HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות
Summary
ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.
Abstract
גורם מחייב CCCTC (CTCF)-מתווכת יציב topologically שיוך תחומים (TADs) לשחק תפקיד קריטי באינטראקציות מגבילה של רכיבי ה-DNA הממוקמים שכנות TADs. CTCF תפקיד חשוב בוויסות יכולות הביטוי של גנים HOX השולטים התפתחות, גוף המתבנת, hematopoiesis ו- leukemogenesis. עם זאת, הוא נשאר ברובו לא ידוע אם וכיצד HOX לוקוסים הקשורים CTCF גבולות לווסת כרומטין הארגון ואת ביטוי גנים HOX . בפרוטוקול הנוכחי, ספרייה במאגר ספציפי sgRNA מיקוד CTCF כל האתרים מחייב לוקוסים HOXA/B/C/D נוצר כדי לבחון את ההשפעה של שיבוש כרומטין הקשורים CTCF גבולות על היווצרות טד, גנים HOX ביטוי. דרך CRISPR-Cas9 בדיקה גנטית, באתר איגוד CTCF ממוקם בין גנים HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) התגלתה הרגולטור קריטי של כרומטין oncogenic תחום, כמו גם להיות חשוב לשמירה על גנים HOX חוץ רחמי הביטוי דפוסים לסידור מחדש MLL לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). לפיכך, לספריה זו sgRNA הקרנת הגישה מספק תובנות הרומן ארגון הגנום CTCF מתווכת גנים ספציפיים לוקוסים ואת מספקת גם בסיס אפיון פונקציונלי המבואר מרכיבים רגולטוריות גנטיים, שניהם קידוד ו noncoding, במהלך רגיל תהליכים ביולוגיים בעידן פרוייקט הגנום האנושי פוסט.
Introduction
מחקרים אחרונים של אינטראקציה עם הגנום חשף הטפסים גנום גרעינית יציבה תחומים שיוך topologically (TADs) שאינם נשמרים על פני סוגי תאים ו מינים. הארגון של הגנום לתחומים נפרדים מקלה ומגביל את האינטראקציות בין גורמים רגולטוריים (למשל, משפרי ואת היזמים). הגורם מחייב CCCTC (CTCF) נקשר טד גבולות ומשחק תפקיד קריטי באינטראקציות מגבילה של רכיבי ה-DNA ממוקמים TADs שכנים1. עם זאת, נתוני איגוד CTCF רחב של הגנום חשף למרות CTCF בעיקר אינטראקציה עם ה-DNA זהה-האתרים סוגי תאים שונים, הוא לעתים קרובות מתפקד כמחסום כרומטין באתר מסוים בסוג תא אחד אבל לא ביד השנייה, רומז כי פונקציות CTCF יחד עם פעילויות אחרות להיווצרות של כרומטין גבולות2. מה נותר עלום היא האלמנטים גבול (מחייב CTCF אתרים) קשורים ישירות לתפקוד הביולוגי של CTCF, איך קישורים אלה להתרחש. לכן, אנו משערים כי אתרי קישור CTCF ספציפיים בגנום ישירות לווסת את היווצרות של TADs, לשלוט יזם/משפר אינטראקציות בתוך תחומים אלה או בין תחומים סמוכים. השלמת האדם ואת העכבר הגנום רצפי פרויקטים וניתוחים epigenetic עוקבות חשפו חתימות המולקולריים והגנטיים חדשות של הגנום. עם זאת, תפקידו של חתימות/שינויים ספציפיים הכונה תפקוד התאים, כמו גם mechanism(s) המולקולרי שלהם, טרם להבין עד הסוף.
שורות מרובות של ראיות תומכות כי TADs בתיווך CTCF מייצגים כרומטין פונקציונלי תחומים3,4,5. למרות CTCF בעיקר אינטראקציה עם ה-DNA זהה-האתרים סוגי תאים שונים, נתונים CTCF שבב-seq רחב הגנום חשף כי CTCF לעיתים קרובות באמנות משמש חיץ כרומטין סוג תא אחד אך לא את שאר2. CTCF ממלא תפקיד חיוני במהלך הפיתוח על ידי מתווכים הגנום הארגוני4,6,7. שיבוש CTCF גבולות לקוי משפר/מקדם אינטראקציות, ביטוי גנים, שמוביל חסימה התפתחותית. הדבר מצביע על כך CTCF מתווכת TADs הם לא רק רכיבים מבניים, אלא גם יחידות רגולטוריות הדרושות משפר נאות פעולה וג’ין שעתוק5,8,9.
גנים HOX לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות עובריים, הם חנותם והמרגשים מוגבלים בדפוסי הביטוי שלהם. מיקומה HOXA טפסים שני TADs יציב הפרדת גנים anterior ואת אחורי על ידי יסוד הקשורים CTCF גבול hESCs והן תאים IMR901. דיווחים אחרונים הראו כי HoxBlinc, lncRNA לוקוס הקשורים HoxB , ומתווך היווצרות של CTCF ביים TADs משפר/יזם באינטראקציה לוקוס HOXB . זה מוביל הקדמי הפעלת גנים HOXB במהלך ESC מחויבות ובידול10. יתר על כן, לוקוסים גנים ספציפיים לרבות מיקומה HOXA , שינוי של CTCF מתווכת ביטוי גנים ספציפיים טד תחומים השתנה שושלת היוחסין פרופילים, היה קשור עם התפתחות המחלה הברית11,12. הראיות תומך בפונקציה הראשית עבור CTCF תיאום שעתוק גנים, קביעת זהות תא על-ידי ארגון הגנום לתחומים פונקציונלי.
למרות תפקידו בפיתוח עובריים, במהלך hematopoiesis, גנים HOX לווסת את תפקוד התא (HS/PC) hematopoietic של גזע, קדמון. פעולה זו מתבצעת על-ידי שליטה על האיזון בין התפשטות ובידול10,13,14,15. הביטוי של גנים HOX מוסדר בחוזקה ברחבי מפרט התמיינות של תאים hematopoietic, עם הביטוי הגבוהה ביותר ב- HS / ביטוי גנים מחשבים HOX פוחתת בהדרגה במהלך ההבשלה, עם רמות הנמוך שלו המתרחשים הבדיל תאים hematopoietic16. Dysregulation גנים HOX הוא מנגנון הדומיננטי של לוקמיה השינוי לפי dysregulating התחדשות עצמית ובידול מאפייני HS/מחשבים שמוביל שינוי לוקמיה17,18. עם זאת, המנגנון של ביסוס ושמירה על רגיל לעומת דפוסים oncogenic ביטוי של גנים HOX , כמו גם רשתות בקרה רגולטריות המשויך עדיין לא ברור.
CRISPR-Cas9 sgRNA ספריית ההקרנה כבר בשימוש נרחב לחקור חלבונים הגנים19 כמו גנים היטב גם ללא קידוד, כגון lncRNA20 ו- miRNA21 מינים שונים. עם זאת, עלות השימוש בספריה sgRNA CRISPR-Cas9 כדי לזהות מטרות חדשות גנומית נותרת גבוהה, כי רצף הגנום תפוקה גבוהה מוחל לעיתים קרובות כדי לוודא ההקרנה ספריית sgRNA. שלנו sgRNA מערכת הסינון מתמקדת לוקוסים הגנום ספציפיים, ערך את sgRNAs מיקוד דרך בשלב אחד RT-PCR על פי בביטוי הגן סמן, כגון HOXA9. בנוסף, ניתן להבחין סנגר רצף אישר sgRNA היה משולב לתוך הגנום, ויאסין מוטציות כדי לזהות את sgRNA מיקוד באתר. דרך ההקרנה CRISPR-Cas9 לוקוסים ספציפיים גנטי, הגבול כרומטין CBS7/9 זוהתה כרגולטור קריטי הקמת תחום כרומטין oncogenic ולשמירה על דפוסי ביטוי גנים HOX חוץ רחמי ב- AML פתוגנזה 12. השיטה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לזהות לא רק התפקוד המסוים של גבול CTCF של התפתחות עוברית, hematopoiesis, leukemogenesis, אבל גם CTCF גבול כמטרות טיפוליות אפשריות לטיפול epigenetic בעתיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
ג’ין חלבונים הקשורים sgRNA ספריות הוחלו במערכת הקרנה פונקציונלי לזיהוי גנים ורשתות ויסות פונקציות ספציפיות הסלולר דרך sgRNA העשרה24,25,26 ,27,28. מספר אזור ללא קידוד הקשורים sgRNA ספריות הוצגו גם במסכים פונקציונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים גם Cesari ניקולס על עריכת כתב היד. העבודה נתמכה על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (תרגום, R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
