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Summary
miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA 治療細胞周期と血管新生を阻止の活動を識別するために使用されます。
Abstract
肺がん (LC) は、世界中の癌関連死亡の主要な原因です。他の癌細胞と同様に、液晶セルの基本的な特徴は、無秩序な増殖と細胞分裂です。細胞周期の進行の停止によって増殖抑制は、LC を含むがん治療の有望なアプローチをする示されています。
miRNA 治療重要な転写後遺伝子調節因子として浮上しているし、ますますがん治療で使用するために検討されています。近作では、ミール 143 とミール-506、細胞周期の進行を調節する 2 つの Mirna を利用しました。A549 非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞をトランスフェクションした、遺伝子発現を解析していた、治療によるアポトーシスの活動を最後に行った。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のダウンレギュレーションが検出された (すなわち、CDK1、CDK4、CDK6) 細胞周期を G1 ・ S ・ G2/M 相転移で停止し、。経路分析では、潜在的な抗血管新生治療のアプローチを多面的な活動に寄与する活動を示した。ここでは、血管新生の阻害によって細胞周期抑制、アポトーシスの誘導、治療の血管内皮細胞に対する影響についての miRNA の活動を識別するために使用する方法論が説明されます。ここに提示されたメソッドが miRNA 治療と対応するアクティビティに関する今後の研究をサポートすることと、代表的なデータが解析中に他の研究者を導くことが望まれます。
Introduction
細胞周期は DNA ・細胞増殖分裂プロセス1の重複を許可する複数の規制イベントの組み合わせです。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) を調節する細胞周期2を推進しています。その中で、分裂 CDK (CDK1) と中間期 Cdk (CDK2、CDK4, CDK6) 細胞周期進行3で極めて重要な役割があります。網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb) は、CDK4/CDK6 複雑な細胞周期進行4を許可するによりリン酸化され、CDK1 活性化5正常な細胞分裂に不可欠です。多数の CDK 阻害剤を開発し、がん治療における Cdk をターゲットの可能性を示す最後の数十年間、臨床試験で評価。乳癌の治療のため 3 CDK 阻害剤が承認されている実際には、最近6,7,8、の9,10。したがって、Cdk、とくに CDK1 と CDK4/6 は癌細胞の進行を調節するのには大きな関心と。
Mirna (miRs)、小さい、非コーディングの Rna とすべてのヒトの遺伝子11の約 30% を調節する遺伝子発現の転写後レギュレータ。彼らの活動は、翻訳抑制またはメッセンジャー Rna (Mrna)12の分解に基づいています。以上 5,000 Mirna が同定されているその生物学的意義の説明と単一の miRNA の分子は複数遺伝子11,13を調整できます。もっと重大に、miRNA の表現は様々 な疾患やがん13を含む病気の状態に関連付けられています。実際には、miRNAs 発癌性として特徴づけられているまたは腫瘍抑制、腫瘍の開発そして進行の14,のための15を抑制または促進することができます。罹病組織における Mirna の相対式は、病気の進行を調節することがしたがって、miRNAs の外因性の配信には、治療の可能性があります。
肺癌は、癌関連死の主要な原因よりすべての肺悪性腫瘍の 60% が非小細胞肺がん16,1720% 未満の 5 年生存率は18。ミール-143-3 p とミール-506-3 p の使用は肺がん細胞11で細胞周期をターゲットに最近行った。ミール 143 とミール 506 CDK1 と CDK4/CDK6、相補性は、シーケンス、A549 細胞に対するこれら 2 つ miRs の影響を分析しました。実験の詳細を提示し、本稿で説明。遺伝子発現、細胞周期の進行、およびアポトーシスは、さまざまな実験的デザインと縦長の次のトランスフェクションを用いて評価しました。我々 は特定の遺伝子発現を測定するマイクロ アレイ解析と共にリアルタイム定量 PCR (RT qPCR) を使用し、次世代 RNA シーケンスは遺伝子調節不全11を決定に使用されました。後者の方法は、たくさんの遺伝子は 1 つの実験的解析から解明できる、高い感度と再現性、各遺伝子の転写の相対的な豊かさを識別します。また、miRNA によるアポトーシス分析を行った、ここに記載されています。バイオインフォマティクスは、パスウェイ解析を補った。ここに示すプロトコル、組合せミール 143 の潜在的なミール 506 治療上の分析のために使用されます。
このプロトコルの主な目的は、細胞周期にフォーカスを持つセルの miRNAs の影響を特定します。さまざまなテクニックは紹介前訳語 (qPCR) 詳しく説明して新規の遺伝子発現解析からスパン マイクロ アレイ解析など、タンパク質レベルで遺伝子分析技術。このレポートは、miRNAs と働くことに興味を持って研究に役立つことが期待されます。さらに、細胞周期のフローサイトメトリー解析と細胞のアポトーシスの方法論を提示します。
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Protocol
1. ミール 143 とミール 506 トランスフェクション
注意: は、記述されている実験の実行中、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用します。必要な場合は、キャビネットのファンに気道をブロックまたは層流気流を乱すことがなく、安全キャビネットを使用します。製造元によって説明するよう常に適切な高さに保護ガラス ウィンドウを設定します。
- 種子、T25 cm2フラスコ/6/96 ウェル プレート DMEM/F12K メディアの非小細胞肺癌 A549 細胞 10 %fbs と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (培地) ティッシュ文化フードを補充し、37 ° C 5% CO2組織文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。
- ミール 143 および/またはミール 506 mimics を中断またはエージェントの株と siRNA をスクランブル (株エージェントの 14 μ L で混合されたミールの 2.4 μ g;材料の表を参照してください) トランスフェクション メディアと 1.5 mL の血清、抗生物質フリーの 500 μ L に DMEM/F12K メディアで、最終的なマイクロ Rna 濃度 100 nM。マイクロ Rna 量は、さまざまな細胞や濃度の最適化を必要があります。適切なアプローチは、興味の遺伝子の発現のダウンレギュレーションの評価とマイクロ Rna (すなわち、50-200 nM) の濃度の増加とともに細胞のトランスフェクションを含まれます。
- フラスコ ・ プレートから文化メディアを削除し、1 × PBS で 1 回洗浄します。
- エージェント錯体の miRNA/スクランブル株を追加し、, 6 時間 5% CO2と 37 ° C で (フラスコ サイズは、追加されたインキュベーション ボリュームを定義します)。
- 培地 4 mL でメディアを交換し、24 時間または 48 時間のセルを孵化させなさい。
- 各 T25 cm2フラスコに 1 mL のトリプシン-EDTA を追加することによって、新鮮で transfected セルを収穫、37 ° C で 5 ~ 10 分間インキュベートし、細胞を収穫する培地 3 mL を追加します。別マーク 15 mL チューブに各フラスコの内容を配置します。ティッシュ文化フードで働いてください。
- 751 x gで 5 分遠心し、上清を除去します。
注: 注意が必要上清除去中にチューブの攪拌は、細胞の損失を引き起こす可能性があります。 - 751 x g.で 2 mL の 1x PBS と 5 分間遠心を追加します。
- 手順 7 と 8 を一度メディアと上澄みの痕跡を削除する繰り返します。
注: この段階では、サンプル チューブが-80 ° C で保存することができます。 またはすぐに使用することができます。
2. RNA の抽出
- 70% イソプロピル アルコールと RNAse 除染液を噴霧して作業領域をクリーンアップします。
- 適切な RNA を使用して RNA の抽出を実行する必要がありますキット (材料の表を参照してください)。
- -80 ° C からチューブを外し、解凍できるように。換散バッファーの細胞膜を破るを上下にピペット 300 μ L を追加します。
- 100% 超純粋なエタノールの等量を追加します。
- よく混ぜるし、列を分離する場所します。
- 11 と 30 s の流れを介して削除 16 x gの遠心分離機します。
- 洗浄バッファーとバッファーを削除する遠心分離機の 400 μ L を追加します。
- DNA の消化力の 75 μ L で私は各サンプルのバッファーに格納し、15 分間インキュベート DNAse の 5 μ L を追加します。
- 400 μ L の RNA の準備のバッファーでサンプルを洗います。
- RNA 洗浄バッファーで 2 倍を洗います。
- ヌクレアーゼ フリー水の列に追加、遠心分離機、[収集する RNA。
- 紫外線分光光度計と RNA 濃度を測定します。
3. RT qPCR
- RT qPCR、前に cDNA を合成します。後 RNA 濃度定量 PCR チューブの cDNA を準備する反応 20 μ L の最終巻に RNA の 1 μ g を配置します。常にクリーン ベンチで動作します。
- 他のすべての必要な成分は、表 1に含まれます。
| 食材 | 量 (μ L)/サンプル (20 μ L) |
| 5 X cDNA マスター ミックス | 4 |
| dNTPs | 2 |
| ランダム hexamers | 1 |
| RT エンハンサー | 1 |
| 裏面酵素ミックス | 1 |
| DNase、RNase フリー水 | 必要な数量を 20 μ L の RNA を追加した後 |
表 1:CDNA を合成する RNA のサンプルから用材。CDNA の統合のための 1 つのサンプルのマスター ミックスを準備する各成分の量が必要。
- サーマルサイクラー、以下の温度条件で孵化させなさい: 42 ° C、30 分;95 ° C、2 分;サンプルのコレクションまで 4 ° C。
- すぐに通常の PCR または qPCR、使用または-20 ° C で cDNA を格納
- DNase、RNase フリーの前方および逆プライマー ソリューション株式プライマー溶液から 10 μ M の濃度で水を準備します。
- サンプルの数によると、検出される各遺伝子の別のマスター ミックスを準備します。各 cDNA サンプル (qPCR よく)、反応量は、表 2によると用意しています。
| 食材 | 量 (μ L)/サンプル (20 μ L) |
| サイバー マスター ミックス | 10 |
| 前方のプライマー - 10 μ M | 2 |
| 逆プライマー - 10 μ M | 2 |
| DNase、RNase フリー水 | 3 |
| cDNA サンプル | 3 |
表 2: cDNA サンプルから量的なリアルタイム PCR のための材料です。QPCR のサンプルを 1 つのマスター ミックスを調製する成分の量が必要。
- それぞれの井戸で各サンプルを配置します。
- 96 よく qPCR プレートのサンプル レイアウトをデザインします。各サンプルと分析された遺伝子は、反応を実行する、トリプリケートで、少なくとも重複の。
- 光学透明粘着カバー付き 96 well プレートをシールします。
- クイック スピン プレート各井戸の底に到達する反応混合物を許可します。
- 次の温度勾配によると Rt-qpcr を実行します。
2 分の 1) 50 ° C
2 分の 2) 95 ° C
3) 95 ° C、15 s
4) の読書を取る
5) 60 ° C で 1.5 分
6) 39 回に手順 3 を繰り返します - 単一製品の増幅を示す溶解曲線を決定するためには、上記の継続で以下の熱勾配を実行します。
0.31 分 7) 65 ° C
0.5 ° C/サイクル
9) プレートを読む
10) 60 回 95 ° C に到達するまでの手順 8 を繰り返します
11) 72 ° C 2 分
4. 単一遺伝子の増幅を確認する Agarose ゲル電気泳動
- 1 x TBE バッファーに 1% の agarose のゲルを準備します。
- 臭化エチジウム (EtBr) 暖かい (~ 50 ° C) ゲルを加えて約 0.2 0.5 の最終的な集中を達成するまで μ g/mL。EtBR DNA と結合して、ゲルの撮像素子での紫外光下で視覚化することができます。
- 電気泳動ゲル] ボックスに付属しているゲル トレイ暖かいゲルを注ぎなさい。制服の井戸のため提供されている櫛を取り付けます。
- ~ 30 分間部屋の温度 (RT) クールな残りの部分にゲルを許可します。
- ゲルは固化時は、ジェル ボックスにゲルとトレイを置きます。
- ゲルが完全に覆われるまでは、1 x TBE のバッファーでゲル ボックスを入力します。
- 紫外分光計を用いた PCR 増幅過程から DNA の濃度を測定します。
- 〜 15 を取る小さな PCR チューブ内の DNA の ng の染料、5 μ l 添加しヌクレアーゼ フリー水 15 μ L の総ボリュームを達成するために必要な量を追加します。
- DNA の梯子とサンプルを井戸に読み込みます。
- 色素がゲルを約 75%-80% まで 100 V でゲルを実行します。
注: 正の電荷を負からゲルを実行されていることを確認します。 - ゲルを取り外し、DNA を可視化するゲル イメージャに置きます。
5. 細胞周期解析
- 各シード 5 x 10 の5セル T25 cm2フラスコでサンプルし、手順 1 ~ 5 の 1 に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
- 24 時間、48 時間後、trypsinization によってセルを収穫します。
- 15 mL 滅菌チューブに細胞懸濁液を転送し、正しくラベルを付ける。
- 751 x gで 5 分でサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
- 渦と 751 x gで 5 分間遠心上清を捨てなくては、2 mL の氷冷 1x PBS を追加します。
- 残留を削除する 1x PBS で洗浄手順を繰り返します。
- 再懸濁します、ピペッティングで冷えた 1 × PBS の 200 μ L を追加することによって餌を壊します。
- 優しくがらボルテックス チューブに滴 70% 冷たいエタノール 2 mL を追加してセルを修正します。
- チューブ RT で 30 分間インキュベートし、4 ° C 1 時間にチューブを置きます。
- 4 ° C 751 x gで 5 分間遠心からチューブを取り外します。
- 渦と 751 x gで 5 分間遠心上清を捨てなくては、2 mL の氷冷 1x PBS を追加します。
- 1x PBS propidium ヨウ化 (50 μ G/ml) とリボヌクレアーゼ (200 μ g/mL) を 500 μ l 添加します。
- 光からサンプルを保護しながら室温で 30 分間インキュベートします。
- 流れの cytometer でデータを取得します。前方側方散乱 FSC 対 SSC 密度プロットおよびセルのクラスターの左下隅で破片を除く細胞の主要な人口を選択する (FSC 対 SSC) 対上部上部に使用-FSC 対 SSC 密度プロットの右側にあります。
- 適切なソフトウェアと細胞周期の段階ごとの細胞集団の同定のためのデータを分析します。
6. アポトーシス アッセイ
- 各シード 5 x 10 の5セル T25 cm2フラスコでサンプルし、手順 1 ~ 5 の 1 に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
- 24 時間と 48 時間の後に、trypsinization によってセルを収穫します。
- 15 mL 滅菌チューブに細胞懸濁液を転送し、正しくラベルを付ける。
- 751 x gで 5 分で遠心し、上清を捨てます。
- 渦と 751 x gで 5 分間遠心上清を捨てなくては、2 mL の氷冷 1x PBS を追加します。
- 残留を削除する 1x PBS で洗浄手順を繰り返します。
- 冷たい dH2O. 1 x にアネキシン V 結合バッファー x 10 を希釈します。
- 各サンプル チューブに結合する Annexin V バッファー x 1 の 1 つの mL を追加し、優しく再懸濁します。
- 場所 96年 μ L のセルは、1.5 mL 遠心チューブに懸濁液。
- 細胞懸濁液を含むチューブにアネキシン V FITC 共役の 1 μ L と propidium ヨウ化 (PI) の 12.5 μ L を追加します。
- 暗闇の中で氷の上 10 分の細胞懸濁液を孵化させなさい。
- 希釈する各サンプル チューブに 250 μ L 冷たい 1 x アネキシン V 結合バッファーを追加します。
- すぐに流れの cytometer でサンプルを分析します。
7. 抗体細胞周期マイクロ アレイによる発現
- 各シード 5 x 10 の5セル T25 cm2フラスコでサンプルし、手順 1 ~ 5 の 1 に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
- 24 時間、48 時間後 trypsinization によってセルを収穫します。
- 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送して、それに応じてラベルに。
- 751 x gで 5 分で遠心し、上清を捨てます。
- 渦と 751 x gで 5 分間遠心上清を破棄、2 mL の氷冷 1x PBS を追加します。
- 1x PBS で洗浄手順を繰り返します。
- プロテアーゼ阻害剤を添加した換散バッファーの 150 μ L を追加します。上下ピペット優しく細胞膜を破壊します。
- 換散バッファー干渉を防ぐために、換散バッファーを置き換えます製造元の溶媒交換列を使用して、ラベルのバッファーにバッファー交換を実行します。
- BCA アッセイと総蛋白を定量化します。
- 70 μ g の蛋白質のサンプルを取るし、75 μ L の最終巻を達成するためにラベルのバッファーを追加します。
- ジメチルホルムアミド (DMF) の 100 μ L を 1 mg ビオチン試薬 (ビオチン/DMF) に追加します。
- 各蛋白質のサンプル (ビオチン化タンパク質サンプル) にビオチン/dmf 3 μ L を追加し、室温 2 時間インキュベート
- ボルテックスによって停止試薬とミックスの 35 μ L を追加します。
- 常温で 30 分間のサンプルをインキュベートします。
- 1 時間使用する前に RT に温めるので、冷蔵庫からマイクロ アレイ スライドを削除します。
- 右の 45 分の連続振動ペトリ皿で (ブロッキング試薬製造元によって提供される) で 3% 乾燥したミルク ソリューションとスライドの孵化によって非特異的結合のブロックを実行します
- 洗浄は ddH2O 水で滑る (指定しない場合、洗濯と起こる ddH2O)。
- スライド面からブロックのソリューションを完全に削除する 〜 10 x 洗浄手順を繰り返します。これは、制服、低バック グラウンドを達成するために重要です。
- スライド面から過剰な水分を除去、ドライ スライドをさせることがなく次のステップに進みます。
- 3% 乾燥したミルク カップリング試薬を溶解することにより結合ソリューションを準備します。
- 7.12 のステップからカップリング ソリューションの事前に準備されたビオチン化タンパク質サンプルの全数量を 6 mL を追加します。
- カップリングの部屋の 1 つの井戸の場所 1 つのスライドはベンダーによって提供されるし、ミックスを結合タンパク質の ~ 6 mL を追加します。
注: は、スライドはミックス ソリューションを結合タンパク質の水没を確認します。 - カップリング室をカバーし、軌道シェーカーの連続撹拌で常温 2 時間孵化させなさい。
- シャーレにスライドを転送し、30 mL の洗浄液 x 1 を追加します。軌道シェーカーにペトリ皿を置き、10 分間振る、溶液を廃棄します。
- 手順を繰り返します 7.24 2 x。
- 7.17 と 7.18 の手順で説明されているように広く ddH2O の水とスライドをリンス、乾燥を避けるためにすぐに次のステップに進みます。
- 30 mL の検出バッファーで Cy3 ストレプトアビジン (0.5 mg/mL) の 30 μ L を追加します。
- ペトリ皿にスライドを配置し、30 mL の Cy3 ストレプトアビジンを含む検出バッファーを追加します。
- 連続的な振動の光から保護された 20 分間軌道シェーカーで孵化させなさい。
注: Cy 3 は蛍光染料です。アルミ箔でカバーまたは蛍光強度を維持するために暗い条件の下で動作します。 - 乾燥空気の穏やかなストリームを使用してまたは 50 mL の円錐管と 1300 x gで 5-10 分間遠心するスライドを配置するスライドができ 7.24 7.26 の手順に従います。
- スライド ホルダーとアルミ箔でカバーにスライドを配置します。
- 適切な励起と放射の波長のマイクロ アレイ スキャナーでスライドをスキャンします。Cy3、励起波長ピーク 〜 570 ~ 550 nm、発光ピークの nm。
- 分析使用されるソフトウェアのデータ (テーブルの材料を参照))。
8. RNA シーケンス
- 各シード 5 x 10 の5セル T25 cm2フラスコでサンプルし、手順 1 ~ 5 の 1 に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
- 24 時間と 48 時間の後に、trypsinization によってセルを収穫します。
- 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送して、それに応じてラベルに。
- セクション 2、手順 1-6 によると RNA を抽出します。
- RNA の品質として、バイオアナライザーと濃度を確認してください。RNA 整合性 8 以上 (鈴) の得点し、適切なヒストグラムが RNA の品質を確認する必要。
- 総 RNA から rna シーケンス (総 RNA からのメッセンジャー RNA) 〜 2 μ g のサンプルを使用して、
- 次世代シーケンサーの11を使用してシーケンス。
- 品質トリミングを実行し、参照ゲノム配列機11RNA から生成された FASTQ ファイルからをマップします。
- 指示に従うジーンバンクに FASTQ ファイルと raw 読み取りカウント データをアップロード、< https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> のウェブサイト。
注: 以前の結果の受入番号 SRP133420 を参照してください。
9. 管形成アッセイ
- A549 細胞の代わりに血管内皮細胞を使用して手順 1-5、1 項で説明したよう、miRNA transfected ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) 36 h 後トランスフェクション、性血管新生を評価します。
- 5% CO2と 37 ° C で 4 h の M199 飢餓メディアで比較を飢えさせます。
- 減らされた成長因子基底膜マトリックス-80 ° C 4 ° c 夜間、店からバブル形成と重合を避けるために漸進的な分解を許可を削除します。
- 慎重に、ゆっくりとコートの減らされた成長因子基底膜マトリックス、バブル形成を回避の 0.04 ml 96 well プレートの井戸。層流フードの下で全体の手順を実行します。
- 湿度し、温度を維持する PBS の 0.1 ml 96 well プレートの隣接する井戸を埋めます。
- 基底膜抽出物の重合を実現できるように、少なくとも 20 分の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。1 時間以上インキュベートはないです。
- 各グループから transfected Huvec を trypsinize し、1 x 10 の5セル/mL の濃度で中型の M199 で再懸濁します。
- 96 ウェル プレートで重合の基底膜マトリックスを含む井戸に各細胞の懸濁液の 0.1 mL を追加します。
- 成長因子の準備が行われている間は、5% CO2と 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。成長因子の準備は層流フードの下でまた起こる。
- 最終目的濃度 (2 ng/mL 最終濃度の 4 ng/mL の濃度) × 2 の成長因子 (VEGF) を再構成し、セルの M199 飢餓培地を 0.1 mL 上に成長因子を含む M199 飢餓中の 0.1 mL を追加します。無処理 VEGF 井戸、M199 飢餓媒体上にセルの M199 飢餓培地を 0.1 mL の 0.1 mL を追加します。
- 5% CO2と 37 ° C で 6 h の 96 ウェル プレート、インキュベートします。
- 潜伏期間の終わりには、デジタル カメラと接続されているし、明視野顕微鏡を用いた 4 倍の倍率の各ウェルの画像を取得します。
- 画像処理ソフトウェア「血管新生アナライザー」プラグイン19装備。3 つのパラメーターを使用して、ノード数、接合、合計数芽の長さ、miRNA の血管新生治療の効果を比較します。
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Representative Results
RT qPCR とゲル電気泳動による遺伝子発現解析
Rt-qpcr を用いた差動遺伝子発現解析は、CDK1、CDK4, CDK6 ターゲット遺伝子の重要な低下を示した。CDK1 と CDK4/6 それぞれ G2 と G1/S 遷移のため尽力することが示されました。実行の分析は、個々 miRs と組合せミール活動間の直接比較を許可しました。スクランブル siRNA のプロシージャからの干渉の評価を許可 transfecting エージェントでの使用は、最小限だった遺伝子のダウンレギュレーションを検出しました。データを統計的に 2 尾スチューデントのtを使用して行った-テスト、およびp < 0.05 は、統計的に有意な (図 1) と考えられていた。QPCR、前にプライマー シーケンスが評価されたプライマー ブラストを使用して < 単一遺伝子増幅用 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/>。これはゲル電気泳動で増幅製品を分析することによっても確認されました。各解析遺伝子 (図 1)、単一の遺伝子の増幅を確認の dna の単一のバンドが検出されました。シングル増幅された CDK6 確認 (データは示されていない)。
図 1: 相対的な遺伝子の発現 CDK1、CDK4, CDK6 qPCR と DNA 増幅物のゲルの電気泳動分析によって検出された。A549 細胞のミール 143 とミール 506 トランスフェクションは、24 および 48 時間後トランスフェクション CDK1 (A)、CDK4 (B) および (C) CDK6 ダウンレギュレーションのダウンレギュレーションを誘導されます。DNA の増幅の製品は電気泳動単一遺伝子の増幅を確認する (D) によって評価されました。GAPDH は参照の遺伝子として使われました。平均 ± SEM * p < 0.05;* * p < 0.01、両側t-テストします。この図は、Hossian ら11から変更されているこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
フローサイトメトリーを用いた細胞周期分布
Propidium ヨウ化細胞の核酸染色は、DNA 量の定量による細胞周期の異なった段階のセル人口を可視化する標準的な方法です。フローサイトメトリーによる解析 (図 2) によって示されているように、ミール 143 とミール 506 の組合せ治療は G0/G1 および G2/M、2 つのチェックポイントで細胞周期を停止します。
図 2: A549 細胞の細胞周期解析をトランスフェクトしたミール 143 とミール-506 24 および 48 時間後トランスフェクションします。フローサイトメトリーと DNA 結合 propidium ヨウ化により各細胞周期の細胞の人口割合を求めた。平均 ± SEM.この図は Hossian ら11から変更と再版されるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
フローサイトメトリーによるアネキシン V/PI アポトーシス アッセイ
ミール 143 とミール 506 A549 細胞のトランスフェクション後アネキシン V と PI 染色とフローサイトメトリーを使用してアポトーシス分析を行った。組合せ治療が 24 時間および 48 時間の縦長で有意なアポトーシスを誘導したことが分かった。陰性対照と比較して、アポトーシス細胞の割合の変更は、図 3に示されるようにミール治療のためアネキシン V の陽性細胞によって検出されたを決定しました。
図 3: アポトーシス細胞の分析を例示します。ミール 143 とミール 506 断裂は、アネキシン V 陽性 A549 細胞のパーセントを増加しました。平均 ± SEM. * p < 0.05 * * p < 0.01、両側t-テストします。この図は、Hossian ら11から変更されているこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
細胞周期抗体のマイクロ アレイ
機械的応答処理には、蛋白質の表現の変更を識別できます。差分式は、経路特定の抗体のマイクロ アレイを用いた細胞周期経路に関わる遺伝子のタンパク質レベルで評価されました。蛋白質のエキスは、ミール-143/506 と transfected セルからの分析に使用されました。各抗体の六つのレプリケートで 〜 60 細胞周期関連蛋白の半定量分析に使用できるマイクロ アレイの分析。アプローチでは、さらに評価のための分子標的の同定、翻訳後修飾レベル分析の実行の特定の経路内に機械的行動のより広範な視点をことができます。法の半定量の原理により特定の遺伝子での結果は西部にしみが付くことによって確認する必要があります。直説法で、この分析で細胞周期の進行に関連付けられているタンパク質の発現の低下が検出されました。これに含まれている対象の CDK1 と CDK4 24 時間および 48 時間後トランスフェクション (図 4 a)、qPCR によって検出されました。
図 4: マイクロ アレイおよび RNA シーケンス解析によって検出された遺伝子調節不全。(A) 細胞周期経路遺伝子発現蛋白質のマイクロ アレイの分析によって検出されたヒートマップをミール 143 と transfected とミール-506、24 および 48 時間後トランスフェクション A549 細胞から抽出します。(A549 細胞から細胞周期経路遺伝子発現 B) フォールドの変更をトランスフェクトしたミール 143 とミール-506 で 24 h 後トランスフェクション RNA 塩基配列解読によって検出されました。(C) 経路活動として RNA 塩基配列解読から得られたデータからの経路分析ソフトウェアによって分析します。この図は、変更されているから Hossian et al.11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
経路解析ソフトウェアを用いた RNA シーケンスと経路分析
次世代シーケンスは、RNA レベルでの発現を正確に分析します。メソッドは、単一の分析を通じて複数の遺伝子変化の同定 (このプロトコル分析検出の表現 > 18,000 遺伝子)。検出された遺伝子の数が多い、バイオインフォマティクス解析は動作経路 (図 4 b) の効率を決定するため使用されました。ソフトウェアは、使用された (参照材料表) G1 ・ S ・ G2/M 相逮捕と S のダウンレギュレーション フェーズ開始 (図 4) を予測します。さらに、RNA 配列の結果は、qPCR データと比較できます。この研究では、RNA シーケンス CDK1 のダウンレギュレーションを示す qPCR 分析からの知見が確認 (48%、 p < 0.001、FDR < 0.001)、CDK4 (68%、 p < 0.001、FDR < 0.001)、および CDK6 (71%、< 0.001、FDR < 0.001) ために組合せミール 143 とミール 506 活動。負の二項20,21を使用して、 p値を計算する、相対的な遺伝子発現の計算に使用されるエッジャー ソフトウェアによって統計分析を行った。図 5に示すように、分子標的の miRNA 活動の機能性評価と予測のバイオインフォマティクス解析を実行できます。
図 5: 例示経路と経路分析 aoftware によって示されるとして解明します。RNA シーケンス データはスコアが最小 (A) または最高 (B) 活性化経路解析ソフトウェアと識別された正規の経路を使用してミール 143 とミール-506、24 h 後トランスフェクションをトランスフェクトした A549 細胞から分析しました。ソフトウェアには、予測関数 (C) および潜在的な上流のレギュレータ/ターゲット (D) も利用できます。この図 Hossian ら.からの転載です。11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
内皮の管形成アッセイ
培養内皮細胞の管状形成アッセイは血管新生の研究に用い、信頼性の高い、自動化、および定量的な22です。血管内皮増殖因子 (VEGF) はよく知られている血管新生増殖因子23,24と内皮の管形成プロモーターです。本研究ではミール 143 とミール 506 の組合せ治療が VEGF による血管新生を放棄が確認されました。管形成の指標画像と治療の効果は、図 6に掲載されています。
図 6: 非投与の比較対 VEGF 治療の血管内皮もやしの代表的な画像をスクランブル miRNA、miRNA 143、miRNA-506、またはそれらの組み合わせトランスフェクトした。写真は、デジタル カメラを搭載した明視野顕微鏡下下 4 倍の倍率を得られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Mirna の発現レベルの破綻を認識し、がん治療の標的治療として動作正常組織対病気にかかった。この研究の目的は潜在的に複数の段階の細胞周期の進行を止める Mirna を決定します。ミール 143 とミール 506 がこの組合せ miRNA 治療の活動を理解することを目的と示されたプロトコルや、がん細胞の細胞周期を停止が確認されました。
説明の方法論は、Mirna の機能の包括的な理解を提供します。Mirna を研究の課題は、複数の遺伝子をターゲットし、したがって複数の経路に影響を与える能力に関連付けられています。具体的な目標は、治療前に指定されている場合、説明 qPCR 分析は興味の特定の遺伝子の表現の識別を許します。たとえば、ここでの主な焦点 CDK1 と CDK4/6 と細胞周期の表現であった。
したがって、propidium ヨウ化と流れ cytometry のプロトコルを用いた細胞周期解析は細胞周期の段階に従って細胞数の変化を検出するための信頼性の高い方法です。このメソッドは pi で細胞周期の段階に対応する DNA に結合する蛍光信号の比例した増加に依存します。簡単に言えば、S 期の細胞は、G2 段階で G0/G1 期で細胞と細胞は、最も強烈な信号を生成、DNA を重複してより高い信号を誘発する DNA を合成します。
証拠の蓄積は細胞周期への損傷の接続とアポトーシス25のトリガーを示します。アネキシン VI/PI を使用して、フローサイトメトリー法は、化学療法による治療から細胞の誘導アポトーシスの同定に一貫して使用されています。直説法で、強いアポトーシス応答がされた個々 の miRNAs と比較してより強力な組合せの miRNA 治療により確認されました。
半定量的な蛋白質抗体のマイクロ アレイは、タンパク質発現変化特定に関連する生物学的反応26,27を識別するために高感度かつ信頼性の高い方法です。このプロトコルには、処理と未処理細胞間 ~ 60 遺伝子の表現の変更を検出する細胞周期経路特異抗体マイクロ アレイが使用されます。洗浄のステップ プロセスが徹底的に実行されていることを確認し、バック グラウンド信号を最小限に抑えるためには、注意が必要です。また、実験終了までスライドを乾燥なる必要がありますはないです。
対照的に、rna は転写後のレベルで、複数の遺伝子の量的遺伝子表現の分析を提供します。解析した遺伝子はかなり多数 (> マイクロ アレイ 60 対 RNA シーケンスの 18,000) 複数経路の分子標的と精度の高い定量分析を可能します。このような広範な分析は単一の miRNA にバインドし、異なる Mrna をターゲットとして、重要です。対照的に、遺伝子 dysregulations の多数の経路分析は本質的に挑戦です。たとえば、RNA シーケンスは、miRNA 治療のため CDK1 と CDK4/6 ダウンレギュレーションに関する qPCR データを確認、分析も提供データもダウンしていた遺伝子の何千もの- または調整されます。このような多数の遺伝子 dysregulations にコンテキストを提供するために経路解析ソフトウェアは、全体的な異なる経路と細胞機能に及ぼす治療の決定に使用されました。直説法で、ソフトウェアは、(正の z スコア) の活性化または不活性化 (負の z スコア) の特定の機能または経路分析 (図 5)28の統計的有意性をスコア担当者を提供されました。
結論としては、miRNA 活動の研究は、挑戦的な手順です。Mirna の固有容量に複数の遺伝子に影響を与えるには、潜在的な活動を識別する複数の精巧で、複雑な手法の活用が必要です。当然、さらに作業はミール 143 とミール-506 肺癌での活動を完全に理解する必要があります。
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Disclosures
著者らは RNA シーケンス データとテキサス大学南西医療センター、マクダーモット センター次世代シーケンシング コアのためのパスウェイ解析に彼の援助のためのルイジアナ州立大学ジョン Caskey を認識したいです。RNA シーケンスとデータ分析を実行します。この研究は、薬学の大学、ルイジアナ大学モンロー立ち上げ資金のため、国立機関の健康 (NIH) 国立研究所の一般的な医療科学助成金 5 P20 GM103424-15、3 P20 GM103424 15S1 をによって支えられました。
Acknowledgments
利害の対立が宣言されていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
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がん研究、問題 145、トランスフェクション、miRNA、肺癌、細胞周期、アポトーシス、血管新生、RNA シーケンスErratum
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
