Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kromatin Immunutfelling analysen bruke Micrococcal Nukleaser i pattedyrceller

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59375
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Kromatin immunutfelling (ChIP) er et kraftig verktøy for å forstå den molekylære mekanismer av gen regulering. Imidlertid innebærer metoden vanskeligheter med å få reproduserbar kromatin fragmentering av mekanisk klipping. Her gir vi en forbedret protokoll for en ChIP-analysen ved hjelp av enzymatisk fordøyelsen.

Abstract

Å uttrykke cellulære fenotyper i organismer, levende celler utføre genuttrykk tilsvarende, og transcriptional programmer spille en sentral rolle i genuttrykk. Den cellulære transcriptional maskiner og dens kromatin modifikasjon proteiner koordinere å regulere transkripsjon. Å analysere transcriptional regulering på molekylnivå, flere eksperimentelle metoder som Elektroforetiske mobilitet SKIFT, forbigående reporter og kromatin immunutfelling (ChIP) analyser er tilgjengelige. Vi beskriver en modifisert ChIP analysen i detalj i denne artikkelen på grunn av sine fordeler i direkte viser histone modifikasjoner og samspillet mellom proteiner og DNA i cellene. En av de viktigste trinnene i en vellykket ChIP-analysen er kromatin klipping. Selv om sonikering brukes ofte for klipping kromatin, er det vanskelig å identifisere reproduserbar forhold. I stedet for klipping kromatin ved sonikering, benyttet vi enzymatisk fordøyelse med micrococcal nuklease (MNase) for å få mer reproduserbar resultater. I denne artikkelen gir vi en grei ChIP analysen protokoll ved hjelp MNase.

Introduction

Gene uttrykk i pattedyrceller er tett og dynamisk regulert, og transkripsjon er en av de viktigste trinnene. Gene transkripsjon er hovedsakelig regulert av transkripsjon faktorer og histoner. En transkripsjon faktor er et protein som binder seg til bestemte DNA-sekvenser og styrer genet transkripsjon. Disse faktorene enten fremme eller hemme rekrutteringen av RNA polymerase II (PolII), som initierer mRNA syntese fra genomisk DNA som en mal1. Histone modifikasjoner som acetylering og metylering av histone hale rester positivt og negativt påvirke genet transkripsjon ved å endre kromatin struktur2. Siden endringer i genet uttrykk påvirker mobilnettet sammenheng, er det viktig å undersøke den molekylære mekanismer som transkripsjon er regulert.

Hittil flere metoder for å undersøke regulering av genet transkripsjon er tilgjengelig. Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA), også kalt en gel-Shift-analysen, brukes til å analysere en protein-DNA interaksjon3. Et kjernefysisk ekstrakt fra celler av interesse er inkubert med en radioaktiv isotop (for eksempel 32P)-merket DNA-sonde og electrophoresed på en polyakrylamid gel. Dens autoradiogram viser at DNA-proteinet komplekset migrerer saktere enn sonden i en gel. I nærvær av et antistoff mot proteinet migrerer DNA-protein-antistoff-komplekset i en gel saktere enn DNA-proteinet. Dette supershifted bandet avslører spesifikk binding mellom DNA og protein. Imidlertid, EMSA bare bestemmer en spesifikk DNA-protein vekselvirkningen inne en cellen-ledig system, og derfor den restene ubekjent hvorvidt samspillet kontroller transkripsjon inne leverceller. Den forbigående reporter analysen, ofte kalt luciferase reporter analysen, ble utviklet for å ta genuttrykk regulering i cellene. Vanligvis en oppstrøms genomisk regionen av et gen av interesse er satt inn i en reporter plasmider, midlertidig transfekterte i celler, og reporteren aktiviteten måles. En rekke sletting mutanter tillater identifisering av regioner som er ansvarlig for gen regulering. Selv om en reporter analysen er et nyttig verktøy for å identifisere transkripsjon faktorer og bindende DNA-sekvenser kontrollerende transkripsjon, har denne metoden en stor ulempe i at en reporter plasmider er fri for kromatin struktur og reflekterer ikke "ekte" transkripsjon maskiner. I tillegg kan ikke endringer i histone endringer bestemmes av systemet.

Utviklingen av kromatin immunutfelling (ChIP) metoden var basert på Jackson og Chalkley ' s rapporter om at "hele cellen" fiksering med formaldehyd bevarte kromatin struktur4,5. Siden da har mange relaterte teknikker er utviklet og forbedret6. I ChIP analyser, celler er festet med formaldehyd å kryss-link DNA og proteiner. Kromatin er fragmentert og deretter immunoprecipitated med antistoffer av interesse. Immun komplekset er vasket, og DNA er renset. PCR forsterkning med grunning rettet mot en bestemt region av Genova avslører belegg av proteiner av interesse i Genova.

Selv om ChIP er et kraftig verktøy for å identifisere interaksjoner av proteiner som transkripsjon faktorer og modifisert histoner med DNA, innebærer metoden noen vanskeligheter, for eksempel en kromatin fragmentering trinn, i praksis. Sonikering har vært mye brukt for klipping kromatin; Det er imidlertid tungvint å identifisere reproduserbar forhold. Micrococcal nuklease (MNase) behandling er en alternativ metode for kromatin klipping. MNase er en Endo-exonuclease som fordøyer dobbel-strandet, enkelt-strandet, sirkulær og lineær DNA og RNA. Det er relativt enkelt å bestemme forholdene, inkludert mengder av kromatin og enzym, temperatur og inkubasjonstid, for optimal kromatin fragmentering. Vi endret og forenklet eksisterende protokoller, og vi etablerte en grei og reproduserbar metode. Dette papiret gir protokollen for en ChIP-analysen ved hjelp MNase i pattedyrceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av reagenser

  1. Lag 18,5% paraformaldehyde (PFA) løsning. Tilsett 0,925 g av PFA, 4,8 mL vann (bruk ultrapurified vann gjennom hele protokollen) og 35 μL av 1 M KOH i et 50 mL konisk plastrør. Lukk lokket tett og varm røret i et 400-600 mL glass beger inneholdende ca. 200 mL vann ved hjelp av en mikrobølgeovn. Fjern røret før vannet begynner å koke og Vortex røret for å oppløse PFA. La PFA avkjøles til romtemperatur og oppbevares på is.
    Merk: Gjenta oppvarming og miksing til PFA oppløses helt. Forbered PFA løsning umiddelbart før Cross Linking (trinn 2.1.3).
  2. Lag 1,25 M Glycine løsning. Løs opp 14,07 g Glycine i 150 mL vann og Filtrer gjennom et filter i størrelse på 0,22 μm. Oppbevares ved 4 ° c.
  3. Lag ChIP cellelyse Rings buffer. Løs opp 378 mg rør, 10,6 mL 2 M KCl, og 1,25 g octylphenoxy Poly (ethyleneoxy) etanol i vann. Juster pH til 8,0 med 1 M KOH ved 4 ° c og utgjør opptil 250 mL. Filtrer gjennom et filter for pore-størrelse på 0,22 μm og oppbevares ved 4 ° c.
  4. Gjør micrococcal nuklease (MNase) fordøyelsen buffer. For å lage 1 mL, bland 0,1 mL av 10x MNase fordøyelsen buffer, 10 μL av 100 mL oppløsning, 10 μL av 0,1 M dithiotreitol og 0,88 vann.
  5. Lag 1 M NaHCO3. Løs opp 4,2 g av NaHCO3 i 50 ml vann og Filtrer gjennom et filter i størrelse på 0,22 μm. Oppbevares ved romtemperatur.
  6. Lag 10% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS). Oppløsning 5 g SDS i 50 mL vann. Oppbevares ved romtemperatur.
  7. Gjør eluering buffer. Bland 15 μL av 1 M NaHCO3, 15 μL av 10% SDS og 120 μL vann for å oppnå 150 μL av eluering buffer for en prøve.
    Merk: Øk volumet proporsjonalt avhengig av antall prøver.
  8. Lag 3 M natrium acetate (pH 5,2) løsning. Oppløse 24,6 g natrium acetate vannfri i vannet. Juster pH til 5,2 med eddiksyre og utgjør 100 mL. Filtrer gjennom en 0,22 μm pore-størrelse filter og oppbevar ved romtemperatur.

2. fastsettelse av MNase fordøyelsen betingelser

Merk: I trinn 2 av protokollen, et eksempel ved hjelp av VCaP, er menneskelige prostata kreftceller presentert. Eventuelle pattedyr cellelinjer kan brukes; se merknad på trappen.

  1. Utarbeidelse av krysskoblet kromatin
    1. Opprettholde VCaP celler i DME-High glukose supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c i en karbondioksid inkubator. Seed VCaP celler på 4 x 106 celler i seks 6 cm retter i 4 ml kultur Media og kultur for 3 dager.
      Merk: Bruk passende kultur medier for hver cellelinje. Opptil 10 x 106 celler kan bli sådd i en 6 cm eller 10 cm rett. For suspenderte celler, frø celler i T25 flasker. Antall retter eller flasker avhenger av hvor mange doser som er testet for MNase fordøyelse. Hvis 4 doser testes, klargjør du 6 retter eller flasker. Se også trinn 2,2.
    2. Løsne VCaP-celler fra en tallerken ved hjelp av Trypsin, og Tell cellen. Beregn celle nummer i en tallerken. For suspenderte celler, Fjern en liten mengde celle suspensjon fra en kolbe og telle celle nummer.
    3. Tilsett 0,229 mL 18,5% PFA til en 6 cm rett i 4 mL kultur medier ved en endelig konsentrasjon på 1%. Forsiktig, men grundig virvel en tallerken eller kolbe å distribuere PFA jevnt. Ruge ved romtemperatur i nøyaktig 10 min.
      Merk: I dette trinnet, kromatin og proteiner er krysskoblet. Når PFA er giftig, kan du utføre dette trinnet i en kjemisk avtrekks hette og bruke riktig personlig verneutstyr.
    4. Etter 10 min, tilsett 0,47 mL 1,25 M Glycine oppløsning ved en endelig konsentrasjon på 125 mM. Ruge ved romtemperatur i 5 min.
      Merk: Glycine nøytraliserer overflødig PFA å stoppe ytterligere Cross Linking.
    5. Aspirer formaldehyd/Glycine/kultur Media. Vask cellene ved å tilsette 4 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger. For suspenderte celler, Overfør celle fjæringen til et 15 mL konisk rør og sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og legge til ett medium volum av PBS og fullt suspendere. Gjenta dette trinnet. Kasser væske avfall på riktig måte siden de inneholder formaldehyd.
    6. Forbered PBS som inneholder protease og fosfatase inhibitor cocktail (PIC) ved å legge til 1/100 volum på 100% PIC til PBS. Aspirer PBS fra en tallerken og tilsett 1 mL per fat PBS inneholder PIC. Skrape cellene og overføre celle suspensjonen til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube. For suspenderte celler, bare overføre suspensjonen til en 1,5 mL rør.
    7. Sentrifuger rør ved 3 000 x g i 5 min ved romtemperatur for å gjenopprette celle pellet. Fjern PBS helt ved hjelp av en pipette. Noter celle nummeret per rør og oppbevar celle pellet ved-80 ° c.
  2. Cellelyse og MNase fordøyelse
    Merk: Reagens volumet i følgende trinn er basert på ett rør som inneholder 6 x 106 celler. Juster reagens volumet proporsjonalt avhengig av celle nummer; Når en tube inneholder 2 x 106 celler, bruk 100 ΜL av ChIP cellelyse buffer (trinn 2.2.1), MNase fordøyelsen buffer (trinn 2.2.3), og ChIP fortynning buffer (trinn 2.2.5), og 10 μL av 0,5 M EDTA (pH 8,0) (trinn 2.2.4).
    1. Tin den lagrede celle pellet (VCaP celler, som inneholder 6 x 106 celler per tube) fremstilt i trinn 2.1.7 på isen. Forbered ChIP cellelyse Rings buffer supplert med PIC ved å legge til 1/100 volum på 100% PIC til bufferen. Tilsett 300 μL av ChIP cellelyse Rings buffer supplert med PIC og resuspend pellet grundig. Vortex røret for 15 s og ruge suspensjonen på isen i 10 min.
    2. Sentrifuger på 9 000 x g i 3 min ved 4 ° c og fjern supernatanten helt. Resuspend pellet i 300 μL av MNase fordøyelsen buffer.
    3. Fortynne MNase (2 000 gel Unit/μL) med MNase fordøyelsen buffer for å gi 50 gel enheter/μL. Tilsett 0, 0,5, 1, 2, 4 μL av 50 gel enheter/μL av MNase til suspensjonen og ruge ved 37 ° c for nøyaktig 10 min, miksing ved å vende hver 2,5 min.
      Merk: tabell 1 viser optimale mengder MNase i flere cellelinjer.
    4. Tilsett 30 μL av 0,5 M EDTA (pH 8,0) for å avslutte MNase fordøyelse og Vortex kort. Ruge i 5 minutter på isen. Sentrifuger på 9 000 x g i 5 min ved 4 ° c og fjern supernatanten helt.
    5. Forbered ChIP fortynning buffer supplert med PIC ved å legge 1/100 volum på 100% PIC til bufferen. Resuspend av pellet i 300 μL av ChIP fortynning buffer supplert med PIC.
    6. Sonikere suspensjonen på isen ved hjelp av en sonicator utstyrt med en mikrotip sonde. Bruk følgende sonikering betingelser: amplitude 2, behandlet tid 15 s, puls på 5 s, puls av 30 s. Ta 1 μL av suspensjonen og få øye på et glass og observere dem ved hjelp av et mikroskop. Kontroller at cellestrukturen er nesten ødelagt.
      Merk: Figur 1a viser representative Microphotographs av VCaP celle suspensjonen før og etter sonikering. Dette trinnet er for å slippe fordøyd kromatin inn i supernatanten ved å bryte kjernefysiske membraner. En strøminnstilling bør justeres til mindre enn 5% av maksimal effekt og prøve sonikering for 5 s tre ganger med mer enn en 30 s intervall. Hvis wattstyrke kontroll er tilgjengelig, justere strøminnstillingen til 5 W og behandle prøvene for totalt 15 s som nevnt ovenfor for å gi total effekt på 70-75 J. Kontroller om cellestrukturen er brutt som nevnt ovenfor. Hvis ikke nok, gjentar en gang. Betingelsen beskrevet ovenfor er praktisk talt brukt på alle cellelinjer testet.
    7. Sentrifuger ved 9 000 x g i 10 min ved 4 ° c, Overfør supernatanten til en ny 1,5 ml mikrosentrifugen tube, og spar 20 μL av fordøyd kromatin for trinn 2,3. Oppbevar rest ved-80 ° c.
  3. Reverse Cross Linking, rensing av DNA, og analyse av fordøyd kromatin
    1. Tilsett 75 μL av vann, 4 μL av 5 M NaCl og 1 μL av proteinase K til en 1,5 mL skrue slange. Tilsett 20 μL av fordøyd kromatin fra ulike MNase fordøyelsen forhold utarbeidet i trinn 2.2.7 til rør som inneholder vann, NaCl, og proteinase K. Lukk hetten tett, bland helt, og ruge røret ved 65 ° c over natten.
      Merk: Dette trinnet er for fjerning av Cross Linking mellom protein og DNA.
    2. Forbered to 1,5-mL mikrosentrifugen rør per tilstand. Tilsett 100 μL av fenol: kloroform: isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) til ett 1,5 mL rør. Tilsett 10 μL av 3 M natrium acetate (pH 5,2) og 2 μL av glykogen til et annet rør.
      Merk: Bruk av kloroform: isoamylalcohol er ikke nødvendig7. Økende volum kan resultere i lav DNA-utvinning etter etanol nedbør8.
    3. Sentrifuger røret som inneholder fordøyd kromatin fra trinn 2.3.1 kort og tilsett 100 μL av PCI. Lukk hetten tett, og Vortex kraftig for å danne emulsjon. Sentrifuger røret med maksimal hastighet (f. eks 20 000 x g) i 30 s ved romtemperatur.
    4. Forsiktig ta den øvre fasen inneholder DNA og legge til røret som inneholder PCI fremstilt i trinn 2.3.2. Vortex kraftig og sentrifuger røret som trinn 2.3.3.
      Merk: Hvis nedre fase er forurenset, sentrifuger røret igjen, eller fjerne det meste av den nedre fasen først, sentrifuger røret, og ta den øvre fasen.
    5. Nøye ta den øvre fasen som beskrevet i trinn 2.3.4 og legge til røret som inneholder natrium acetate og glykogen fremstilt i trinn 2.3.2. Tilsett 250 μL av etanol. Bland ved inversjon og ruge i 10 min ved romtemperatur. Sentrifuger røret med maksimal hastighet (f. eks 20 000 x g) i 30 min ved 4 ° c.
      Merk: Inkubasjons av løsningen ved romtemperatur påvirker ikke DNA utvinning8,9.
    6. Bekreft pellets på undersiden av røret. Fjern forsiktig supernatanten for ikke å forstyrre pellet og tilsett 500 μL av 70% etanol. Sentrifuger røret med maksimal hastighet (f. eks 20 000 x g) i 5 min ved 4 ° c.
    7. Fjern supernatanten helt og tørk pellet i ca 5 min ved romtemperatur. Løs opp pellet i 20 μL av 10 mM Tris · HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Mål DNA konsentrasjon ved hjelp av en UV spektrofotometer.
    8. Bland 0,5 μg av DNA med et fargestoff for gel lasting og påfør til 2% agarose gel. Electrophorese prøvene på 100 V i Tris-acetate-EDTA buffer til lilla fargestoff migrert til den to tredjedel av gel og beis en gel med 0,5 μg/mL etidiumbromid bromide i 10 min. Ta et bilde av gelen.
      Merk: Se figur 2 for detaljer.

3. ChromatinImmunoprecipitation

  1. Utarbeidelse av fordøyd kromatin
    1. Forbered thecells. For tilhenger celler, frø 2-10 x 106 celler per tallerken i 2 retter (6 cm eller 10 cm) per behandling gruppe og la cellene til å feste til bunnen av rettene i mer enn 1 dag. For suspenderte celler, frø i 2 T25 flasker per behandlingsgruppe. Behandle cellene etter behov.
    2. Ta en tallerken eller kolbe fra hver gruppe og telle celle nummer som beskrevet i trinn 2.1.2. Forbered krysskoblet kromatin som nevnt i trinn 2.1.3-2.1.7.
    3. Lyse celle pellet og MNase fordøyelsen som beskrevet i trinn 2.2.1-2.2.7. Bruk den optimale mengden MNase til å fordøye kromatin som angitt i trinn 2. Store fordøyd kromatin ved-80 ° c.
    4. Reverse krysskobling 20 μL av fordøyd kromatin og renser DNA som beskrevet i trinn 2.3.8. Mål DNA-konsentrasjonen som beskrevet i trinn 2.3.7. Electrophorese prøvene i 2% agarose gel å sjekke størrelsen på fordøyd kromatin som nevnt i trinn 2,3.
      Merk: DNA-konsentrasjonen er identisk med lagret fordøyd kromatin fremstilt i trinn 3.1.3.
    5. Fortynne en omvendt tverrbundet fordøyd kromatin prøve fra trinn 3.1.4 å gi 10 ng/μL med vann og serielt fortynne å gjøre konsentrasjoner av 1, 0,1, og 0,01 ng/μL. oppbevares ved-20 ° c.
      Merk: Disse prøvene brukes for sann tids PCR-standarder.
  2. Immunutfelling
    Merk: i trinnene 3.2-3.5 av protokollen, anti-Trimethylated histone H3 lysin 4 (H3K4me3) belegg i VCaP celler bestemmes. Se også Figur 3.
    1. Tin fordøyd kromatin fra trinn 3.1.3. Behold alle prøvene på isen.
    2. Forbered ChIP fortynning buffer supplert med PIC ved å legge 1/100 volum på 100% PIC til bufferen. Fortynne fordøyd kromatin til 5 μg/500 μL med ChIP fortynning buffer supplert med PIC. Forbered 1 000 μL pluss ekstra for (1) IP med nonimmune IgG (Control IgG), (2) IP med H3K4me3.
    3. Tilsett 5 μL av 5 μg/500 μL fordøyd kromatin til et 1,5 mL skrue rør som inngangs prøve (1% av en IP). Oppbevar prøven ved-80 ° c.
    4. Tilsett 500 μL hver av 5 μg/500 μL fordøyd kromatin til et 1,5 mL skrue rør som et IP-utvalg. Tilsett 2 mikrogram antistoffer mot slangen. Steng hetten og ruge røret ved 4 ° c over natten med skånsom miksing ved hjelp av en rocking plattform.
      Merk: Selv om optimalt antistoff beløp bør fastsettes empirisk, anbefales 2 μg per IP først.
    5. Legg 30 μL av ChIP-grade protein G magnetiske perler per IP. Ruge røret ved 4 ° c for 2 t med skånsom miksing ved hjelp av en rocking plattform.
      Merk: Forvask av magnetiske perler er ikke nødvendig.
  3. Vasking immun kompleks og reversere Cross Linking
    1. Snurr ned røret fra trinn 3.2.5 kort. Plasser røret i en polyetylen rack som inneholder neodinium magneter i 1 min. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
    2. Tilsett 0,5 mL per rør av lav salt immun kompleks vaskebuffer. Spre perlene ved å trykke forsiktig eller kort virvlingen røret. Ruge røret ved 4 ° c i 5 min med skånsom miksing ved hjelp av en rocking plattform. Etter 5 min, Gjenta trinn 3.3.1.
    3. Tilsett 0,5 mL høy salt immun kompleks vaskebuffer per tube. Spre og vask perlene som trinn 3.3.2. Etter vask, Gjenta trinn 3.3.1.
    4. Tilsett 0,5 mL LiCl immun kompleks vaskebuffer per tube. Spre og vask perlene som trinn 3.3.2. Etter vask, Gjenta trinn 3.3.1.
    5. Plasser røret i et magnetisk stativ i 1 min. Fjern de resterende supernatanten helt.
    6. Tilsett 150 μL av eluering buffer i slangen. Vortex røret for å spre perlene helt. Steng hetten og ruge røret ved 65 ° c i 30 min, bland ved inversjon eller virvlingen hver 5 min for å spre perlene grundig.
    7. Under inkubasjons, klargjør du et 1,5 mL skrue rør og tilsett 6 μL av 5 M NaCl og 2 μL av proteinase K. Tin 1% input prøve fremstilt i trinn 3.2.3. Tilsett 150 μL av eluering buffer, 6 μL av 5 M NaCl og 2 μL av proteinase K til 1% inngangs prøve.
    8. Etter inkubasjons, snurr ned røret. Plasser røret i et magnetisk rack i 1 min og Overfør supernatanten til skruen røret som inneholder NaCl og proteinase K forberedt i trinn 3.3.7.
    9. Lukk hetten og Vortex alle IP og innspill prøver å blande helt. Ruge røret ved 65 ° c over natten.
  4. DNA-rensing
    1. Klargjør røret som beskrevet i 2.3.2 og tilsett 150 μL av PCI i stedet for 100 μL. I et annet rør, tilsett 12 μL av 3 M natrium acetate (pH 5,2) og 2 μL av glykogen.
    2. Fjern røret fra inkubator. Snurr ned røret og tilsett 150 μL av PCI.
    3. Vortex kraftig røret for å danne emulsjon. Sentrifuger røret med maksimal hastighet (f.eks. 20 000 x g) i 30 s ved romtemperatur.
    4. Overfør nøye 140 μL av den øvre fasen til røret som inneholder PCI klargjort i trinn 3.4.1. Gjenta trinn-3.4.3.
      Merk: Se også merknad i trinn 2.3.4.
    5. Forsiktig overføre 120 μL av øvre fase til røret som inneholder natrium acetate og glykogen fremstilt i trinn 3.4.1.
      Merk: Se også merknad i trinn 2.3.4.
    6. Tilsett 300 μL av etanol. Bland ved inversjon og ruge i 10 min ved romtemperatur.
    7. Sentrifuger røret med maksimal hastighet (f. eks 20 000 x g) i 30 min ved 4 ° c. Vask pellet som beskrevet i trinn 2.3.6.
    8. Etter tørking av pellet som beskrevet i trinn 2.3.7, oppløse pellet i 50-μL av TE. Oppbevares ved-20 ° c.
  5. Påvisning av DNA-fragmenter ved bruk av PCR i sanntid
    1. Tin følgende prøver: (1) IP med Control IgG, (2) IP med anti-H3K4me3, (3) 1% input sample. Tin også 4 doser av standarder utarbeidet i trinn 3.1.5 (totalt 7 prøver).
      Merk: Bruk standarder fra samme gruppe for kvantifisering av DNA-beløp i input og IP-prøver.
    2. Gjør PCR arbeids løsning for 8 prøver. Bland 40 μL av 2x sanntids PCR-Supermix, 8 μL hver av 4 μM forover og bakover primere, og 8 μL vann.
      Merk: Én PCR reaksjons blanding inneholder 5 μL av 2x sanntids PCR-Supermix, 1 μL hver av 4 μM fremover og revers primere, og 1 μL vann. Primer sekvenser er listet i tabell 2.
    3. Alikvot 8 μL av PCR-arbeids løsning i én brønn av en PCR-plate. Tilsett 2 μL prøver fra trinn 3.4.8 eller standarder fra trinn 3.1.5.
    4. Forsegle PCR-platen og kjøre PCR ved hjelp av følgende betingelser: 1) 95 ° c i 3 min for innledende denaturering, 2) 95 ° c i 10 s for denaturering, 3) 56 ° c i 30 s for annealing, 4) 72 ° c til 30 s for utvidelse og datainnsamling , gjentar du trinn 2) til 4) for 55 sykluser. Etter sykling, måle en smeltende kurve av PCR produktet. Analyser dataene.
      Merk: Rådata for Figur 3 er vist i tabell 3. Beregn Start mengde (SQ) av prøvene ved hjelp av en standard kurve. Multipliser SQ i 1% input av 100 for å justere en SQ på 1% input prøven til en IP for å gi justert SQ i input (EQ. 1). Dividere SQ inne IP eksemplar av innstilt SQ inne input å gir% input salgsverdi (prosenten input metoden, EQ. 2). Å beregne fold berikelse, dividere SQ i IP med anti-H3K4me3 av SQ i IP med kontroll IgG (fold berikelse metode, EQ. 3).
      Justert SQ i input = (SQ i 1% input) x 100 (1)
      Prosent input av H3K4me3 = 100 x (SQ i IP med anti-H3K4me3)/(justert SQ i input) (2)
      Fold berikelse av H3K4me3 = (SQ i IP med anti-H3K4me3)/(SQ i IP med kontroll IgG) (3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordøye kromatin er en av de viktige skritt for en ChIP analysen. Vi brukte MNase å fordøye kromatin å få en blanding av nucleosome oligomers. I MNase fordøyelsen trinn, MNase kan gå gjennom kjernefysiske membran og fordøye kromatin. Imidlertid kan det fordøyd kromatin ikke gå gjennom membranen og forblir i kjerner. For å løsne de fordøyd kromatin fra kjerner, er kort sonikering nødvendig. Figur 1a viser microphotographs før og etter Sonikering av VCaP celle fjæring. Uten sonikering forblir cellestrukturen intakt, noe som indikerer at kromatin er til stede i kjernene. En kort sonikering bryter cellestrukturen, og kontroll av cellene i microphotographs bidrar til å bestemme den korte sonikering forhold. Vi representerte også andre eksempler for kort sonikering i 293T celler (figur 1B) den menneskelige B-celle akutt lymfatisk leukemi cellelinje, REH celler (figur 1C) og den menneskelige prostata kreftcelle linje, LNCaP (figur 1d).

Figur 2a viser kromatin fragmentering etter behandling med forskjellige mengder MNase i VCaP-celler. Vi behandlet 6 x 106 krysskoblet VCaP celle pellets med 0, 50, 100, 200 gel enheter av MNase i 300 μL av fordøyelsen buffer for 10 min ved 37 ° c. Etter rensing av fordøyd kromatin, 500 ng av DNA ble analysert på 2% agarose gel og beiset med etidiumbromid bromide. Uten å legge MNase, en smøre mønster med en svært høy molekylvekt dukket opp (Lane 1). Tillegg av MNase ga en stige mønster (N; en mononucleosome enhet), som viser at MNase fordøyer internucleosome (baner 2-5). Figur 2b viser en upassende fordøyelse mønster. Overdigestion resulterte hovedsakelig i mononucleosome produksjon (figur 2b, Lane 7). Vi bør finne de riktige forholdene som produserer kromatin fragmenter opp til 900 BP (en til fem nucleosomes; f. eks, Lane 5).

For å sjekke om ChIP-analysen er utført på riktig måte, er det viktig å ha riktige kontroller i analysen. For immunutfelling, nonimmune IgG fra samme art som antistoffer av interesse brukes som en kontroll som viser ikke-spesifikk binding til samme region (se diskusjon). I tillegg er det anbefalt å måle bindingen av proteiner (belegg) i både positive og negative regioner. Det har vært allment akseptert at H3K4me3 Occupancy er fordelt mellom omtrent en kilobase (KB) oppstrøms og nedstrøms av transkripsjon Start sites10,11. Vi målte H3K4me3 Occupancy i AR Genova spenner ca 20 KB oppstrøms gjennom 12 kb nedstrøms av AR transkripsjon Start site (AR-TSS) i AR-positive VCaP celler. Fordøyelsen mønster av kromatin i VCaP celler som brukes i dette eksperimentet ble vist i figur 3a, noe som indikerer riktig fordøyelse av kromatin. Den høyeste belegg på H3K4me3 ble observert rundt AR-TSS og 0,5 kb og 1 kb oppstrøms av AR-TSS (figur 3b). Så lenge genene er transcriptionally aktive, kan TSSs være "positive regioner". Regioner som ligger på 19 KB og 8 KB oppstrøms og 12 kb nedstrøms av AR-TSS, men hadde lite belegg av H3K4me3 (figur 3b), noe som indikerer at disse kan brukes som "negative regioner".

Det har vist seg at en androgen øker RNA polymerase II Occupancy i PSA promoter og Enhancer i LNCaP celler ved hjelp av skåret kromatin ved sonikering12,13. Vi testet derfor gyldigheten av vår protokoll ved å måle aktiv RNA polymerase II-belegg (fosforylert RNA polymerase II ved Serine 5; PolII (pS5)) i cellene. Vi utførte det samme eksperimentet for å sjekke reproduserbarheten i metoden vår. LNCaP celler ble kultivert i steroid sultet medium for 3 dager og stimulert med et kjøretøy eller 10 nM dihydrotestosteron (DHT) for 4 h. aktiv RNA polymerase II-belegg ble målt ved immunutfelling med anti-PolII (pS5), etterfulgt av PCR i sanntid. Figur 4a viser en reproduserbar fordøyelse mønster av Kromatin fra LNCaP celler i tre uavhengige eksperimenter. Som vist i figur 4b, DHT betydelig økt PolII (pS5) BELEGG i PSA promoter og Enhancer ved bruk av prosent input metoden. Vi har også beregnet belegg med fold berikelse metoden (figur 4c) og fant at ingen signifikant forskjell i PolII (pS5) i PSA arrangøren ble observert med eller uten DHT behandling. DHT påvirket ikke belegg i GAPDH promoter som tidligere utgitt14. Viktigst, våre data var lik som Hentet fra sonikering-skåret kromatin prøver12,13.

Figure 1
Figur 1: Representative microphotographs av krysskoblet celle pellets før og etter sonikering. Krysskoblet VCaP (A), 293T (B), REH (C) og LNCaP (D) celle pellets ble behandlet med MNase, og pellets ble resuspendert i ChIP fortynning buffer. Før og etter sonikering ble bilder av suspensjoner tatt. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative agarose gel analyse av fordøyd kromatin. (A) krysskoblet kromatin ble utarbeidet fra VCaP celler og fordøyd med ulike mengder MNase som beskrevet i trinn 2,2. Fordøyd kromatin var omvendt krysskoblet, renset, og analysert i en 2% agarose gel. N en mononucleosome enhet. (B) Kromatin av VCaP celler ble fordøyd med 250 gel enheter av MNase per 2 x 106 celler ved 37 ° c i 20 min og analysert (som beskrevet i A). Større mengder MNase og lengre inkubasjons ganger forårsaket nesten fullstendig fordøyelse av kromatin å danne mononucleosomes (150 BP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: H3K4me3 belegg i AR-Genova. Fordøyd kromatin ble utarbeidet fra VCaP celler. (A) fordøyelsen mønsteret ble analysert ved hjelp av en agarose gel. (B) 5 μg av fordøyd kromatin ble immunoprecipitated med 2 mikrogram enten normal kanin IgG eller anti-H3K4me3 antistoff som nevnt i trinn 3,1 og trinn 3,2. Uimottakelig komplekser ble vasket og eluert fra perler, og omvendt krysskoblet. Renset DNA-fragmenter ble analysert ved hjelp av sann tids PCR med primer settene listet opp i tabell 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Androgen økt aktiv RNA POLYMERASE II belegg i PSA promoter og Enhancer. Steroid-sultet LNCaP celler ble behandlet med eller uten 10 nM DHT for 4 h, og fordøyd kromatin var forberedt. (A) fordøyelsen mønster av Kromatin fra LNCaP celler i tre uavhengige eksperimenter. (B,C) Fordøyd kromatin var immunoprecipitated med et anti-PolII (pS5) antistoff, og DNA-fragmenter ble renset som beskrevet for Figur 3. Det Occupancy av aktiv RNA polymerase II i PSA promoter, Enhancer, og GAPDH promoter som en prosent input (B) og fold berikelse (C) ble bestemt ved hjelp av sanntids PCR med primer settene oppført i tabell 2. Resultatene som vises er gjennomsnittlig ± SE av tre uavhengige eksperimenter. (*); p < 0,05, (* *); p < 0,01 versus 0 nM DHT behandling. NS ikke signifikant versus 0 nM DHT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cellelinje gel enheter per 2 000 000 celler i 100 μL av buffer, 37 ° c i 10 min
LNCaP 267
VCaP 66,7
293T 450
REH 134
22Rv1 400

Tabell 1: Optimal mengde micrococcal nuklease i ulike cellelinjer. Verdien representerer beløpene MNase per 2 x 106 celler i 100 μL av buffer, 37 ° c i 10 min.

Primer navn Sekvens
AR (-18.8 KB) Fwd ATTTGGAACTGGGAACATCT
Rev CACCTTCTCTCCTCCACTCT
AR (-8.8 KB) Fwd TAACAGCTTTGCATCCAAGT
Rev TGAAATCTGGGACTAAAGCA
AR (-8.2 KB) Fwd CAGTGCTATTCCCTTGTGAC
Rev TTGGACTGGCTCTATCTTGA
AR-TSS (0 kB) Fwd GCAAACTGTTGCATTTGCTC
Rev GGCCCTTTTTCCCTCTGTC
AR (0,6 KB) Fwd CACGACCCGCCTGGTTAG
Rev TGAAGACCTGACTGCCTTTTC
AR (+ 1.0 kB) Fwd CCGCAAGTTTCCTTCTCTGG
Rev CTTCCCAGCCCTAACTGCAC
AR (+ 11.8 KB) Fwd CCTTGCTTGTGGAACTGTAG
Rev TTTATTGTCTGGTGCTAGGC
PSA-promoter Fwd CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA
Rev GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG
PSA Enhancer Fwd GCCTGGATCTGAGAGAGATATCATC
Rev ACACCTTTTTTTTTCTGGATTGTTG
GAPDH Fwd TACTAGCGGTTTTACGGGCG
Rev TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA

Tabell 2: Sammenkoblet primer sekvenser som brukes for ChIP-analysen.

AR (-18.8 KB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 23,49 0,815 81,5 100
IP med kontroll IgG 27,68 0,051 0,051 0,062 1
IP med anti-H3K4me3 22,48 1,590 1,590 1,951 31,4
AR (-8.8 KB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 23,22 0,586 58,6 100
IP med kontroll IgG 26,81 0,052 0,052 0,088 1
IP med anti-H3K4me3 23,74 0,414 0,414 0,706 8,0
AR (-8.2 KB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 23,19 0,643 64,3 100
IP med kontroll IgG 26,99 0,048 0,048 0,075 1
IP med anti-H3K4me3 23,63 0,477 0,477 0,742 9,9
AR-TSS (0 kB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 25,06 0,657 65,7 100
IP med kontroll IgG 28,63 0,050 0,050 0,077 1
IP med anti-H3K4me3 20,70 15,064 15,064 22,944 299,8
AR (0,6 KB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 23,86 0,716 71,6 100
IP med kontroll IgG 26,67 0,106 0,106 0,147 1
IP med anti-H3K4me3 19,15 17,787 17,787 24,840 168,6
AR (+ 1.0 kB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 23,51 0,730 73,0 100
IP med kontroll IgG 25,94 0,125 0,125 0,171 1
IP med anti-H3K4me3 19,06 18,486 18,486 25,335 147,8
AR (+ 11.8 KB) Cq Sq Justert til en IP % Inngang Fold berikelse
1% inngang 24,54 0,876 87,6 100
IP med kontroll IgG 29,14 0,033 0,033 0,037 1
IP med anti-H3K4me3 24,47 0,918 0,918 1,048 27,97

Tabell 3: Rådata fra KVANTITATIV PCR-analyse for figur 3. Cq: terskel syklus nummer, SQ: Startantall beregnet ved hjelp av en standard kurve, justert til en IP: multiplisere SQ i 1% input av 100 som 1% sample volum av en IP brukes til PCR,% input: dividere SQ i IP-prøven ved justert SQ i input, fold berikelse : dividere SQ i IP med anti-H3K4me3 av SQ i IP med kontroll IgG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om sonikering vanligvis brukes til å få fragmentert kromatin, er det tidkrevende og tungvint å identifisere reproduserbar forhold. I denne protokollen, brukte vi MNase fordøyelsen fordi enzymet fordøyelsen bør være lettere å identifisere reproduserbar forhold. En kort sonikering trinn etter MNase fordøyelsen (se trinn 2,2) var nødvendig å bryte cellemembranen og å slippe fordøyd kromatin. Derfor bør sonikering makt i protokollen vår være så lav som mulig. Vi bruker de samme lyd behandlings betingelsene for alle cellene vi brukte (se figur 1 og tabell 1) for å få fullstendig oversikt over membranen.

Fordøyelse av kromatin av MNase er et kritisk skritt i vår protokoll, og dermed har vi hatt stor innsats for å optimalisere forholdene for fordøyelsen av kromatin inne i cellene. Fordøyelsen aktivitet bestemmes av mengder enzym og substrat (kromatin) og inkubasjonstid. I tillegg, siden ploidy varierer mellom ulike celler, må de optimale forholdene for MNase fordøyelsen identifiseres for hver celle type. Når etablert, kan de samme forholdene brukes uavhengig av celle behandlinger. Vi sjekker alltid kromatin fordøyelsen mønstre i hvert eksperiment for å sikre at fordøyelsen mønstrene er egnet for ChIP analyser, som vist i figur 2a, Lane 5.

Noen faktorer påvirker resultatene av ChIP analyser. Det er viktig å bruke riktig mengde fordøyd kromatin i protokollen vår. I mange protokoller vises celle nummeret, men ikke mengden kromatin for én IP,15,16. Disse eksperimentelle forholdene gir høy variasjon i mengden av kromatin blant cellene på grunn av ploidy forskjeller. Vi bruker 5 mikrogram kromatin og 2 mikrogram antistoff per IP i analysen, og derfor er vår protokoll mer enkel og klarere enn andre protokoller, selv om optimale mengder antistoff for IP kan være nødvendig. Valget av antistoffer er også viktig; bruke ChIP analysen-validerte antistoffer.

Det er to metoder for å analysere ChIP PCR data: prosent input metoden og flippen berikelse metoden. I inndatametoden prosent deles signaler fra IP-prøver av signaler fra total kromatin i IP-prøven. I fold berikelse metoden, signaler fra IP med et spesifikt antistoff som H3K4me3 er delt av signaler fra IP med kontroll IgG. Den senere metoden gjelder bare når signaler fra IP med kontroll IgG er like og reproduserbar på flere mål eller identiske mål under de ulike fysiologiske forhold. I praksis, signalet nivåene varierer slik fold berikelse verdien har høy variasjon som vist i figur 4c. Derfor anbefaler vi ikke å bruke fold berikelse metoden til å representere ChIP data i vår metode.

MNase favoriserer en euchromatin "åpne" miljø og er ikke tilgjengelig for en heterochromatin struktur, noe som tyder på at MNase fordøyelsen kan gi noen bias. Det har blitt rapportert at berikelse av Lamin A-samspill kromatin domener er forskjellig mellom sonikering-skåret og MNase-fordøyd kromatin forberedelser17. Dermed kan MNase fordøyelsen i ChIP-analysen ikke være egnet til å analysere kjernefysisk struktur-tilknyttede molekyler som Lamin A/C og spesielle AT-Rich sekvens binding protein 1 (SATB1).

I ChIP analysen protokoller beregnet for nedstrøms Microarray (ChIP-on-ChIP) eller sekvensering (ChIP-SEQ) analyser, RNase brukes under DNA rensing trinn, men ikke i protokoller beregnet for PCR analyser18. Vi har ikke testet om vår protokoll er kompatibel med ChIP-on-chip og ChIP-SEQ analyser, men vi antar at vår protokoll er gjeldende når prøvene er behandlet med RNase. Hvis RNase-behandling er nødvendig, bruk 2 μL av 10 mg/mL DNase RNase A i stedet for proteinase K i trinn 3,3 og ruge ved 65 ° c over natten. Før rensing av DNA (trinn 3,4), tilsett proteinase K og ruge i ytterligere 1 time ved 60 ° c.

Vi rutinemessig utføre ChIP analyser med modifisert histone og transkripsjon faktorer ved hjelp av metoden beskrevet her, og har vist at kromatin remodeling faktor, AT-Rich interaksjon domene 5B, regulerer AR genuttrykk ved å endre belegg av PolII ( pS5) og H3K4me3 i AR arrangøren19. Vi tror at vår protokoll er teknisk enklere enn andre ChIP analyser og er allment akseptabelt i molekylærbiologi forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen er støttet av Genentech royalties til City of Hope. Dette arbeidet støttes ikke helt eller delvis av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2x iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Tags

Genetikk gen regulering histone modifikasjon kromatin immunutfelling micrococcal nuklease RNA polymerase II trimethylated histone H3 lysin 4
Kromatin Immunutfelling analysen bruke Micrococcal Nukleaser i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin… More

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter