Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59375
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Abstract

Per esprimere i fenotipi cellulari negli organismi, le cellule viventi eseguono l'espressione genica di conseguenza e i programmi trascrizionali svolgono un ruolo centrale nell'espressione genica. Il macchinario trascrittorio cellulare e le sue proteine di modificazione della cromatina si coordinano per regolare la trascrizione. Per analizzare la regolazione trascrizionale a livello molecolare, sono disponibili diversi metodi sperimentali come lo spostamento della mobilità elettroforetica, i saggi di immunoprecipitazioni transitori e cromatina (ChIP). Descriviamo un saggio ChIP modificato in dettaglio in questo articolo a causa dei suoi vantaggi nel mostrare direttamente le modifiche degli istoni e le interazioni tra proteine e DNA nelle cellule. Uno dei passi chiave di un saggio ChIP di successo è la tosatura della cromatina. Anche se la sonicazione è comunemente usata per la tosatura della cromatina, è difficile identificare le condizioni riproducibili. Invece di tosare la cromatina mediante sonicazione, abbiamo utilizzato la digestione enzimatica con nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere risultati più riproducibili. In questo articolo viene fornito un semplice protocollo ChIP assay usando MNase.

Introduction

L'espressione genica nelle cellule dei mammiferi è regolata in modo stretto e dinamico, e la trascrizione è uno dei passi chiave. La trascrizione genica è regolata principalmente da fattori di trascrizione e istoni. Un fattore di trascrizione è una proteina che si lega a specifiche sequenze di DNA e controlla la trascrizione genica. Questi fattori promuovono o inibiscono il reclutamento di RNA polimerasi II (PolII), che avvia la sintesi di mRNA dal DNA genomico come modello1. Le modifiche istonicome l'acetilazione e la metilazione dei residui della coda istone irto influenzano positivamente e negativamente la trascrizione genica cambiando la struttura della cromatina2. Poiché le alterazioni nell'espressione genica influenzano il contesto cellulare, è essenziale esaminare i meccanismi molecolari con cui la trascrizione è regolata.

Ad oggi, sono disponibili diversi metodi per studiare la regolazione della trascrizione genica. L'analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del cambio di gel, viene utilizzato per analizzare un'interazione proteina-DNA3. Un estratto nucleare proveniente da cellule di interesse viene incubato con una sonda di DNA con etichettatura isotoma radioattiva (ad esempio, 32P) ed elettroforise su un gel poliacrilammide. Il suo autoradiogramma mostra che il complesso DNA-proteinmi migra più lentamente della sonda in un gel. In presenza di un anticorpo contro la proteina, il complesso DNA-protein-anticorpo migra in un gel più lentamente del complesso DNA-protein. Questa banda supershiftata rivela un legame specifico tra il DNA e la proteina. Tuttavia, EMSA determina solo una specifica interazione DNA-proteina in un sistema privo di cellule, e quindi rimane sconosciuto se l'interazione controlla la trascrizione nelle cellule viventi. Il saggio transitorio del reporter, comunemente chiamato luciferasi reporter assay, è stato sviluppato per affrontare la regolazione dell'espressione genica nelle cellule. Tipicamente, una regione genomica a monte di un gene di interesse viene inserita in un plasmide reporter, trascinata transitoriamente in cellule e viene misurata l'attività del reporter. Una varietà di mutanti delezione consente l'identificazione delle regioni che sono responsabili della regolazione genica. Anche se un saggio reporter è uno strumento utile per identificare i fattori di trascrizione e rilegare le sequenze di DNA che controllano la trascrizione, questo metodo ha un grave svantaggio in quanto un plasmide reporter è privo di struttura cromatica e non riflette "reale" macchinari per la trascrizione. Inoltre, le modifiche ai istoni non possono essere determinate dal sistema.

Lo sviluppo del metodo di immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) si è basato sui rapporti di Jackson e Chalkley che la fissazione "intera cellula" con formaldeide conservava la struttura della cromatina4,5. Da allora, molte tecniche correlate sono state sviluppate e migliorate6. Nei saggi ChIP, le cellule sono fissate con formaldeide per collegare in modo incrociato DNA e proteine. La cromatina viene frammentata e quindi immunoprecipitata con anticorpi di interesse. Il complesso immunitario viene lavato e il DNA viene purificato. L'amplificazione PCR con primer destinati a una particolare regione del genoma rivela l'occupazione di proteine di interesse nel genoma.

Anche se ChIP è un potente strumento per identificare le interazioni di proteine come fattori di trascrizione e istoni modificati con il DNA, il metodo comporta alcune difficoltà, come una fase di frammentazione della cromatina, in pratica. La Sonicazione è stata ampiamente utilizzata per la tosatura della cromatina; tuttavia, è ingombrante identificare le condizioni riproducibili. Il trattamento nucleale micrococcale (MNase) è un metodo alternativo per la tosatura della cromatina. MNase è un endo-exonuclease che digerisce DNA e RNA a doppio filamento, a filamento singolo, circolare e lineare. È relativamente facile determinare le condizioni, comprese le quantità di cromatina e enzima, temperatura e tempo di incubazione, per la frammentazione ottimale della cromatina. Abbiamo modificato e semplificato i protocolli esistenti e abbiamo stabilito un metodo semplice e riproducibile. Questo documento fornisce il protocollo per un saggio ChIP che utilizza MNase nelle cellule dei mammiferi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti

  1. Soluzione di paraformaldeide (PFA) del 18,5%. Aggiungere 0,925 g di PFA, 4,8 mL di acqua (utilizzare acqua ultrapurificata per tutto il protocollo) e 35 L da 1 M KOH in un tubo di plastica conica da 50 mL. Chiudere il tappo e riscaldare il tubo in un becher di vetro da 400-600 mL contenente circa 200 mL di acqua utilizzando un forno a microonde. Rimuovere il tubo prima che l'acqua inizi a bollire e vortice il tubo per sciogliere PFA. Lasciare raffreddare la PFA a temperatura ambiente e conservarlo sul ghiaccio.
    NOT: Ripetere il riscaldamento e la miscelazione fino a quando il PFA non si scioglie completamente. Preparare la soluzione PFA immediatamente prima del collegamento incrociato (passaggio 2.1.3).
  2. Crea una soluzione di glicina da 1,25 M. Sciogliere 14,07 g di glicina in 150 mL d'acqua e filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni porose. Conservare a 4 gradi centigradi.
  3. Creare il buffer di lisi delle celle ChIP. Sciogliere 378 mg di PIPES, 10,6 mL di 2 M KCl e 1,25 g di poli(etileneossia) ramificata in acqua. Regolare il pH a 8,0 con 1 M KOH a 4 gradi centigradi e fino a 250 mL. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori e conservare a 4 gradi centigradi.
  4. Creare buffer di digestione nuclease micrococcale (MNase). Per fare 1 mL, mescolare 0,1 mL di 10x Tampone di digestione MNase, 10 -L di 100x soluzione BSA, 10 -L di 0,1 M dithiothreitol e 0,88 mL di acqua.
  5. Fare 1 M NaHCO3. Sciogliere 4,2 g di NaHCO3 in 50 mL di acqua e filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori. Conservare a temperatura ambiente.
  6. Fai 10% solfato di dodecyl di sodio (SDS). Sciogliere 5 g di SDS in 50 mL di acqua. Conservare a temperatura ambiente.
  7. Fare buffer di eluizione. Mescolare 15 L di 1 M NaHCO3, 15 l di 10% SDS e 120 L di acqua per ottenere 150 L di buffer di eluizione per un campione.
    NOT: Aumentare i volumi proporzionalmente a seconda del numero di campioni.
  8. Crea una soluzione di acetato di sodio da 3 M (pH 5.2). Sciogliere 24,6 g di anidrodo di acetato di sodio in acqua. Regolare il pH a 5,2 con l'acido acetico e fino a 100 mL. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 m di dimensioni pori e conservarlo a temperatura ambiente.

2. Determinazione delle condizioni di digestione di MNase

NOT: Nel passaggio 2 del protocollo, viene presentato un esempio utilizzando VCaP, cellule tumorali della prostata umana. Eventuali linee cellulari di mammiferi possono essere utilizzate; vedere Nota ai passaggi.

  1. Preparazione della cromatina collegata
    1. Mantenere le cellule VCaP in glucosio alto DME, integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un incubatore di anidride carbonica. Cellule VCaP di semi a 4 x 106 cellule in sei piatti 6 cm in 4 mL di coltura e coltura per 3 giorni.
      NOT: Utilizzare i supporti di impostazioni cultura appropriati per ogni riga di cella. Fino a 10 x 106 cellule possono essere semiin un piatto di 6 cm o 10 cm. Per le cellule sospese, le cellule di semi nei flaconi T25. Il numero di piatti o flaconi dipende da quante dosi vengono testate per la digestione di MNase. Se vengono testate 4 dosi, preparare 6 piatti o fiasche. Vedere anche il passaggio 2.2.
    2. Staccare le cellule VCaP da un piatto utilizzando la trypsin e contare la cella. Calcolare il numero di cellulare in un piatto. Per le celle sospese, rimuovi una piccola quantità di sospensione cellulare da un pallone e numero di cella di conteggio.
    3. Aggiungere 0,229 mL di 18,5% PFA a un piatto di 6 cm in 4 mL di mezzi di coltura ad una concentrazione finale dell'1%. Ruotare delicatamente ma accuratamente un piatto o una fiaschetta per distribuire uniformemente l'PFA. Incubare a temperatura ambiente per esattamente 10 min.
      NOT: In questa fase, la cromatina e le proteine sono interconnesse. Poiché la PFA è tossica, eseguire questo passaggio in una cappa di fumi chimici e utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale.
    4. Dopo 10 min, aggiungere 0,47 mL di soluzione di glicina da 1,25 M ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOT: La glicina neutralizza l'eccesso di PFA per arrestare un ulteriore crosslinking.
    5. Anpirati fordeide/glicina/cultura media. Lavare le cellule aggiungendo 4 mL di salina con buffer fosfato (PBS) due volte. Per le cellule sospese, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere un volume medio di PBS e sospendere completamente. Ripetere questo passaggio. Smaltire correttamente i rifiuti liquidi poiché contengono formaldeide.
    6. Preparare PBS contenente proteasi e forista inibitore di fosfosi (PIC) aggiungendo 1/100 volume di 100x PIC a PBS. Aspirare PBS da un piatto e aggiungere 1 mL per piatto di PBS contenente PIC. Raschiare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Per le celle sospese, è sufficiente trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 mL.
    7. Centrifuga tubi a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente per recuperare il pellet cellulare. Rimuovere completamente il PBS utilizzando una pipetta. Registrare il numero di cella per tubo e conservare il pellet della cella a -80 gradi centigradi.
  2. Lisi e digestione di MNase
    NOT: Il volume del reagente nei passaggi seguenti si basa su un tubo contenente 6 x 106 celle. Regolare il volume del reagente in modo proporzionale a seconda del numero di cella; quando un tubo contiene 2 x 106 celle, utilizzare 100 l of ChIP cell lysis buffer (passaggio 2.2.1), buffer di digestione MNase (passaggio 2.2.3) e buffer di diluizione ChIP (passaggio 2.2.5) e 10 L di 0,5 M EDTA (pH 8.0) (passaggio 2.2.4).
    1. Scongelare il pellet cellulare immagazzinato (cellule VCaP, contenente 6 x 106 cellule per tubo) preparato al punto 2.1.7 sul ghiaccio. Preparare il buffer di lisi della cella ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Aggiungere 300 l di buffer di lisi della cella ChIP integrato con PIC e sospendere accuratamente il pellet. Vorticare il tubo per 15 s e incubare la sospensione sul ghiaccio per 10 min.
    2. Centrifuga a 9.000 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e rimuovere completamente il supernatante. Risospendere il pellet in 300 -L di buffer di digestione MNase.
    3. Diluire MNase (2.000 unità gel/L) con tampone di digestione MNase per dare 50 unità di gel/L. Aggiungere 0, 0,5, 1, 2, 4 luna di 50 unità di gel/ l una di MNase alla sospensione e incubare a 37 gradi centigradi per esattamente 10 min, mescolando per inversione ogni 2,5 min.
      NOTA: la tabella 1 mostra le quantità ottimali di MNase in diverse linee cellulari.
    4. Aggiungete 30 di EDTA di 0,5 M (pH 8,0) per terminare brevemente la digestione e il vortice di MNase. Incubare per 5 min sul ghiaccio. Centrifuga a 9.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere completamente il supernatante.
    5. Preparare il buffer di diluizione ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Risospendere il pellet in 300 l di buffer di diluizione ChIP integrato con PIC.
    6. Sonicare la sospensione sul ghiaccio utilizzando un sonicatore dotato di una sonda a microtip. Utilizzare le seguenti condizioni di sonicazione: ampiezza 2, tempo elaborato 15 s, impulso ON 5 s, impulso OFF 30 s. Prendere 1 l'l delle sospensioni e accorciare su un vetrino e osservarle con un microscopio. Assicurarsi che la struttura della cella sia quasi spezzata.
      NOT: La figura 1A mostra microfotografie rappresentative della sospensione cellulare VCaP prima e dopo la sonicazione. Questo passo è per rilasciare la cromatina digerita nel supernatante rompendo le membrane nucleari. Un'impostazione di potenza deve essere regolata a meno del 5% della potenza massima e provare sonicazione per 5 s tre volte con più di un intervallo di 30 s. Se il controllo della potenza è disponibile, regolare l'impostazione della potenza a 5 W ed elaborare i campioni per il totale di 15 s come accennato in precedenza per dare potenza totale di 70-75 J. Controllare se la struttura cellulare è rotta come accennato in precedenza. Se non è sufficiente, ripetere ancora una volta. La condizione descritta in precedenza è praticamente applicata a tutte le linee cellulari testate.
    7. Centrifuga a 9.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e risparmiare 20 l della cromatina digerita per la fase 2.3. Conservare il resto a -80 gradi centigradi.
  3. Crosslinking inverso, purificazione del DNA e analisi della cromatina digerita
    1. Aggiungete 75 l'acqua, 4 luna di 5 M NaCl e 1 l di proteinasi K a un tubo a vite da 1,5 ml. Aggiungere 20 l di cromatina digerita da varie condizioni di digestione di MNase preparate al passo 2.2.7 ai tubi contenenti acqua, NaCl e proteine K. Chiudere il tappo strettamente, mescolare completamente e incubare il tubo a 65 gradi durante la notte.
      NOT: Questo passo è per la rimozione del collegamento tra proteine e DNA.
    2. Preparare due tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per condizione. Aggiungere 100 l di fenolo:cloroformio:isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) a un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 10 -L di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2 luna di glicogeno in un altro tubo.
      NOT: L'uso di cloroformio:isoamylalcohol non è necessario7. L'aumento del volume può provocare un basso recupero del DNA dopo la precipitazione dell'etanolo8.
    3. Centrifugare brevemente il tubo contenente cromatina digerita dal punto 2.3.1 e aggiungere 100 L di PCI. Chiudere il tappo strettamente, e vortice vigorosamente per formare emulsione. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 s a temperatura ambiente.
    4. Prendere con attenzione la fase superiore contenente il DNA e aggiungerla al tubo contenente PCI preparato al punto 2.3.2. Vortice vigorosamente e centrifugare il tubo come passo 2.3.3.
      NOT: Se la fase inferiore è contaminata, centrificare nuovamente il tubo, o rimuovere la maggior parte della fase inferiore prima, centrificare il tubo, e prendere la fase superiore.
    5. Prendere con attenzione la fase superiore come descritto al punto 2.3.4 e aggiungerlo al tubo contenente acetato di sodio e glicogeno preparato al punto 2.3.2. Aggiungere 250 -L di etanolo. Mescolare per inversione e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 min a 4 gradi centigradi.
      NOT: L'incubazione della soluzione a temperatura ambiente non influisce sul recupero del DNA8,9.
    6. Confermare i pellet sul fondo del tubo. Rimuovere con cura il supernatante in modo da non disturbare il pellet e aggiungere 500 lun di 70% di etanolo. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g)per 5 min a 4 gradi centigradi.
    7. Rimuovere completamente il supernatante e asciugare il pellet per circa 5 min a temperatura ambiente. Sciogliere il pellet in 20 , luna di 10 mM Tris HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
    8. Mescolare 0,5 g di DNA con un colorante di carico gel e applicare al 2% gel di agarose. Elettroforizzare i campioni a 100 V nel tampone tris-acetato-EDTA fino a quando il colorante viola non è migrato ai due terzi del gel e macchiare un gel con 0,5 g/mL di bromuro di etidio per 10 min. Scatta una foto del gel.
      NOT: Vedere Figura 2 per i dettagli.

3. ChromatinImmunoprecipitazionation

  1. Preparazione della cromatina digerita
    1. Preparate lecellule. Per le cellule aderenti, semi 2-10 x 106 cellule per piatto in 2 piatti (6 cm o 10 cm) per gruppo di trattamento e consentire alle cellule di attaccarsi al fondo dei piatti per più di 1 giorno. Per le cellule sospese, semi in 2 flaconi T25 per gruppo di trattamento. Trattare le cellule come desiderato.
    2. Prendere un piatto o un pallone da ogni gruppo e contare il numero di cella come descritto nel passaggio 2.1.2. Preparare la cromatina incrociata come indicato nei passaggi 2.1.3-2.1.7.
    3. Eseguire il lyse della pellet cellulare e della digestione di MNase come descritto nei passaggi 2.2.1-2.2.7. Utilizzare la quantità ottimale di MNase per digerire la cromatina come determinato nel passaggio 2. Conservare la cromatina digerita a -80 gradi centigradi.
    4. Collegamento incrociato inverso 20 - L di cromatina digerita e purificailtà del DNA come descritto al punto 2.3.8. Misurare la concentrazione del DNA come descritto al punto 2.3.7. Elettroforezza i campioni nel gel di agarose del 2% per controllare la dimensione della cromatina digerita come accennato al punto 2.3.
      NOT: La concentrazione del DNA è identica a quella della cromatina digerita immagazzinata preparata al punto 3.1.3.
    5. Diluire un campione di cromatina digerito inverso dal passo 3.1.4 per dare 10 ng/L con acqua e diluire in serie le concentrazioni di 1, 0,1 e 0,01 ng/L. Conservare a -20 .
      NOT: Questi esempi vengono utilizzati per gli standard PCR in tempo reale.
  2. Immunoprecipitazione
    NOTA: Nei passaggi 3.2-3.5 del protocollo, viene determinata l'occupazione anti-trimetilato istono H3 lisina 4 (H3K4me3) nelle cellule VCaP. Vedere anche Figura 3.
    1. Scongelare la cromatina digerita dal punto 3.1.3. Tieni tutti i campioni sul ghiaccio.
    2. Preparare il buffer di diluizione ChIP integrato con PIC aggiungendo 1/100 volume di 100 volte PIC al buffer. Diluire la cromatina digerita a 5 g/500 -L con buffer di diluizione ChIP integrato con PIC. Preparare 1.000 -l più extra per (1) IP con IgG non immune (Control IgG), (2) IP con H3K4me3.
    3. Aggiungete 5 -L di 5 g/g/500 di cromatina digerita a un tubo a vite da 1,5 ml come campione di ingresso (1% di un IP). Conservare il campione a -80 gradi centigradi.
    4. Aggiungete 500 l di una cromitina di sè/500 l a un tubo a vite da 1,5 mL come campione IP. Aggiungere 2 g di anticorpo al tubo. Chiudere il tappo e incubare il tubo a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo.
      NOT: Anche se la quantità ottimale di anticorpi deve essere determinata empiricamente, si raccomandano all'inizio 2 g per IP.
    5. Aggiungete 30 gradi di proteine ChIP-grade G perline magnetiche per IP. Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 2 h con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo.
      NOT: Prelavaggio di perline magnetiche non è necessario.
  3. Lavare il complesso immunitario e invertire il crosslinking
    1. Ruotare brevemente il tubo dal punto 3.2.5. Mettere il tubo in un rack di polietilene contenente magneti di neodinium per 1 min. Rimuovere con attenzione il supernatante per aspirazione.
    2. Aggiungere 0,5 mL per tubo di tampone di lavaggio del complesso immunitario a basso sale. Disperdere le perline toccando delicatamente o vorticendo brevemente il tubo. Incubare il tubo a 4 gradi centigradi per 5 min con una leggera miscelazione utilizzando una piattaforma a dondolo. Dopo 5 min, ripetere il passaggio 3.3.1.
    3. Aggiungere 0,5 mL di un cuscinetto di lavaggio complesso immunitario ad alto sale per tubo. Disperse e lavate le perline come gradino 3.3.2. Dopo il lavaggio, ripetere il passaggio 3.3.1.
    4. Aggiungere 0,5 mL di LiCl immune complex wash buffer per tubo. Disperse e lavate le perline come gradino 3.3.2. Dopo il lavaggio, ripetere il passaggio 3.3.1.
    5. Posizionare il tubo in un rack magnetico per 1 min. Rimuovere completamente il rimanente supernatante.
    6. Aggiungere 150 l di tampone di eluizione al tubo. Vorticare il tubo per disperdere completamente le perline. Chiudere il tappo e incubare il tubo a 65 gradi centigradi per 30 min, mescolando per inversione o vortice ogni 5 min per disperdere accuratamente le perline.
    7. Durante l'incubazione, preparare un tubo a vite da 1,5 ml e aggiungere 6 M NaCl e 2 -L di proteinae K. Thaw 1% campione di input preparato al passo 3.2.3. Aggiungere 150 l di tampone di eluizione, 6 L di 5 M NaCl e 2 l di proteine K all'1% del campione di input.
    8. Dopo l'incubazione, girare lungo il tubo. Collocare il tubo in un rack magnetico per 1 min e trasferire il supernatante al tubo a vite contenente NaCl e proteinae K preparato al passaggio 3.3.7.
    9. Chiudere il tappo e vorticare tutti i campioni IP e di input per mescolare completamente. Incubare il tubo a 65 gradi durante la notte.
  4. Purificazione del DNA
    1. Preparare il tubo come descritto in 2.3.2 e aggiungere 150 L di PCI invece di 100 l. In un altro tubo, aggiungere 12 L di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) e 2 l una di glicogeno.
    2. Rimuovere il tubo dall'incubatrice. Girare verso il basso il tubo e aggiungere 150 l di PCI.
    3. Vortice vigorosamente il tubo per formare l'emulsione. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad es. 20.000 x g) per 30 s a temperatura ambiente.
    4. Trasferire con cura 140 l della fase superiore al tubo contenente PCI preparato al punto 3.4.1. Ripetere il passaggio 3.4.3.
      NOT: Vedere anche Nota nel passaggio 2.3.4.See also Note in step 2.3.4.
    5. Trasferire con cura 120 l di fase superiore al tubo contenente acetato di sodio e glicogeno preparato al passo 3.4.1.
      NOT: Vedere anche Nota nel passaggio 2.3.4.See also Note in step 2.3.4.
    6. Aggiungere 300 l di etanolo. Mescolare per inversione e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
    7. Centrifugare il tubo alla massima velocità (ad esempio, 20.000 x g) per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare il pellet come descritto al punto 2.3.6.
    8. Dopo aver asciugato il pellet come descritto al punto 2.3.7, sciogliere il pellet in 50 gradi di TE. Conservare a -20 gradi centigradi.
  5. Rilevamento di frammenti di DNA tramite PCR in tempo reale
    1. Scongelare i seguenti campioni: (1) IP con Control IgG, (2) IP con anti-H3K4me3, (3) 1% campione di input. Scongelare anche 4 dosi di standard preparati nel passaggio 3.1.5 (totale di 7 campioni).
      NOT: Utilizzare gli standard dello stesso gruppo per la quantificazione delle quantità di DNA nei campioni di input e IP.
    2. Crea la soluzione pcR per 8 campioni. Mescolare 40 l di 2x supermix PCR in tempo reale, 8 litri ciascuno di 4 M, primer in avanti e inverso e 8 luna di acqua.
      NOT: Una miscela di reazione PCR contiene 5 volte luna di 2 volte il supermix PCR in tempo reale, 1 l ciascuno dei primir in avanti e indietro di 4 M e 1 l di acqua. Le sequenze di Primer sono elencate nella tabella 2.
    3. Soluzione di lavoro AliquotA 8 -L di PCR in un pozzo di una piastra PCR. Aggiungere 2 o l di campioni del passaggio 3.4.8 o gli standard del passaggio 3.1.5.
    4. Sigillare la piastra PCR ed eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni: 1) 95 S per 3 min per la denaturazione iniziale, 2) 95 C per 10 s per la denaturazione, 3) 56 C per 30 s per l'annealing, 4) 72 S per 30 s per l'estensione e la raccolta dei dati , ripetere i passaggi da 2 a 4) per 55 cicli. Dopo il ciclismo, misurare una curva di fusione del prodotto PCR. Analizzare i dati.
      NOT: I dati non elaborati per la figura 3 sono riportati nella tabella 3. Calcolare la quantità iniziale (SQ) dei campioni utilizzando una curva standard. Moltiplicare l'Input SQ nell'1% per 100 per regolare un campione di input dell'1% su un IP per dare sQ in Input (Eq. 1) regolato. Dividere SQ nel campione IP per SQ regolato in Input per dare valore di input % (metodo di input percentuale, Eq. 2). Per calcolare l'arricchimento delle pieghe, dividere SQ in IP con anti-H3K4me3 per SQ in IP con controllo IgG (metodo di arricchimento piega, Eq. 3).
      SQ regolato nell'ingresso (SQ in ingresso 1%) x 100 (1)
      Media di immissione di H3K4me3 - 100 x (SQ in IP con anti-H3K4me3) / (SQ regolato in ingresso) (2)
      Arricchimento di piegatura di H3K4me3 (SQ in IP con anti-H3K4me3) / (SQ in IP con controllo IgG) (3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La digestione della cromatina è uno dei passaggi importanti per un saggio ChIP. Abbiamo usato MNase per digerire la cromatina per ottenere una miscela di oligomeri nucleosomi. Nella fase di digestione di MNase, MNase può passare attraverso la membrana nucleare e digerire la cromatina. Tuttavia, la cromatina digerita non può passare attraverso la membrana e rimane nei nuclei. Per liberare la cromatina digerita dai nuclei, è necessaria una breve sonicazione. Figura 1A mostra microfotografie prima e dopo la sonicazione della sospensione cellulare VCaP. Senza la sonicazione, la struttura cellulare rimane intatta, indicando che la cromatina è presente nei nuclei. Una breve sonicazione rompe la struttura cellulare e il controllo delle cellule in microfotografie aiuta a determinare le brevi condizioni di sonicazione. Abbiamo anche rappresentato altri esempi per una breve sonicazione in cellule 293T (Figura 1B) la linea cellulare leucemia linfoblastica acuta delle cellule B umane, le cellule REH (Figura 1C) e la linea cellulare del cancro della prostata umana, LNCaP (Figura 1D).

La figura 2A mostra la frammentazione della cromatina dopo il trattamento con diverse quantità di MNase nelle cellule VCaP. Abbiamo trattato 6 x 106 pellet di cellule VCaP incrociate con 0, 50, 100, 200 unità gel di MNase in 300 : L di buffer di digestione per 10 min a 37 . Dopo la purificazione della cromatina digerita, 500 ng di DNA è stato analizzato su 2% gel di agarose e macchiato con bromuro di etidio. Senza aggiungere MNase, apparve un motivo di striscio con un peso molecolare molto elevato (corsia 1). L'aggiunta di MNase diede un modello di scala (N; un'unità mononucleosomiana), mostrando che MNase digerisce l'internucleosomo (lane 2-5). Figura 2B Mostra un modello di digestione inappropriato. L'iperdio ha portato principalmente alla produzione di mononucleosomi (Figura 2B, corsia 7). Dovremmo trovare le condizioni adeguate che producono frammenti di cromatina fino a 900 bp (da uno a cinque nucleosomi; ad esempio, corsia 5).

Per verificare se il saggio ChIP viene eseguito correttamente, è essenziale disporre di controlli appropriati nel saggio. Per l'immunoprecipitazioni, gli IGA non immuni della stessa specie degli anticorpi di interesse vengono utilizzati come controllo che mostra un legame non specifico alla stessa regione (vedi discussione). Inoltre, si raccomanda di misurare il legame delle proteine (occupazione) sia in regioni positive che negative. È stato ampiamente accettato che l'occupazione di H3K4me3 è distribuito tra circa un kilobase (kb) a monte e a valle dei siti di partenza della trascrizione10,11. Abbiamo misurato l'occupazione di H3K4me3 nel genoma AR che si estende su circa 20 kb a monte attraverso 12 kb a valle del sito di inizio della trascrizione AR (AR-TSS) nelle cellule VCaP AR-positive. Il modello di digestione della cromatina nelle cellule VCaP utilizzate in questo esperimento è stato illustrato nella figura 3A, che indica la corretta digestione della cromatina. L'occupazione più alta di H3K4me3 è stata osservata intorno all'AR-TSS e 0,5 kb e 1 kb a monte dell'AR-TSS (Figura 3B). Finché i geni sono trascrizionalmente attivi, i TSS possono essere "regioni positive". Le regioni situate a 19 kb e 8 kb a monte e 12 kb a valle di AR-TSS, tuttavia, avevano poca occupazione di H3K4me3 (Figura 3B), che indica che questi possono essere utilizzati come "regioni negative".

È stato dimostrato che un androgeno aumenta l'occupazione di RNA polimerasi II nel promotore e potenziatore di PSA nelle cellule LNCaP utilizzando la cromatina tranciata dalla sonicazione12,13. Abbiamo quindi testato la validità del nostro protocollo misurando l'occupazione dell'RNA attivo polimerasi II (fosforilata RNA polimerasi II a serine 5; PolII(pS5)) nelle celle. Abbiamo eseguito lo stesso esperimento per verificare la riproducibilità del nostro metodo. Cellule LNCaP sono stati coltivati in mezzo affamato di steroidi per 3 giorni e stimolato con un veicolo o 10 nM dihydrotestosterone (DHT) per 4 h. Active RNA polimerasi II occupazione è stata misurata da immunoprecipitazioni con anti-PolII(pS5), seguita da PCR in tempo reale. La figura 4A mostra un modello di digestione riproducibile della cromatina delle cellule LNCaP in tre esperimenti indipendenti. Come illustrato nella Figura 4B, DHT significativamente aumentato PolII(pS5) occupazione nel promotore PSA e potenziatore quando si utilizza il metodo di input percentuale. Abbiamo anche calcolato l'occupazione utilizzando il metodo di arricchimento delle pieghe (Figura 4C) e abbiamo scoperto che nessuna differenza significativa in PolII(pS5) nel promotore PSA è stata osservata con o senza il trattamento DHT. Il DHT non ha influito sull'occupazione nel promotore GAPDH, come pubblicato in precedenza14. È importante sottolineare che i nostri dati erano simili a quelli ottenuti da campioni di cromatina di sonicazione-tosato12,13.

Figure 1
Figura 1: Microfotografie rappresentative di pellet cellulari incrociati prima e dopo la sonicazione. I pellet cellulari VCaP incrociati (A), 293T (B), REH (C) e LNCaP (D) sono stati trattati con MNase e i pellet sono stati risospesi nel buffer di diluizione ChIP. Prima e dopo la sonicazione, sono state scattate le immagini delle sospensioni. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentante agarose gel analisi della cromatina digerita. (A) La cromatina incrociata è stata preparata dalle cellule VCaP e digerita con varie quantità di MNase, come descritto al punto 2.2. La cromatina digerita era crosslinked inverso, purificato e analizzato in un gel di agarose del 2%. N; un'unità mononucleosomiana. (B) La cromatina delle cellule VCaP è stata digerita con 250 unità gel di MNase per 2 x 106 cellule a 37 s per 20 min e analizzate (come descritto in A). Grandi quantità di MNasi e tempi di incubazione più lunghi causarono una digestione quasi completa della cromatina a formare mononucleosomi (150 bp). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Occupazione di H3K4me3 nel genoma AR. La cromatina digerita è stata preparata dalle cellule VCaP. (A) Il modello di digestione è stato analizzato utilizzando un gel di agarose. (B) 5 g di cromatina digerita è stato immunoprecipitato con 2 g di coniglio normale IgG o anti-H3K4me3 anticorpo come accennato nei passaggi 3.1 e 3.2. I complessi immunitari sono stati lavati ed eluiti da perline e crosslinked inverso. I frammenti di DNA purificato sono stati analizzati utilizzando la PCR in tempo reale con i set di primer elencati nella Tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Androgeno ha aumentato l'occupazione di polimerasi di RNA attivo II nel promotore e potenziatore di PSA. Cellule LNCaP affamati di steroidi sono stati trattati con o senza 10 nM DHT per 4 h, e cromatina digerita è stato preparato. (A) Modello di digestione della cromatina dalle cellule LNCaP in tre esperimenti indipendenti. (B,C) La cromatina digerita è stata immunoprecipitata con un anticorpo anti-PolII (pS5) e i frammenti di DNA sono stati purificati come descritto per la figura 3. L'occupazione di polimerasi a vita attiva II nel promotore di PSA, potenziatore e promotore GAPDH come input percentuale (B) e arricchimento di piega (C) è stata determinata utilizzando la PCR in tempo reale con i set di primer elencati nella tabella 2. I risultati mostrati sono medi: SE di tre esperimenti indipendenti. (*); p<0,05, (sezione ) ; p < 0,01 rispetto al trattamento DHT 0 nM. NS; non significativo rispetto a 0 nM DHT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Linea di celle unità gel per due milioni di cellule in 100 gradi centigradi di tampone, 37 gradi centigradi per 10 min
Lncap 267 mila
VCaP 66,7
293T 450
Reh 134 del
22Rv1 400

Tabella 1: Quantità ottimale di nuclease micrococcale in varie linee cellulari. Il valore rappresenta la quantità di MNase per 2 x 106 celle in 100 - L di buffer, 37 gradi centigradi per 10 min.

Nome primer sequenza
AR (-18,8 kb) Fwd ATTTGGAACTGGGAACATCT
giro CACCTTCTCTCTCCCTCTACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
AR (-8,8 kb) Fwd TAACAGCTTTGCATCCAAGT
giro TGAAATCTGGAGHAAAGCA
AR (-8,2 kb) Fwd CAGTGCTATTCCCTTGTGAC
giro TTGGACTGGCTCTATCTCTCTGA
AR-TSS (0 kb) Fwd GCAAACTGTTGCATTTGCTC
giro GGCCCTTTTCTCTCTC
AR (0,6 kb) Fwd CACGACCCGCCTGGTTAG
giro TGAAGACCTGACTGCCTTTTC
AR (1,0 KB) Fwd CCGCAAGTTTCCTTCTGGGG
giro CTTCCCAGCCCTAACTGCAC
AR (11,8 kb) Fwd CCTTGCTTGGGGAACTGTAG
giro TTTATTGTCTGGGCTAGGC
Promotore PSA Fwd CCTAGATGAAGTCTCCATGATACA
giro GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG
Potenziatore PSA Fwd GCCTGGATCTGAGAGAGATCATC
giro ACACCTTTTTTTTTTGGTGGTGGTGT
GAPDH Fwd TACTAGCGGTTTCTGCGG
giro TCGAACAGGAGGAGAAGAGCGA

Tabella 2: Sequenze Primer abbinate utilizzate per il saggio ChIP.

AR (-18,8 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso ORE.49 0,815 81,5 100 del sistema
IP con Controllo IgG Ore 27.68 0,051 (in linguaggio da 20>: 0,051 (in linguaggio da 20>: 0.062 (in inglese) 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 Ore 22.48 1.590 (in questo da 29>) 1.590 (in questo da 29>) 1.951 (in linguaggio 1.951) 31.4 34
AR (-8,8 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso Ore 23.22 0.586 58,6 100 del sistema
IP con Controllo IgG Ore 26.81 0,052 (in via 0,052) 0,052 (in via 0,052) 0,088 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 Ore 23.74 0.414 0.414 0.706 8.0 8 (inquesto e in stato di
AR (-8,2 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso 23.19 0,643 (in inglese) 64.3 100 del sistema
IP con Controllo IgG Ore 26.99 0,048 (in via 0)NET 24).048 0,048 (in via 0)NET 24).048 0,075 (in via 0,0)" 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 23.63 0,477 (in linguaggio 0,0) 0,477 (in linguaggio 0,0) 0,742 (in questo 0,742) 9.9
AR-TSS (0 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso Ore 25.06 0,657 65,7 100 del sistema
IP con Controllo IgG Ore 28.63 0,050 (inlinguaggio di com/0) 0,050 (inlinguaggio di com/0) 0,077 (in via 0,077) 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 Ore 20.70 15.064 (in inglese) 15.064 (in inglese) Ore 22.944 299,8 anni
AR (0,6 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso 23.86 0,716 71,6 100 del sistema
IP con Controllo IgG ORe 26.67 0.106 (in inglese) 0.106 (in inglese) 0.147 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 19.15 17.787 (in linguaggio 17.787) 17.787 (in linguaggio 17.787) 24.840 168,6
AR (1,0 KB) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso ORE.51 0,730 73,0 100 del sistema
IP con Controllo IgG Ore 25.94 0.125 0.125 0.171 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 Ore 19.06 Ore 18.486 Ore 18.486 Ore 25.335 147,8
AR (11,8 kb) Cq Quadrati Regolato in base a un IP % ingresso Arricchimento delle pieghe
1% Ingresso Ore 24.54 0,876 87,6 100 del sistema
IP con Controllo IgG 29.14 0,033 (in linguaggio da 20>: 0,033 (in linguaggio da 20>: 0,037 (in linguaggio da 20>: 1 : il nome del
IP con anti-H3K4me3 Ore 24.47 0,918 (in questo 018) 0,918 (in questo 018) 1.048 (in linguaggio 1,048) Ore 27.97

Tabella 3: Dati grezzi dall'analisi quantitativa PCR per la figura 3. Cq: Numero di ciclo di soglia, SQ: quantità iniziale calcolata utilizzando una curva standard, Regolata a un IP: moltiplicare SQ in 1% di ingresso per 100 come 1% volume campione di un IP viene utilizzato per PCR, % Input: dividere SQ nel campione IP per regolato SQ in Input, Fold arricchimento : dividere SQ in IP con anti-H3K4me3 per SQ in IP con controllo IgG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anche se la sonicazione è comunemente usata per ottenere la cromatina frammentata, è dispendioso in termini di tempo e ingombrante identificare le condizioni riproducibili. In questo protocollo, abbiamo usato la digestione di MNase perché la digestione degli enzimi dovrebbe essere più facile identificare le condizioni riproducibili. Un breve passo di sonicazione dopo la digestione di MNase (vedi passo 2.2) è stato necessario per rompere la membrana cellulare e rilasciare la cromatina digerita. Pertanto, la potenza di sonicazione nel nostro protocollo dovrebbe essere il più basso possibile. Usiamo le stesse condizioni di sonicazione per tutte le cellule che abbiamo impiegato (vedi Figura 1 e Tabella 1) per ottenere la completa ripartizione della membrana.

La digestione della cromatina da parte di MNase è un passo critico nel nostro protocollo, e quindi abbiamo esercitato un grande sforzo per ottimizzare le condizioni per la digestione della cromatina all'interno delle cellule. L'attività di digestione è determinata dalla quantità di enzima e substrato (cromatina) e dal tempo di incubazione. Inoltre, poiché la ploidia varia tra le diverse cellule, le condizioni ottimali per la digestione di MNase devono essere identificate per ogni tipo di cellula. Una volta stabilite, le stesse condizioni possono essere applicate indipendentemente dai trattamenti cellulari. Controlliamo sempre i modelli di digestione della cromatina in ogni esperimento per garantire che i modelli di digestione siano adatti per i saggi ChIP, come mostrato nella Figura 2A, corsia 5.

Alcuni fattori influenzano i risultati dei saggi ChIP. È importante utilizzare la giusta quantità di cromatina digerita nel nostro protocollo. In molti protocolli, il numero di cella ma non la quantità di cromatina per un IP è mostrato15,16. Queste condizioni sperimentali producono un'elevata variabilità nella quantità di cromatina tra le cellule a causa di differenze ploidiche. Usiamo 5 g di cromatina e 2 g di anticorpo per un IP nell'analisi, quindi il nostro protocollo è più semplice e chiaro di altri protocolli, anche se possono essere necessarie quantità ottimali di anticorpi per IP. Anche la selezione degli anticorpi è importante; utilizzare anticorpi convalidati dall'analisi ChIP.

Esistono due metodi per analizzare i dati ChIP PCR: il metodo di input percentuale e il metodo di arricchimento fold. Nel metodo di input percentuale, i segnali provenienti da campioni IP sono divisi per segnali provenienti dalla cromatina totale nel campione IP. Nel metodo di arricchimento piega, i segnali provenienti da IP con un anticorpo specifico come H3K4me3 sono divisi da segnali provenienti da IP con il controllo IgG. Il metodo successivo è applicabile solo quando i segnali provenienti da IP con il controllo IgG sono simili e riproducibili a più obiettivi o obiettivi identici nelle diverse condizioni fisiologiche. In pratica, i livelli del segnale variano in modo che il valore di arricchimento della piega abbia un'elevata variabilità, come illustrato nella Figura 4C. Pertanto, non è consigliabile utilizzare il metodo di arricchimento piega per rappresentare i dati ChIP nel nostro metodo.

MNase favorisce un ambiente "aperto" di euchromatina e non è accessibile a una struttura eterocromatica, suggerendo che la digestione di MNase può produrre qualche pregiudizio. È stato riferito che l'arricchimento dei domini di cromatina che interagiscono con la lamin a-aèè è diverso tra i preparati di cromatina sonication-tosato e MNase-digested17. Pertanto, la digestione di MNase nel saggio ChIP potrebbe non essere adatta ad analizzare molecole associate alla struttura nucleare come lamin A/C e Special AT-rich Sequence Binding Protein 1 (SATB1).

Nei protocolli di analisi ChIP progettati per analisi a downstream microarray (ChIP-on-chip) o di sequenziamento (ChIP-seq), RNase viene utilizzato durante la fase di purificazione del DNA, anche se non nei protocolli progettati per le analisi PCR18. Non abbiamo verificato se il nostro protocollo è compatibile con le analisi ChIP-on-chip e ChIP-seq, ma presumiamo che il nostro protocollo sia applicabile quando i campioni vengono trattati con RNase. Se è necessario il trattamento Con RNase, utilizzare 2 XL di 10 mg/mL senza RNase RNase A invece della proteinasi K nel passaggio 3.3 e incubare a 65 s durante la notte. Prima di purificare il DNA (passaggio 3.4), aggiungere la proteinasi K e incubare per un ulteriore 1 h h a 60 gradi centigradi.

Eseguiamo regolarmente saggi ChIP con fattori istoni e trascrizionali modificati utilizzando il metodo qui descritto e abbiamo dimostrato che il fattore di rimodellamento della cromatina, dominio di interazione AT-rich 5B, regola l'espressione genica AR modificando l'occupazione di PolII( pS5) e H3K4me3 nel promotore AR19. Crediamo che il nostro protocollo sia tecnicamente più facile di altri saggi ChIP ed è ampiamente accettabile nella ricerca sulla biologia molecolare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è supportata dalle royalties Genentech per City of Hope. Questo lavoro non è supportato in tutto o in parte dai National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2x iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Tags

Genetica Questione 147 regolazione genica modificazione dell'istone immunoprecipitazioni della cromatina nucleasi micrococcale polimerasi RNA II,
Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin… More

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter