Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse af kombinatorisk miRNA behandlinger til at regulere cellecyklus og angiogenese

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA therapeutics har betydeligt potentiale i at regulere kræft progression. Vist her er analytiske tilgange bruges til identifikation af aktiviteten af en kombinatoriske miRNA behandling standse cellecyklus og angiogenese.

Abstract

Lungekræft (LC) er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan. I lighed med andre kræftceller, et grundlæggende kendetegn ved LC celler er uregulerede spredning og celledeling. Hæmning af spredning af standse cellecyklus progression har vist sig at være en lovende tilgang til kræftbehandling, herunder LC.

miRNA therapeutics er dukket op som vigtige post-transcriptional gen regulatorer og er i stigende grad ved at blive undersøgt til brug i kræftbehandling. I de seneste arbejde udnyttede vi to miRNAs, miR-143 og miR-506, at regulere cellecyklus progression. A549 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kræftceller var transfekteret, gene expression ændringer blev analyseret og apoptotiske aktivitet på grund af behandlingen blev sidst analyseret. Downregulation af cyclin-afhængig kinaser (CDKs) blev fundet (dvs., CDK1, CDK4 og CDK6), og celle cyklus standset ved faseovergange G1/S og G2/M. Sti analyse viste potentielle antiangiogenic aktivitet af den behandling, der forlener tilgangen med mangefacetteret aktivitet. Her beskrives er de metoder, der anvendes til at identificere miRNA aktivitet vedrørende cellecyklus hæmning, induktion af apoptose og virkninger af behandlingen på endotelceller ved hæmning af angiogenese. Det er håbet, at de metoder, der præsenteres her vil støtte fremtidige forskning på miRNA therapeutics og tilsvarende aktivitet og at den repræsentative data vil guide andre forskere under eksperimentelle analyser.

Introduction

Cellecyklus er en kombination af flere regulerende begivenheder, der tillader kopiering af DNA og celle spredning gennem mitotiske proces1. Cyclin-afhængig kinaser (CDKs) regulere og fremme celle cyklus2. Blandt dem har den mitotiske CDK (CDK1) og interphase CDKs (CDK2, CDK4 og CDK6) en central rolle i celle cyklus progression3. Retinoblastom protein (Rb) er fosforyleret af den CDK4/CDK6 komplekse at tillade cellecyklus progression4, og CDK1 aktivering er afgørende for vellykket celledeling5. Talrige CDK hæmmere er blevet udviklet og evalueret i kliniske forsøg i de sidste par årtier, med angivelse af potentialet i rettet mod CDKs i kræftbehandling. Faktisk tre CDK hæmmere er blevet godkendt til behandling af brystkræft for nylig6,7,8,9,10. Således er CDKs, og især CDK1 og CDK4/6, er af stor interesse i at regulere kræft celle progression.

miRNAs (miRs) er lille, ikke-kodende RNA'er og post-transcriptional regulatorer af genekspression, regulere ca 30% af alle menneskelige gener11. Deres aktivitet er baseret på translationel undertrykkelse eller forringelse af messenger RNA'er (mRNAs)12. Illustrerende for deres biologiske betydning, mere end 5.000 miRNAs er blevet identificeret og en enkelt miRNA molekyle kan regulere flere gener11,13. Endnu vigtigere, har miRNA udtryk været forbundet med forskellige sygdomme og sygdom statusser, herunder kræft13. Faktisk miRNAs er blevet karakteriseret som mutationer eller tumor undertrykkere, at være i stand til at enten fremme eller undertrykke tumor udvikling og progression14,15. Den relative udtryk for miRNAs i syge væv kan regulere sygdomsprogression; således har eksogene levering af miRNAs terapeutiske potentiale.

Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald og mere end 60% af alle maligne sygdomme lunge er ikke-small cell lunge kræft16,17, med en 5-års overlevelse på mindre end 20%18. Brugen af miR-143-3 p og miR-506-3 p blev for nylig vurderet målretning celle cyklusser i lunge kræft celler11. miR-143 og miR 506 har sekvenser, der er til CDK1 og CDK4/CDK6, og virkningerne af disse to miRs på A549 celler blev analyseret. De eksperimentelle detaljer præsenteres og drøftes i dette dokument. Gen-ekspression, celle cyklus progression og apoptose blev evalueret ved hjælp af forskellige eksperimentelle design og timepoints efter Transfektion. Vi brugte real-time kvantitativ PCR (RT-qPCR) metoder sammen med microarray analyse for at måle specifikke genekspression, og næste generation RNA sekventering blev brugt til at bestemme globale gen dysregulering11. Sidstnævnte metode identificerer den relative forekomst af hvert gen udskrift med høj følsomhed og reproducerbarhed, mens tusindvis af gener, der kan analyseres fra en enkelt eksperimentel analyse. Derudover apoptotiske analyse på grund af miRNA behandling blev udført og er beskrevet her. Bioinformatik suppleret pathway analyse. Præsenteres her er protokoller bruges til analyse af det terapeutiske potentiale i den kombinatoriske miR-143 og miR 506.

Hovedformålet med denne protokol er at identificere virkningerne af miRNAs i celler, med fokus på den celle cyklus. Forskellige teknikker præsenteres her spændvidde fra gen expression analyse præoversættelse (bruger qPCR) til at uddybe og roman teknikker til gen analyser på protein, såsom microarray analyse. Det er håbet, at denne rapport er nyttig for forskere interesseret i at arbejde med miRNAs. Derudover præsenteres metodologi for flow cytometric analyse af cellecyklus og apoptose af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. miR-143 og miR 506 Transfektion

Forsigtig: Brug latex handsker, beskyttende briller og en laboratoriekittel mens de udfører de beskrevne eksperimenter. Når det er påkrævet, skal du bruge biosikkerhed kabinet med kabinet fan på, uden at blokere luftvejene eller forstyrre den laminar airflow. Altid sat den beskytte glasrude til passende højde, som beskrevet af fabrikanten.

  1. Frø NSCLC A549 celler i en T25 cm2 kolbe/6/96 godt plade i DMEM/F12K medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (medier) i en vævskultur hætte og inkuberes natten over ved 37 ° C med 5% CO2 i en vævskultur inkubator.
  2. Suspendere miR-143 og/eller miR 506 efterligner eller scramble siRNA med transfecting agent (2.4 µg af miR var blandet med 14 µL af transfecting agent, se Tabel af materialer) i 500 µL af Transfektion medier og 1,5 mL serum og antibiotika-gratis DMEM/F12K medier på en endelige miRNA koncentration af 100 nM. miRNA beløb kan kræve optimering på forskellige celler og koncentrationer. Passende metoder omfatter Transfektion af celler med stigende koncentrationer af miRNA (dvs. 50-200 nM) og evaluering af udtryk downregulation af gener af interesse.
  3. Fjern kultur medier fra kolben/plade og vask en gang med 1 x PBS.
  4. Tilføje miRNA/scramble-transfecting agent komplekser og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 til 6 h (kolbe størrelse definerer tilføjet inkubation volumen).
  5. Erstatte medierne med 4 mL af dyrkningsmedier og inkuberes celler for 24 h og/eller 48 timer.
  6. Høste transfekteret celler ved trypsinization, ved tilsætning af 1 mL trypsin-EDTA i hver T25 cm2 kolbe, inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C og tilsættes 3 mL dyrkningsmedier til at høste cellerne. Placere indholdet af hver kolbe i en separat, markerede 15 mL tube. Arbejde i en vævskultur hætte.
  7. Der centrifugeres ved 751 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
    Bemærk: Forsigtighed er påkrævet under supernatanten fjernelse, som agitation af røret kan medføre tab af celler.
  8. Der tilsættes 2 mL 1 x PBS og centrifugeres i 5 min på 751 x g.
  9. Gentag trin 7 og 8 en gang til at fjerne ethvert spor af medier og supernatanten.
    Bemærk: På dette stadium, prøveglassene kan opbevares ved-80 ° C eller kan anvendes umiddelbart.

2. RNA udvinding

  1. Ren arbejdsområdet med sprøjtning med 70% isopropylalkohol og RNAse dekontaminering løsning.
  2. RNA udvinding bør udføres ved hjælp af en passende RNA kit (Se Tabel af materialer).
  3. Fjern rørene fra-80 ° C og lad dem at tø. Tilsæt 300 µL af lysisbuffer og pipetteres op og ned at bryde cellemembranen.
  4. Tilføje et lige saa stort volumen af 100% ultra-ren ethanol.
  5. Bland godt og placere i at adskille kolonne.
  6. Der centrifugeres mellem 11 og 16 x g for 30 s og fjern gennemstrømnings.
  7. Tilføj 400 µL af vask buffer, og der centrifugeres at fjerne bufferen.
  8. Tilsæt 5 µL af DNAse jeg med 75 µL DNA fordøjelsen buffer i hver prøve og Inkuber i 15 min.
  9. Vask prøve med 400 µL af RNA prep buffer.
  10. Vask 2 x med RNA wash buffer.
  11. Tilføje nukleasen-gratis vand til kolonnen, centrifuge, derefter indsamle RNA.
  12. Måle total RNA-koncentrationen med Spektrofotometer UV.

3. RT-qPCR

  1. Før RT-qPCR, syntetisere cDNA. Efter RNA koncentration kvantificeringen, skal du placere 1 µg af RNA i en 20 µL endelige mængden af reaktion at forberede cDNA i PCR rør. Altid arbejde på en ren bænk.
  2. Alle andre nødvendige ingredienser indgår i tabel 1.
Ingredienser Mængde (µL) / prøve (20 µL)
5 X cDNA Master mix 4
dNTP'er 2
Tilfældige hexamers 1
RT enhancer 1
Bagside enzym mix 1
DNase- og RNase gratis vand Nødvendige antal efter tilsætning af RNA for at gøre 20 µL

Tabel 1: Materialer til cDNA syntese af RNA prøver. Krævede mængder af respektive ingredienser til at forberede en master mix til én stikprøve for cDNA syntese.

  1. Inkuber i et termisk cycler med følgende temperatur betingelser: 42 ° C i 30 min. 95 ° C i 2 min.; 4 ° C indtil udtagning af prøver.
  2. Brug straks i regelmæssig PCR eller qPCR, eller gemme cDNA ved-20 ° C.
  3. Forberede frem og bak primer løsninger med DNase/RNase-fri vand ved en koncentration på 10 µM fra stock primer løsning.
  4. Forbered særskilt master mix for hvert gen skal påvises, afhængig af antallet af prøver. For hver cDNA prøve (qPCR godt), er reaktion mængden tilberedt efter tabel 2.
Ingredienser Mængde (µL) / prøve (20 µL)
SYBR master mix 10
Videresende Primer - 10 μM 2
Omvendt Primer - 10 μM 2
DNase- og RNase gratis vand 3
cDNA prøve 3

Tabel 2: materialer til kvantitative real-time PCR fra cDNA prøver. Nødvendige mængde af ingredienser til at forberede en prøve for qPCR en master mix.

  1. Placer hver prøve i de respektive brønde.
  2. Design prøve layout til 96 godt qPCR pladen. For hver prøve og analyseret gen, udføre reaktionen i tre, eller i hvert fald i dubletter.
  3. Forsegle 96 godt pladen med en optisk klar selvklæbende dækning.
  4. Quick-spin plade til at tillade reaktionsblandingen til at nå bunden af hver brønd.
  5. Køre RT-qPCR ifølge den følgende termiske graduering:
    1) 50 ° C i 2 min
    2) 95 ° C i 2 min
    3) 95 ° C i 15 s
    4) tage læsning
    5) 60 ° C for 1,5 min
    6) Gentag trin 3 for 39 gange
  6. Kør følgende termisk farveforløbet i forlængelse af ovenstående at bestemme smeltende kurve, som angiver enkelt produkt forstærkning.
    7) 65 ° C i 0.31 min
    8) +0.5 ° C/cyklus
    9) plade læse
    10) Gentag trin 8 til 60 gange indtil nå 95 ° C
    11) 72 ° C i 2 min

4. Agarosen gelelektroforese at bekræfte enkelt gen forstærkning

  1. Forberede 1%-agarosegel i 1 x TBE buffer.
  2. Tilsæt ethidiumbromid (EtBr) i varme (~ 50 ° C) gel til at opnå en endelig koncentration på cirka 0,2-0,5 µg/mL. EtBR binder med DNA og gør det muligt at være visualiseret under UV-lys i en gel imager.
  3. Hæld varm gel i en gel bakke leveres med en elektroforese gel boks. Fastgør den medfølgende kam stramt for ensartet brønde.
  4. Tillad gel til resten og afkøles til stuetemperatur (RT) for ~ 30 min.
  5. Når gelen er størknet, skal du placere gel og bakke i boksen gel.
  6. Udfylde boksen gel med 1 x TBE buffer, indtil gel er helt dækket.
  7. Mål koncentrationen af DNA fra PCR forstærkning proces ved hjælp af en UV-spektrometer.
  8. Tage ~ 15 ng af DNA i en lille PCR rør, tilsæt 5 µL af farvestof, og tilføje den nødvendige mængde af nukleasen-gratis vand til at opnå en 15 µL samlede volumen.
  9. Indlæse DNA ladder og prøver til brøndene.
  10. Kør gelen på 100 V, indtil linjen farvestof er ca 75% - 80% ned gel.
    Bemærk: Sørg for gel løber fra en negativ til positiv ladning.
  11. Fjerne gel og placere den i gel imager til at visualisere DNA.

5. cellecyklus analyse

  1. Frø 5 x 105 celler for hver prøve i en T25 cm2 kolbe og udføre en Transfektion efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, trin 1-5.
  2. Efter 24 h og 48 h, derefter høste cellerne af trypsinization.
  3. Overføre celle suspensioner til 15 mL sterilt rør og mærke dem ordentligt.
  4. Der centrifugeres prøver henne ved 751 x g i 5 min, og supernatanten.
  5. Der tilsættes 2 mL iskold 1 x PBS, vortex, og der centrifugeres ved 751 x g i 5 min. supernatanten.
  6. Gentag trinnet vask med 1 x PBS til at fjerne resterende medier.
  7. Resuspend og bryde pelleten ved at tilføje 200 µL af iskold 1 x PBS af pipettering.
  8. Fix cellerne ved at tilføje 2 mL af 70% iskold ethanol dråbevis rør mens vortexing forsigtigt.
  9. Inkuber rør i 30 min på RT og placere rør ved 4 ° C i 1 time.
  10. Fjerne rør fra 4 ° C, og der centrifugeres ved 751 x g i 5 min.
  11. Der tilsættes 2 mL iskold 1 x PBS, vortex, og der centrifugeres ved 751 x g i 5 min. supernatanten.
  12. Tilsættes 500 µL 1 x PBS med propidium Iodid (50 µg/mL) og ribonuklease en (200 µg/mL)
  13. Inkuber i 30 min. ved RT samtidig beskytte prøverne fra lys.
  14. Erhverve data på flow Flowcytometret. Bruge frem vs side scatter (FSC vs SSC) til at vælge den største befolkning af celler, undtagen vragrester i nederste venstre hjørne af FSC vs SSC tæthed plot og celle klynger på top til top-højre side af FSC vs SSC tæthed plot.
  15. Analysere data til identifikation af cellepopulationer pr. celle cyklus scene med passende software.

6. apoptose assay

  1. Frø 5 x 105 celler for hver prøve i en T25 cm2 kolbe og udføre en Transfektion efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, trin 1-5.
  2. Efter 24 h og 48 h, høste cellerne af trypsinization.
  3. Overføre celle suspensioner til 15 mL sterilt rør og mærke dem ordentligt.
  4. Der centrifugeres ved 751 x g i 5 min og supernatanten.
  5. Der tilsættes 2 mL iskold 1 x PBS, vortex, og der centrifugeres ved 751 x g i 5 min. supernatanten.
  6. Gentag trinnet vask med 1 x PBS til at fjerne resterende medier.
  7. Fortynde 10 x Annexin V binding buffer til 1 x med iskold dH2O.
  8. Der tilsættes 1 mL af 1 x Annexin V binding buffer for hvert prøveglas og resuspend forsigtigt.
  9. Sted 96 µL i cellesuspension i 1,5 mL microcentrifuge rør.
  10. Tilføj 1 µL af Annexin V-FITC-konjugat og 12,5 µL af propidium Iodid (PI) at tuben indeholder cellesuspension.
  11. Inkuber cellesuspension til 10 min på is i mørke.
  12. Tilføje 250 µL iskold 1 x Annexin V binding buffer til hvert prøveglas til at fortynde.
  13. Analysere prøver med flow Flowcytometret straks.

7. protein udtryk af antistof cellecyklus microarray

  1. Frø 5 x 105 celler for hver prøve i T25 cm2 kolber og udføre en Transfektion efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, trin 1-5.
  2. Efter 24 h og 48 h, høste celler af trypsinization.
  3. Overføre celle suspensioner til 15 mL rør og mærke dem i overensstemmelse hermed.
  4. Der centrifugeres ved 751 x g i 5 min og supernatanten.
  5. Der tilsættes 2 mL iskold 1 x PBS, vortex og centrifugeres ved 751 x g i 5 min. supernatanten.
  6. Gentag trinnet vask med 1 x PBS.
  7. Tilsæt 150 µL af lysisbuffer suppleret med proteasehæmmere. Med pipette overfoeres op og ned forsigtigt at forstyrre cellemembraner.
  8. For at undgå enhver lysis buffer interferens, udføre en buffer exchange for at erstatte lysisbuffer med mærkning buffer, ved hjælp af producentens opløsningsmiddel udveksle kolonner.
  9. Kvantificere den samlede protein med en BCA assay.
  10. Tage 70 µg protein prøve og tilføje mærkning buffer for at opnå en endelige mængden af 75 µL.
  11. Tilsættes 100 µL af dimethylformamid (DMF) 1 mg biotin reagens (biotin/DMF).
  12. Tilføje 3 µL af biotin/DMF til hver protein prøve (biotinylated protein prøve) og inkuberes i 2 timer ved RT.
  13. Tilføje 35 µL af stop reagens og mix af vortexing.
  14. Inkuber prøver på RT for 30 min.
  15. Fjerne microarray dias fra køleskabet, så de varme til RT i 1 time før brug.
  16. Udføre blokerer for ikke-specifik binding ved at inkubere dias med 3% tør mælk løsning (i blokerende reagens producenten) i en petriskål med kontinuerlig ryster for 45 min på RT.
  17. Vaske dias med ddH2O vand (medmindre andet er angivet, vask finder sted med ddH2O).
  18. Gentag trinnet vask ~ 10 x hen til helt ophæve den blokerende løsning fra dias overflader. Det er vigtigt at opnå en ensartet og lav baggrund.
  19. Fjerne overdreven vand fra dias overflader og fortsætte til næste trin uden at lade dias tørre.
  20. Forberede kobling løsning ved at opløse 3% tør mælk i en kobling reagens.
  21. Tilføj 6 mL af opløsningen kobling og at det fulde antal tidligere forberedt biotinylated protein prøve fra trin 7.12.
  22. Sted ét dias i et godt kobling kammer leveres af leverandøren og tilføje ~ 6 mL af protein kobling mix til den.
    Bemærk: Sørge for at diasset er helt nedsænket i protein kobling mix løsning.
  23. Dække kobling kammer og inkuberes i 2 timer ved RT med kontinuerlig agitation i en orbitalryster.
  24. Overføre dias til en petriskål og der tilsættes 30 mL 1 x vask buffer. Placer petriskålen i orbitalryster, rystes i 10 min, og kassér løsningen.
  25. Gentag trin 7.24 2 x.
  26. Skyl dias med ddH2O vand grundigt som beskrevet i trin 7.17 og 7.18 og Fortsæt til næste trin straks at undgå udtørring.
  27. Tilføj 30 µL af Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) i 30 mL af påvisning buffer.
  28. Placer diasset i en petriskål og der tilsættes 30 mL påvisning buffer indeholdende Cy3-streptavidin.
  29. Inkuber i en orbitalryster i 20 min. under konstant omrystning beskyttet mod lys.
    Bemærk: Cy-3 er et fluorescerende farvestof. Dæk med alufolie eller drive mørk betingelser at opretholde fluorescens intensitet.
  30. Udfør trin 7,24-7.26 og tillade diaset og tør med en blid luftstrøm fra eller lægger diasset i en 50 mL konisk rør og centrifugeres ved 1300 x g i 5-10 min.
  31. Placer diasset i diasholderen og tildækkes med aluminiumsfolie.
  32. Scanne dias i en microarray scanner med de passende excitations- og bølgelængder. I forbindelse med Cy3, excitation bølgelængde peak er på ~ 550 nm og emission peak på ~ 570 nm.
  33. Analysere data (Se Tabel af materialer) for software, der bruges).

8. RNA sekventering

  1. Frø 5 x 105 celler for hver prøve i T25 cm2 kolber og udføre en Transfektion efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 1, trin 1-5.
  2. Efter 24 h og 48 h, høste cellerne af trypsinization.
  3. Overføre celle suspensioner til 15 mL rør og mærke dem i overensstemmelse hermed.
  4. Uddrag RNA ifølge § 2, trin 1-6.
  5. Check RNA kvalitet samt koncentration med en bioanalyzer. En RNA integritet score (RIN) over otte og passende histogrammer er nødvendige for at bekræfte RNA kvalitet.
  6. Fra den samlede RNA, bruge ~ 2 µg af prøven til RNA sekventering (messenger RNA fra total RNA)
  7. Sekvens bruger en næste-generations sequencer11.
  8. Køre kvalitet trimning og kort med en reference genom fra FASTQ filer genereres fra RNA sekventering maskine11.
  9. Uploade FASTQ filer og raw Læs count data til genbankstandarderne, ifølge vejledningen i den < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> hjemmeside.
    Bemærk: Se stammesamlingsnummer SRP133420 for tidligere resultater.

9. tube dannelse assay

  1. Vurdere angiogene miRNA-transfekteret menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVECs) 36 h efter Transfektion, som beskrevet i afsnit 1, trin 1-5, ved hjælp af HUVEC celler i stedet for A549 celler.
  2. Sulte HUVECs med M199 sult medier i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  3. Fjerne nedsat vækst faktor basalmembranen matrix fra-80 ° C og opbevares ved 4 ° C natten over, giver mulighed for gradvis optøning at undgå boble dannelse og polymerisering.
  4. Forsigtigt og langsomt pels wells af en 96 godt plade med 0,04 mL af nedsat vækst faktor basalmembranen matrix, undgå boble dannelse. Udføre hele proceduren under en laminar flow hætte.
  5. Udfylde tilstødende wells af 96 godt plade med 0,1 mL PBS til at bevare fugt og opretholde temperaturen.
  6. Inkuber 96 godt pladen ved 37 ° C i mindst 20 min., således at polymerisering af basalmembranen ekstrakt er opnået. Ikke Inkuber i højst 1 h.
  7. Trypsinize transfekteret HUVECs fra hver gruppe og resuspend i medium M199 i en koncentration på 1 x 105 celler/mL.
  8. Tilføje 0,1 mL af hver cellesuspension til brøndene indeholdende polymere basalmembranen matrix i 96 godt plade.
  9. Inkuber 96 godt pladen ved 37 ° C med 5% CO2 , mens udarbejdelsen af vækstfaktorer finder sted. Forberedelse af vækstfaktorer også foregår under laminar flow hætte.
  10. Rekonstruere vækstfaktor (VEGF) i 2 x den ønskede slutkoncentration (4 ng/mL koncentration for 2 ng/mL endelige koncentration) og tilsættes 0,1 mL af vækstfaktor-holdige M199 sult medium oven på 0,1 mL M199 sult medium med celler. For ikke-VEGF-behandlede wells, tilføje 0,1 mL af M199 sult medium oven på 0,1 mL M199 sult medium med celler.
  11. Inkuber 96 godt pladen i 6 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  12. Fremskaf billeder i hver brønd med 4 x forstørrelse, ved hjælp af en brightfield mikroskop forbundet med et digitalt kamera for enden af inkubationstiden.
  13. Behandle billeder med software udstyret med en "angiogenese analyzer" plug-in-19. Brug tre parametre, antallet af knudepunkter, antallet af vejkryds, og samlede spire længde, for at sammenligne effekten af miRNA behandling på angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gen expression analyse ved hjælp af RT-qPCR og gel elektroforese

Differential gen expression analyse ved hjælp af RT-qPCR demonstreret betydelige downregulation af målrettede generne CDK1, CDK4 og CDK6. CDK1 og CDK4/6 blev vist sig at være medvirkende til G2/M og G1/S overgange, henholdsvis. Den udførte analyse tilladt direkte sammenligning mellem individuelle miRs og kombinatorisk miR aktivitet. Brugen af scramble siRNA med den transfecting agent tilladt evaluering af enhver indblanding fra proceduren på fundet genet downregulation, som var minimal. Dataene var statistisk analyseret ved hjælp af tosidede student's t-test, ogp < 0,05 blev anset for statistisk signifikant (figur 1). Før qPCR, primer sekvenser blev evalueret ved hjælp af primer-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> for enkelt gen amplifikation. Dette blev også bekræftet ved at analysere amplification produkter gennem gelelektroforese. En enkelt band af DNA produkter blev registreret for hvert analyseret gen (figur 1 d), bekræfter enkelt gen amplifikation. CDK6 enkelt forstærkning blev bekræftet (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1 : Relative udtryk for CDK1, CDK4 og CDK6 gener som opdaget af qPCR og gel elektroforese analyse af DNA amplifikation produkter. miR-143 og miR 506 Transfektion af A549 celler inducerede downregulation af CDK1 (A), CDK4 (B) og CDK6 (C) downregulation på 24 h og 48 h efter Transfektion. DNA amplifikation produkter blev evalueret af gelelektroforese (D) at bekræfte enkelt gen amplifikation. GAPDH blev brugt som reference genet. Gennemsnit ± SEM, * p < 0,05; ** p < 0,01, to-sidede t-test. Dette tal er blevet ændret fra Hossian et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cellecyklus distribution ved hjælp af flowcytometri

Propidium Iodid farvning af cellulære nukleinsyrer er en standardmetode til at visualisere cellen befolkningen i forskellige faser i cellecyklus af kvantitering af DNA indhold. Kombinatorisk behandling af miR-143 og miR 506 standset cellecyklus på to kontrolposter, G0/G1 og G2/M, som angivet ved flow cytometric analyse (figur 2).

Figure 2
Figur 2 : Cellecyklus analyse af A549 celler transfekteret med miR-143 og miR-506 på 24 h og 48 h efter Transfektion. Celle populationer procentsatser for hver celle cyklus blev bestemt ved flowcytometri og DNA-bindende propidium Iodid. Gennemsnit ± SEM. Dette tal er genoptrykt med ændringer fra Hossian et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Annexin V/PI apoptose assay ved flowcytometri

Efter Transfektion af A549 celler med miR-143 og miR 506, en apoptose analyse blev udført ved hjælp af Annexin V og PI farvning og flow flowcytometri. Det blev identificeret, at kombinatorisk behandling induceret betydelig apoptose på 24 h og 48 h timepoints. I forhold til negative kontroller, blev procent-ændring af apoptotiske celler fastsat som opdaget af Annexin V positive celler som følge af miR behandling som præsenteret i figur 3.

Figure 3
Figur 3 : Illustrative analyse af apoptotiske celler. Transection med miR-143 og miR 506 steg procentdelen af Annexin V positiv A549 celler. Gennemsnit ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, to-sidede t-test. Dette tal er blevet ændret fra Hossian et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cellecyklus antistof microarray

Mekanistiske svar til behandling kan identificeres gennem ændringer i protein udtryk. Differential udtryk blev evalueret på et protein niveau af gener forbundet med cellecyklus pathway ved hjælp af en vej-specifikke antistof microarray. Protein ekstrakter blev brugt til analyse fra celler transfekteret med miR-143/506. Microarray analyse tilladt for semi-kvantitative analyse af ~ 60 cellecyklus-associerede proteiner, med seks replikater for hver specifikke antistoffer. Tilgangen giver mulighed for en bredere perspektiv af mekaniske opførsel inden for en bestemt sti, identifikation af molekylære mål for yderligere evaluering og udførelse af analyser på posttranslationel. På grund af de semi-kvantitative princippet om metoden skal nogen resultater på specifikke gener bekræftes gennem western blotting. Orientering, i denne analyse, var en nedsat udtryk for proteiner tilknyttet celle cyklus progression opdaget. Dette omfattede den målrettede CDK1 og CDK4 på både 24 h og 48 h efter Transfektion (figur 4A), som registreres af qPCR.

Figure 4
Figur 4 : Gen dysregulering som opdaget af microarray og RNA sekventering analyse. (A) Heatmap af cellecyklus pathway gen udtryk som opdaget af microarray analyse i protein ekstrakter fra A549 celler transfekteret med miR-143 og miR-506, på 24 h og 48 h efter Transfektion. B fold ændring af cellecyklus pathway gen udtryk fra A549 celler transfekteret med miR-143 og miR-506 på 24 h efter Transfektion som registreret af RNA sekventering. C Pathway aktivitet som analyseret af sti analyse software fra data indhentet fra RNA sekvensering. Dette tal er blevet ændret fra Hossian al.. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

RNA sekvensering og pathway analyse ved hjælp af sti analyse software

Næste generation sequencing analyserer præcist genekspression på RNA niveau. Metoden giver mulighed for identifikation af flere gen ændringer gennem en enkelt analyse (i denne protokol analyse fundet udtryk for > 18.000 gener). På grund af det store antal fundne gener, blev Bioinformatik analyse anvendt til effektiv bestemmelse af pathway adfærd (figur 4B). Softwaren blev derefter brugt (Se Tabel af materialer) at forudsige G1/S og G2/M fase arrestationer og downregulation af S fase indledning (figur 4 c). Derudover kan RNA sekventering resultater sammenlignes med qPCR data. I denne undersøgelse, RNA sekventering bekræftede resultaterne fra qPCR analyse, der viser en downregulation af CDK1 (48%, p < 0,001, FDR < 0,001), CDK4 (68%, p < 0,001, FDR < 0,001), og CDK6 (71%, < 0,001, FDR < 0,001) grund Kombinatorisk miR-143 og miR 506 aktivitet. Statistisk analyse blev udført af EdgeR software bruges til beregning af de relative genekspression, beregne p -værdier ved hjælp af Negative Binomial20,21. Bioinformatik analyse kan udføres for en funktionel evaluering af miRNA aktivitet og forudsigelse af potentielle molekylære mål, som illustreret i figur 5.

Figure 5
Figur 5 : Illustrative pathway og mekanistiske analyse som præsenteret af pathway analyse aoftware. RNA sequencing data blev analyseret fra A549 celler transfekteret med miR-143 og miR-506, 24 h efter Transfektion, ved hjælp af sti analyse software og identificerede kanoniske veje med den laveste (A) eller højeste b aktivering score. Softwaren leveres også forudsagt funktioner (C) og potentielle opstrøms lovgivere/mål (D). Dette tal er genoptrykt fra Hossian al.. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Endotel tube dannelse assay

In vitro-endotel tube dannelse assay er meget udbredt at studere angiogenese og er pålidelig, automatiseret og kvantificerbare22. Vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er en velkendt angiogene vækstfaktor23,24 og endotel tube dannelse promotor. I denne undersøgelse blev det identificeret, at kombinatorisk behandling af miR-143 og miR 506 ophæver VEGF-induceret angiogenese. Vejledende billeder af tube dannelse og effekten af behandlingen er præsenteret i figur 6.

Figure 6
Figur 6 : Repræsentant billeder i endothelial spirer af VEGF-behandlede vs ubehandlede HUVECs transfekteret med scramble miRNA, miRNA-143, miRNA-506, eller en kombination heraf. Billeder blev indhentet under brightfield mikroskop udstyret med et digitalt kamera under 4 x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNAs kan fungere som målrettede behandlinger til kræftbehandling, anerkende dysregulering af udtryk niveauer i syge vs normale væv. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme miRNAs, der potentielt standse cellecyklus progression i flere faser. Det blev konstateret, at miR-143 og miR 506 standse cellecyklus af kræftceller, og de præsenterede protokoller har til formål at forstå aktiviteten af denne kombinatorisk miRNA behandling.

De beskrevne metoder giver en overordnet forståelse på funktionen af miRNAs. Udfordringerne ved at studere miRNAs er forbundet med deres evne til at målrette flere gener og dermed påvirke flere veje. Beskrevet qPCR analyse giver mulighed for identifikation af udtryk af specifikke gener af interesse, hvis specifikke mål identificeres inden behandling. For eksempel, var det primære fokus her udtryk for CDK1 og CDK4/6 og celle cyklus.

Cellecyklus analyse ved hjælp af propidium Iodid og flow flowcytometri protokol er således en pålidelig tilgang til at registrere ændringer i cellepopulationer efter deres fase i celle cyklus. Metoden bygger på en forholdsmæssig forøgelse af fluorescens signal af PI, som binder sig til DNA, svarende til fase af cellecyklus. Kort, celler i fasen S syntetisere DNA, inducerende højere signaler end celler i G0/G1-fase, og celler i fasen G2 har kopieret deres DNA, producerer de mest intense signal.

Akkumulere beviser angiver tilslutning af skader til cellecyklus og udløsning af apoptose25. Metoden flow flowcytometri ved hjælp af Annexin VI/PI har konsekvent været anvendt til identifikation af inducerede apoptose i celler fra kemoterapibehandling. Dvs, blev en stærk apoptotiske svar identificeret på grund af kombinatorisk miRNA terapi, som var mere potent i forhold til den enkelte miRNAs.

Semi-kvantitativ protein antistof microarray er en følsom og pålidelig metode til at identificere protein udtryk ændringer relateret til specifikke biologiske svar26,27. Denne protokol anvendes en celle cyklus pathway-specifikke antistof microarray, som registreret udtryk ændringer i ~ 60 gener mellem behandlede og ubehandlede celler. Forsigtighed er nødvendig under vask skridt til at sikre, at processen er blevet grundigt udført og for at minimere baggrund signal. Derudover bør dias ikke blive tørt indtil eksperimentet er afsluttet.

Derimod giver RNA sekventering kvantitative gen udtryk analyse af flere gener på niveauet efter transskription. Et betydeligt stort antal analyserede gener (> 18.000 for RNA-seq vs 60 for microarray) giver mulighed for simultan analyse af flere veje og molekylære mål, og med større nøjagtighed. En sådan bred analyse er vigtig, da en enkelt miRNA kan binde til og målrette forskellige mRNAs. Derimod er pathway analyse af et stort antal gen dysregulations i sagens natur udfordrende. For eksempel, selvom RNA sekventering bekræftet vores qPCR data vedrørende CDK1 og CDK4/6 downregulation på grund af miRNA behandling, analysen også givet data om tusindvis af gener, der var også ned- eller op-reguleret. For at give sammenhæng til sådanne talrige gen dysregulations, blev sti analyse software brugt til at bestemme generelle virkninger af behandlingen på forskellige pathway og cellulære funktioner. Orientering, leveres softwaren, der scores repræsentant til aktivering (positiv z score) eller inaktivering (negativ z score) af bestemte funktioner eller veje, samt statistiske signifikans af analyse (figur 5)28.

Afslutningsvis, er studiet af miRNA aktivitet en udfordrende procedure. MiRNAs iboende evne til at påvirke flere gener kræver udnyttelsen af flere omfattende og kompliceret analysemetoder til at identificere potentielle aktivitet. Ikke overraskende er yderligere arbejde påkrævet til fuldt ud at forstå aktiviteterne af miR-143 og miR-506 i lungekræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne vil gerne anerkende John Caskey ved Louisiana State University for sin bistand på sti analyse af RNA sequencing data, og University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center næste Generation Sequencing kerne for udfører RNA sekvensering og data analyse. Denne forskning blev støttet af apotek College, University of Louisiana Monroe start-up finansiering og National Institutes of Health (NIH) gennem det nationale Institut for generel medicinsk videnskab tilskud 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

Ingen interessekonflikter er erklæret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

Kræftforskning sag 145 Transfektion miRNA lungekræft celle cyklus apoptose angiogenese RNA sekventering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analyse af kombinatorisk miRNA behandlinger til at regulere cellecyklus og angiogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter