजन आरएनए पॉलिमरेज II अधिभोग को बढ़ाता है और 12,13के द्वारा शेरे क्रोमैटिन का उपयोग करके एलएनसीएपी कोशिकाओं में वृद्धि करता है . इसलिए हम सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय अधिभोग को मापने के द्वारा हमारे प्रोटोकॉल की वैधता का परीक्षण किया (फॉस्फोरिलेट आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय सेरीन 5 में; कोशिकाओं में PolII (pS5).. हमने अपनी विधि की पुन: उत्पादनीयता की जांच करने के लिए एक ही प्रयोग किया. LNCaP कोशिकाओं स्टेरॉयड भूखे माध्यम में 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और एक वाहन या 10 एनएम dihydrotestosterone के साथ प्रेरित (DHT) के लिए 4 ज सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय अधिभोग विरोधी PolII (pS5) के साथ इम्यूनोवेरिसेस द्वारा मापा गया था, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पीछा किया. चित्र 4क तीन स्वतंत्र प्रयोगों में एलएनसीएपी कोशिकाओं से क्रोमैटिन का पुनरुत्कर्त्य पाचन पैटर्न दिखाता है। जैसा कि चित्र 4Bमें दिखाया गया है , DHT पीएसए प्रमोटर में PolII (pS5) अधिभोग में काफी वृद्धि हुई है और प्रतिशत इनपुट विधि का उपयोग करते समय बढ़ाने. हमने गुना संवर्धन विधि (चित्र 4 C) का उपयोग करके अधिभोग की गणना भी की और पाया कि पीएसए प्रमोटर में पोलीआई (पीएस5) में कोई महत्वपूर्ण अंतर DHT उपचार के साथ या उसके बिना नहीं देखा गया था। DHT GAPDH प्रमोटर में अधिभोग को प्रभावित नहीं किया के रूप में पहले प्रकाशित14. महत्वपूर्ण बात यह है कि हमारे डेटा sonication-शेर क्रोमैटिन नमूने12,13से प्राप्त करने के लिए इसी तरह के थे .

Figure 1
चित्र 1: sonication से पहले और बाद में crosslinked सेल छर्रों के प्रतिनिधि microphotographs. क्रॉसलिंक्ड वीसीएपी (ए), 293T (बी), आरईएच (सी) और एलएनसीएपी (डी) सेल छर्रों का एमएनसे के साथ इलाज किया गया , और छर्रों को ChIP कमजोर पड़ने बफर में पुन: निलंबित कर दिया गया था । पहले और sonication के बाद, निलंबन की तस्वीरें ले जाया गया. स्केल बार ] 200 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जेपी क्रोमैटिन के प्रतिनिधि agarose जेल विश्लेषण. (ए) क्रॉसलिंक्ड क्रोमैटिन वीसीएपी कोशिकाओं से तैयार किया गया था और चरण 2-2 में वर्णित एमनेसे की विभिन्न मात्रा के साथ पचाया गया था। डाइजेस्ट क्रोमैटिन रिवर्स क्रॉसलिंक्ड, शुद्ध, और एक 2% agarose जेल में विश्लेषण किया गया था। एन; एक मोनोन्यूक्लिओसोम एकक। (बी) वीसीएपी कोशिकाओं के क्रोमैटिन को 2 x 10 6 कोशिकाओं के अनुसार 2x 106 कोशिकाओं की 250 जेल इकाइयों के साथ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पच दिया गया था और विश्लेषण किया गया था (जैसा कि ए में वर्णित है)। MNase और लंबे समय तक ऊष्मायन समय की बड़ी मात्रा में क्रोमैटिन के लगभग पूरा पाचन के कारण mononucleosomes (150 बीपी) के रूप में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एआर जीनोम में H3K4me3 अधिभोग. डाइजेस्ट क्रोमैटिन वीसीएपी कोशिकाओं से तैयार किया गया था। (ए) पाचन पैटर्न एक agarose जेल का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. (बी) पचे हुए क्रोमैटिन के 5 डिग्री ग्राम को या तो सामान्य खरगोश आईजीजी या एंटी-एच 3के4एमई3 एंटीबॉडी के 2 डिग्री ग्राम के साथ प्रतिरक्षाीकृत किया गया था जैसा कि चरण 3-1 और चरण 3.2 में उल्लेख किया गया है। प्रतिरक्षा परिसरों धोया और मोती से eluted थे, और रिवर्स crosslinked. शुद्ध डीएनए के टुकड़ों का विश्लेषण वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके तालिका 2में सूचीबद्ध प्राइमर सेटों के साथ किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एण्ड्रोजन पीएसए प्रमोटर और बढ़ाने में सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय अधिभोग में वृद्धि हुई। स्टेरॉयड भूखे LNCAP कोशिकाओं के साथ या बिना इलाज किया गया 10 nM DHT के लिए 4 ज, और पचा क्रोमैटिन तैयार किया गया था. (क) तीन स्वतंत्र प्रयोगों में एलएनसीएपी कोशिकाओं से क्रोमैटिन का पाचन पैटर्न। (बी,सी) डाइजेस्ट क्रोमैटिन को एंटी-पोलिआई (पी एस 5) एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षाीकृत किया गया था, और डीएनए के टुकड़े को चित्र 3के लिए वर्णित के रूप में शुद्ध किया गया था। पीएसए प्रवर्तक, बढ़ाने और जीएपीडीएच प्रवर्तक में सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज II का अधिभोग एक प्रतिशत इनपुट (बी) और गुना संवर्धन (सी) के रूप में सारणी 2में सूचीबद्ध प्राइमर सेटों के साथ वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था . दिखाए गए परिणामों का अर्थ है - तीन स्वतंत्र प्रयोगों का एसई। (*); पी एंड एल टी;0.05, (**); च ;lt; 0.01 बनाम 0 nM DHT उपचार. एन एस; महत्वपूर्ण नहीं बनाम 0 एनएम DHT. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल लाइन बफर के 100 $L में दो लाख कोशिकाओं के प्रति जेल इकाइयों, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस
एलएनसीएपी 267
वीसीएपी 66.7
293T 450
आरईएच 134
22Rv1 400

तालिका 1: विभिन्न सेल लाइनों में माइक्रोकोकल न्यूक्लीज की इष्टतम मात्रा। मान प्रति 2 x 106 कोशिकाओं में MNase की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है बफर के 100 $L में, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.

प्राइमर नाम अनुक्रम
ए.आर. (-18.8kb) अग्रेषित ATTTGGAACTGGGAACATCT
रेव CACCTCTCCCTCTCTCTCT
ए.आर. (-8.8kb) अग्रेषित TAACAGCTGCATCCAAGT
रेव TGAAATCTGGAAAGCA
ए.आर. (-8.2kb) अग्रेषित CAGTGCTATTCCTGTGAC
रेव TTGGACTGGCTCTCTTTTGA
AR-TSS (0 kb) अग्रेषित जीसीएएसीटीजीसीटीजीसीटीसीटीसी
रेव जीजीसीसीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसी
ए.आर. (0.6 kb) अग्रेषित CACGACCCGTGGTTAG
रेव TGAAGACCTGACTGCCTTC
ए.आर. (+1.0kb) अग्रेषित CCGCAGTTTCTCTGG
रेव सीटीटीसीसीएजीसीसीसीटीएसीटीजीएसीसी
ए.आर. (+11.8kb) अग्रेषित CCTTGCTTGTGGGAACTGTAG
रेव टीटीईटीजीसीटीजीजीजीजीजीसी
पीएसए प्रमोटर अग्रेषित सीसीटीव्हीत जागा
रेव GGGAGGAGGCTAGCACTTG
पीएसए बढ़ाने अग्रेषित जीसीसीटीजीटीसीटीगागाटाकैटसी
रेव एसीएसीटीटीटीटीटीजीजीटीजी
जीएपीडीएच अग्रेषित TACTAGCGGTTACGCG
रेव टीसीजीएजीएजीएजीएजीजीजीएजीजीएजीजीएजीजीए

तालिका 2: जोड़ी प्राइमर दृश्यों ChIP परख के लिए इस्तेमाल किया.

ए.आर. (-18.8kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 23.49 0.815 81.5 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 27.68 0.051 0.051 0.062 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 22.48 1.590 1.590 1.951 31.4
ए.आर. (-8.8kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 23.22 0.586 58.6 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 26.81 0.052 0.052 0.088 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 23.74 0.414 0.414 0.706 8.0
ए.आर. (-8.2kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 23.19 0.643 64.3 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 26.99 0.048 0.048 0.075 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 23.63 0.477 0.477 0.742 9.9
AR-TSS (0 kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 25.06 0.657 65.7 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 28.63 0.050 0.050 0.077 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 20.70 15.064 15.064 22.944 299.8
ए.आर. (0.6 kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 23.86 0.716 71.6 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 26.67 0.106 0.106 0.147 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 19.15 17.787 17.787 24.840 168.6
ए.आर. (+1.0kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 23.51 0.730 73.0 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 25.94 0.125 0.125 0.171 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 19.06 18.486 18.486 25.335 147.8
ए.आर. (+11.8kb) सीक्यू वर्ग एक आईपी में समायोजित % इनपुट फ़ोल्ड समृद्धि
1% इनपुट 24.54 0.876 87.6 100
नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी 29.14 0.033 0.033 0.037 1
विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी 24.47 0.918 0.918 1.048 27.97

तालिका 3: चित्र 3 के लिए मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण से कच्चे डेटा. सीक्यू: थ्रेशहोल्ड चक्र संख्या, SQ: एक मानक वक्र का उपयोग कर गणना मात्रा शुरू, एक आईपी करने के लिए समायोजित: 100 से 1% इनपुट में गुणा SQ के रूप में 1% एक आईपी का नमूना मात्रा पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है, % इनपुट: इनपुट में समायोजित SQ द्वारा आईपी नमूना में वर्ग विभाजित, गुना संवर्धन : नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी में SQ द्वारा विरोधी H3K4me3 के साथ आईपी में SQ विभाजित.

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Discussion

sonication आमतौर पर खंडित क्रोमैटिन प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह समय लेने वाली और प्रजनन ीय स्थितियों की पहचान करने के लिए बोझिल है। इस प्रोटोकॉल में, हम MNase पाचन का इस्तेमाल किया क्योंकि एंजाइम पाचन reproduible स्थितियों की पहचान करने के लिए आसान होना चाहिए. MNase पाचन के बाद एक संक्षिप्त sonication कदम (चरण 2.2 देखें) कोशिका झिल्ली को तोड़ने के लिए और पचा क्रोमैटिन जारी करने के लिए आवश्यक था। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल में sonication शक्ति के रूप में संभव के रूप में कम होना चाहिए. हम उन सभी कोशिकाओं के लिए एक ही sonication शर्तों का उपयोग करते हैं जिन्हें हम नियोजित करते हैं (चित्र 1 और तालिका 1देखें ) झिल्ली के पूर्ण विश्लेषण को प्राप्त करने के लिए।

MNase द्वारा क्रोमैटिन का पाचन हमारे प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, और इस प्रकार हम कोशिकाओं के अंदर chromatin के पाचन के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए काफी प्रयास किया है. पाचन गतिविधि एंजाइम और सब्सट्रेट (क्रोमेटिन) और ऊष्मायन समय की मात्रा से निर्धारित होता है। इसके अलावा, के बाद से गुणा विभिन्न कोशिकाओं के बीच बदलता है, MNase पाचन के लिए इष्टतम शर्तों प्रत्येक सेल प्रकार के लिए पहचान की जानी चाहिए. एक बार स्थापित, एक ही शर्तों सेल उपचार के बावजूद लागू किया जा सकता है. हम हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग में क्रोमैटिन पाचन पैटर्न की जांच करते हैं कि पाचन पैटर्न ChIP assays के लिए उपयुक्त हैं, जैसा कि चित्र 2A,लेन 5 में दिखाया गया है।

कुछ कारक ों ChIP assays के परिणामों को प्रभावित करते हैं. यह हमारे प्रोटोकॉल में पचा क्रोमैटिन की सही मात्रा का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई प्रोटोकॉल में, सेल संख्या लेकिन एक आईपी के लिए क्रोमैटिन की मात्रा नहीं दिखाया गया है15,16. इन प्रयोगात्मक स्थितियों loidy मतभेद के कारण कोशिकाओं के बीच क्रोमैटिन की मात्रा में उच्च परिवर्तनशीलता का उत्पादन. हम परख में एक आईपी प्रति एंटीबॉडी के 5 डिग्री ग्राम और 2 डिग्री का उपयोग करते हैं, इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक सरल और स्पष्ट है, हालांकि आईपी के लिए एंटीबॉडी की इष्टतम मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। एंटीबॉडी का चयन भी महत्वपूर्ण है; का उपयोग करें ChIP परख मान्य एंटीबॉडी.

ChIP PCR डेटा का विश्लेषण करने के लिए दो विधियाँ हैं: प्रतिशत इनपुट विधि और गुना संवर्धन विधि. प्रतिशत इनपुट विधि में, आईपी नमूनों से संकेतआईपी नमूने में कुल क्रोमैटिन से संकेतों से विभाजित हैं। गुना संवर्धन विधि में, इस तरह के H3K4me3 के रूप में एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ आईपी से संकेत नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी से विभाजित कर रहे हैं। बाद में विधि केवल लागू होता है जब नियंत्रण आईजीजी के साथ आईपी से संकेत समान हैं और विभिन्न शारीरिक स्थितियों के तहत कई लक्ष्यों या समान लक्ष्यों पर reproduible. व्यवहार में, संकेत स्तर भिन्न होते हैं तो गुना संवर्धन मान उच्च परिवर्तनशीलता है के रूप में चित्र 4Cमें दिखाया गया है. इसलिए, हम अपनी विधि में ChIP डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए गुना संवर्धन विधि का उपयोग करने की अनुशंसा नहीं करते हैं।

MNase एक euchromatin 'खुला' वातावरण के पक्ष में है और एक विषमवर्णता संरचना के लिए सुलभ नहीं है, सुझाव है कि MNase पाचन कुछ पूर्वाग्रह का उत्पादन हो सकता है. यह सूचित किया गया है कि लेमिन ए-इंटरैक्टिंग क्रोमैटिन डोमेन का संवर्धन sonication-sheared और MNase-पचा हुआ क्रोमैटिन तैयारी17के बीच में अलग है। इस प्रकार, ChIP परख में MNase पाचन ऐसे lamin A/C और विशेष एटी अमीर अनुक्रम बाइंडिंग प्रोटीन 1 (SATB1) के रूप में परमाणु संरचना से जुड़े अणुओं का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।

नीचे की ओर microarray (ChIP-on-chip) या अनुक्रमण (ChIP-सेक) विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किए गए ChIP परख प्रोटोकॉल में, RNase डीएनए शोधन चरण के दौरान प्रयोग किया जाता है, हालांकि पीसीआर विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल में नहीं18. हम परीक्षण नहीं किया है कि क्या हमारे प्रोटोकॉल ChIP-on-chip और ChIP-सेक विश्लेषण के साथ संगत है, लेकिन हम मानते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल लागू है जब नमूने RNase के साथ इलाज कर रहे हैं. यदि आरएनसे उपचार की आवश्यकता है, तो चरण 3.3 में प्रोटीनेस के बजाय 10 मिलीग्राम/एमएल DNase-मुक्त RNase A के 2 $L का उपयोग करें और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। डीएनए को शुद्ध करने से पहले (चरण 3-4), प्रोटीने के और 60 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 1 एच के लिए इनक्यूबेट जोड़ें।

हम नियमित रूप से संशोधित histone और प्रतिलेखन यहाँ वर्णित विधि का उपयोग कर कारकों के साथ ChIP assays बाहर ले और पता चला है कि क्रोमैटिन remodeling कारक, एटी अमीर बातचीत डोमेन 5B, POLII के अधिभोग को बदलकर एआर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है ( pS5) और H3K4me3 AR प्रमोटरमें 19| हमें विश्वास है कि हमारे प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से अन्य ChIP assays की तुलना में आसान है और व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में स्वीकार्य है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध के सिटी ऑफ होप के लिए Genentech रॉयल्टी द्वारा समर्थित है. यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा पूरे या आंशिक रूप से समर्थित नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2x iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

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References

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जेनेटिक्स अंक 147 जीन विनियमन हिस्टोन संशोधन क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन माइक्रोकोकल न्यूक्लेस आरएनए पॉलिमरेज II ट्राइमेथिलेट हिस्टोन एच 3 लाइसिन 4
क्रोमैटिन इम्यूनोएमिनेशन असेसे मैमलियन सेल में माइक्रोकोकल न्यूक्लेस का उपयोग करते हुए
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Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin… More

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

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