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Summary
miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.
Abstract
폐 암 (LC)은 전세계 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 다른 암 세포와 마찬가지로, 액정 셀의 기본적인 특성은 관계가 없는 확산 및 세포 분열 이다. 억제 세포 주기 진행을 중단 하 여 확산의 LC를 포함 한 암 치료에 대 한 유망한 접근 되도록 표시 되었습니다.
miRNA 치료제 중요 한 post-transcriptional 유전자 레 귤 레이 터로 등장 하 고 암 치료에 사용 하기 위해 점점 공부 되 고 있다. 최근 작품에서 우리는 두 miRNAs, 143 미르와 미르-506, 세포 주기 진행 조절 하 활용. A549 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 세포 페 했다, 유전자 표현 변경 했다 분석 하 고 치료 때문에 apoptotic 활동 마지막으로 분석 했다. 종속 kinases (CDKs)의 Downregulation 감지 했다 (즉, CDK1, CDK4 그리고 CDK6), 세포 주기 G1/G2/M 및 상전이에 중단 하 고. 경로 분석 다각적인 활동 접근을 endows 치료의 잠재적인 항 혈관 신생 활동을 가리킨다. 여기, 설명 된 혈관 신생의 억제에 의해 세포 주기 억제, apoptosis의 유도 및 내 피 세포에 치료의 효과 관한 miRNA 활동을 식별 하기 위해 사용 하는 방법론입니다. 그것은 여기에 제시 된 방법 미르 치료제와 해당 활동에 미래 연구를 지원 합니다 및 대표적인 데이터 실험 분석 하는 동안 다른 연구자를 안내할 것입니다 기대.
Introduction
세포 주기 mitotic 프로세스1를 통해 DNA와 세포 확산의 중복을 허용 하는 여러 규제 이벤트의 조합 이다. 종속 kinases (CDKs)을 조절 하 고 세포 주기2를 홍보 합니다. 그 중, mitotic CDK (CDK1) 및 interphase CDKs (CDK2, CDK4, 및 CDK6)에 있는 중추적인 역할 세포 주기 진행3. Retinoblastoma 단백질 (Rb)는 CDK4/CDK6 복잡 한 세포 주기 진행4, 허용에 의해 phosphorylated 그리고 CDK1 활성화5성공적인 세포 분열 위해 필수적 이다. 수많은 CDK 억제제를 개발 하 고 지난 몇 년간 CDKs 암 치료에서 표적으로 하기의 가능성을 나타내는 임상 시험에서 평가 되었습니다. 사실, 3 CDK 억제제 유방암의 치료에 대 한 승인 되었습니다 최근6,7,8,,910. 따라서, CDKs, 그리고 특히, CDK1 및 CDK4/6, 암 세포의 진행을 조절에 큰 관심의.
(미르) miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 모든 인간의 유전자11의 약 30%를 조절 하는 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 터. 그들의 활동은 변환 억압 또는 메신저 RNAs (mRNAs)12의 저하를 기반으로 합니다. 그들의 생물학 중요성의 설명, 5000 개 이상의 miRNAs 확인 된 하 고 하나의 miRNA 분자 여러 유전자11,13를 통제할 수 있다. 더 중요 한 것은, miRNA 식 다른 질병 및 질병 상태, 암13를 포함 하 여 관련 된 되었습니다. 사실, miRNAs는 되었습니다 특징으로 종양 또는 종양 진압, 홍보 하거나 종양 개발 및 진행14,15억제 능력이 되 고. 병에 걸리는 조직에 miRNAs의 상대 식 질병 진행;를 통제할 수 있다 따라서, 외 인 납품 miRNAs의 치료 가능성이 있다.
폐암은 주요 원인이 암 관련 된 죽음의 그리고 이상의 모든 폐 악성 종양의 60%는 비 작은 세포 폐 암16,17, 20%의 5 년 생존 율과18. 미르-143-3 p와 미르-506-3 p를 사용 하 여 최근 폐 암 세포11에서 세포 주기를 대상으로 평가 했다. 143 미르와 미르-506 CDK1 및 CDK4/CDK6, complementarity 시퀀스 있고 A549 세포에 이러한 두 미르의 효과 분석 했다. 실험 내용은 제시 되며이 문서에서 설명. 유전자 발현, 세포 주기 진행 및 apoptosis 다른 실험적인 디자인 및 transfection 다음 timepoints를 사용 하 여 평가 되었다. 우리는 특정 유전자 발현을 측정 하 microarray 분석 함께 실시간 정량 PCR (RT-정량) 방법을 사용 하 고-세대 RNA 시퀀싱 글로벌 유전자 dysregulation11을 결정 하는 데 사용 되었다. 후자의 방법을 유전자의 수천은 단일 실험 분석에서 분석 될 수 있다 하는 동안 높은 감도와 재현성, 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 식별 합니다. 또한, miRNA 처리 때문 apoptotic 분석 수행 및 여기에 설명 되어. 생물 정보학 보충 통로 분석. 여기에 제시 된 프로토콜 사용 됩니다 분석 치료의 조합 미르-143의 잠재력과 미르-506.
이 프로토콜의 주요 목적은 세포, 세포 주기에 중점을 두고 miRNAs의 효력을 식별 하는 것 이다. 다양 한 기술 여기에 제시 된 유전자 표정 분석 (사용 하 여 정량) 정교 하 게 사전 번역 고 소설에서 microarray 분석 등 단백질 수준에 유전자 분석을 위한 기법. 그것은이 보고서는 miRNAs와 함께 작업에 관심이 연구원을 위한 도움이 기대. 또한, 세포 주기의 흐름 cytometric 분석 및 세포의 apoptosis에 대 한 방법론을 제시.
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Protocol
1. 미르-143 및 미르-506 transfection
주의: 라텍스 장갑, 보호 안경, 그리고 실험실 외 투를 사용 하 여 설명된 실험을 수행 하는 동안. 필요한 경우 biosafety 내각을 사용 하 여 캐비닛 팬에, 기도 차단 또는 판 상 공기 흐름을 방해 하지 않고. 항상 제조 업체에 의해 설명 된 대로 적절 한 높이에 보호 유리 창을 설정 합니다.
- T25 cm2 플라스 크/6/96 잘 접시 DMEM/F12K 미디어에서 씨 NSCLC A549 세포 10 %FBS 1% 페니실린-스 (문화 미디어) 조직 문화 후드에서 보충 하 고 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 미르-143 / 미르-506 모방, 일시 중단 또는 transfecting 에이전트와 siRNA를 출 격 (미르의 2.4 µ g 14 µ L transfecting 에이전트의 혼합 했다; 테이블의 자료를 참조) transfection 미디어와 1.5 mL 혈 청의와 항생제 무료 500 µ L에서 DMEM/F12K 미디어에는 마지막 미르 농도 100의 nM. 미르 금액 다른 셀 및 농도에 최적화를 해야 합니다. 적절 한 접근에는 미르 (즉, 50-200 nM)의 농도 및 관심사의 유전자의 식 downregulation의 평가 증가 함께 세포의 transfection 포함 됩니다.
- 플라스 크/접시에서 문화 미디어를 제거 하 고 한 번 1 x PBS로 세척.
- 미르/출 격 transfecting 에이전트 단지를 추가 하 고 37 ° C 6 h 5% CO2 에서 품 어 (플라스 크 크기 정의 추가 인큐베이션 볼륨).
- 문화 미디어의 4 mL와 함께 미디어를 교체 하 고 24 시간 및 48 h에 대 한 셀을 품 어.
- 각 T25 cm2 플라스 크에 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 여 trypsinization, 의해 transfected 세포를 수확 하 고 37 ° C에서 5-10 분 동안 품 어 배양 세포를 수확의 3 mL를 추가 합니다. 각 플라스 크의 내용을 별도, 표시 된 15 mL 튜브에 놓습니다. 조직 문화 후드에서 작동 합니다.
- 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
참고: 주의 필요 표면에 뜨는 제거 하는 동안 튜브의 동요 셀 손실 발생할 수 있습니다. - 751 x g. 에 1 x PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 2 개 mL를 추가
- 미디어와 상쾌한의 모든 흔적을 제거 하는 7, 8 번 단계를 반복 합니다.
참고:이 단계에서 샘플 튜브-80 ° C에 저장 될 수 있습니다 또는 즉시 사용할 수 있습니다.
2. RNA 추출
- 70% 이소프로필 알콜과 RNAse 오염 제거 솔루션으로 분사 하 여 작업 영역을 청소.
- RNA 추출 적절 한 RNA를 사용 하 여 수행 되어야 합니다 키트 ( 재료의 표참조).
- -80 ° C에서 튜브를 제거 하 고 해 동 하도록 허용. 세포의 용 해 버퍼의 아래로 세포 막 휴식을 피펫으로 300 µ L를 추가 합니다.
- 100% 초 순수 에탄올의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
- 잘 혼합 하 고 분리 하는 열에.
- 11와 16 x g 30 s를 통해 흐름 제거 사이 원심.
- 버퍼와 버퍼를 제거 하는 원심 분리기 세척의 400 µ L를 추가 합니다.
- DNAse I DNA 소화의 75 µ L 각 샘플에서 버퍼링 하 고 15 분 동안 품 어의 5 µ L를 추가 합니다.
- RNA 준비 버퍼의 400 µ L로 샘플을 씻으십시오.
- 워시 RNA 워시 버퍼 2 배.
- 추가 nuclease 무료 물 원심 분리기, 열을 다음 수집 RNA.
- UV 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 측정 합니다.
3입니다. 실시간 정량
- RT-정량, 전에 cDNA를 음성 합성. RNA 농도 정량화, 이후 PCR 튜브에 cDNA를 준비 하는 반응의 20 µ L 최종 볼륨에 RNA의 1 µ g를 배치 합니다. 항상 깨끗 한 벤치에 작동 합니다.
- 모든 다른 필요한 재료는 표 1에 포함 되어 있습니다.
| 재료 | 수량 (µ L) / 샘플 (20 µ L) |
| 5 X cDNA 마스터 믹스 | 4 |
| dNTPs | 2 |
| 임의의 hexamers | 1 |
| 실시간 증강 | 1 |
| 짝수로 효소 혼합 | 1 |
| DNase과 RNase 무료 물 | 20 µ L을 RNA를 추가한 후 필요한 수량 |
표 1: RNA 샘플에서 cDNA 합성에 대 한 자료. 마스터 믹스 cDNA 합성 한 샘플에 대 한 준비를 각각 재료의 수량을 필요 합니다.
- 다음 온도 조건 열 cycler에서 품 어: 30 분;에 대 한 42 ° C 95 ° C 2 분; 샘플 컬렉션까지 4 ° C입니다.
- 즉시를 사용 하 여 일반 PCR 또는 정량, 또는-20 ° c.에 cDNA를 저장
- 정방향 및 역방향 뇌관 솔루션 DNase/RNase 무료 주식 뇌관 솔루션에서 10 μ M의 농도에서 물 준비.
- 감지 되 고, 샘플의 수에 따라 각 유전자에 대 한 별도 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 cDNA 샘플 (잘 정량), 반응 수량 표 2에 따라 준비 됩니다.
| 재료 | 수량 (µ L) / 샘플 (20 µ L) |
| SYBR 마스터 믹스 | 10 |
| 앞으로 뇌관-10 μ M | 2 |
| 반전 뇌관-10 μ M | 2 |
| DNase과 RNase 무료 물 | 3 |
| cDNA 샘플 | 3 |
표 2: cDNA 샘플에서 실시간 양이 많은 PCR에 대 한 자료. 정량에 대 한 하나의 샘플에 대 한 마스터 믹스를 준비 하는 재료의 수량을 필요 합니다.
- 각 우물에 각 샘플을 배치 합니다.
- 96 잘 정량 플레이트에 대 한 샘플 레이아웃을 디자인 합니다. 각 샘플을 분석 된 유전자에 대 한 반응에서에서 수행 triplicates에서 최소한에 중복.
- 광학 투명 접착 커버 96 잘 접시를 봉인.
- 빠른 스핀 반응 혼합물 각 우물의 바닥에 도달 수 있도록 접시.
- 다음 열 그라데이션에 따라 실시간 정량 Pcr을 실행:
2 분 동안 1) 50 ° C
2 분 동안 2) 95 ° C
15 3) 95 ° C s
4)을 읽기
1.5 분 동안 5) 60 ° C
6) 39 시간을 위한 3 단계를 반복 - 위의 단일 제품 확대를 나타내는 용융 곡선을 결정 하는 계속에서 다음 열 그라디언트를 실행 합니다.
0.31 분 7) 65 ° C
8) +0.5 ° C/사이클
접시 9) 읽기
10) 95 ° C를 도달할 때까지 60 시간을 위한 8 단계를 반복
2 분 동안 11) 72 ° C
4. 단일 유전자 증폭을 확인 Agarose 젤 전기 이동 법
- 1 x TBE 버퍼에 1 %agarose 젤 준비.
- 추가 ethidium 평범한 사람 (EtBr) 따뜻한 (~ 50 ° C) 젤에 약 0.2-0.5의 최종 농도 달성 때까지 µ g/mL. EtBR dna 한다 UV 젤 영상에 빛에서 시각화 될 수 있습니다.
- 따뜻한 젤 전기 이동 법 젤 상자와 함께 제공 된 젤 트레이에 붓으십시오. 단단히 균일 한 우물에 대 한 제공 된 빗을 연결 합니다.
- 나머지를 젤 실내 온도 (RT) 멋진 ~ 30 분을 허용 합니다.
- 젤은 고형화 하는 때, 트레이 젤 젤 상자에 놓습니다.
- 채워 젤 상자 1 x TBE 버퍼 젤 완전히 덮여 때까지.
- UV 분석기를 사용 하 여 PCR 증폭 과정에서 DNA의 농도 측정 합니다.
- 받아 ~ 15 작은 PCR 튜브에 DNA의 ng 염료, 5 µ L을 추가 하 고 nuclease 무료 물 15 µ L 총 볼륨을 달성 하기 위해 필요한 금액을 추가.
- 우물에 DNA 사다리 및 샘플을 로드 합니다.
- 염료 라인 젤 아래로 75-80% 정도 될 때까지 100 V에서 젤을 실행 합니다.
참고: 젤 실행 네거티브에서 포지티브 차지 다는 것을 확인 하십시오. - 젤을 제거 하 고 DNA를 시각화 하 젤 영상에.
5. 세포 주기 분석
- 각 씨앗 5 x 105 셀 T25 cm2 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
- 24 시간 및 48 h 후 다음 trypsinization에 의해 셀 수확.
- 15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 제대로 그들을 분류.
- 샘플 5 분 751 x g 에서 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
- 잔여 미디어를 제거 하려면 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
- Resuspend 고 펠 릿 pipetting으로 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 200 µ L을 추가 하 여.
- 부드럽게 vortexing 동안 튜브를 70% 얼음 에탄올 dropwise의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 수정.
- RT에서 30 분 동안 튜브를 품 어 고 1 시간에 4 ° C에서 튜브를 배치 합니다.
- 4 ° C, 5 분 동안 751 x g 에서 원심 분리기에서 튜브를 제거 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
- Propidium 요오드 화물 (50 µ g/mL)와 ribonuclease는 (200 µ g/mL) 1 x PBS의 500 µ L을 추가
- 빛에서 샘플을 보호 하면서 RT에서 30 분 동안 품 어.
- 데이터 흐름 cytometer에 취득. 맨 상단에 사이드 분산형 (FSC 대 SSC) FSC 대 SSC 밀도 줄거리와 셀 클러스터의 하단 왼쪽된 모서리에 파편을 제외 하 고 셀의 주요 인구를 선택 대 앞으로 사용-FSC 대 SSC 밀도 플롯의 오른쪽.
- 적절 한 소프트웨어와 함께 세포 주기 단계 마다 세포 인구의 식별을 위해 데이터를 분석 합니다.
6. Apoptosis 분석 결과
- 각 씨앗 5 x 105 셀 T25 cm2 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
- 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
- 15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 제대로 그들을 분류.
- 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
- 잔여 미디어를 제거 하려면 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
- 10 차가운 dH2오 1 x Annexin V 바인딩 버퍼 배 희석
- 각 샘플 튜브를 Annexin V 바인딩 버퍼 x 1의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 resuspend.
- 장소 96 µ L의 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브.
- 세포 현 탁 액을 포함 하는 튜브를 Annexin V FITC 켤레의 1 µ L 및 propidium 요오드 화물 (PI)의 12.5 µ L를 추가 합니다.
- 어둠 속에서 얼음에 10 분 동안 세포 현 탁 액을 품 어.
- 희석을 각 샘플 튜브를 Annexin V 바인딩 버퍼 x 250 µ L 얼음 1을 추가 합니다.
- 즉시 교류 cytometer 샘플을 분석 합니다.
7. 단백질 항 체 세포 주기 microarray 식
- 각 씨앗 5 x 105 셀 T25 cm2 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
- 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
- 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 그에 따라 그들을 분류.
- 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이 및 751 x g 에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
- 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
- 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제와 보충의 150 µ L를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 세포 막 중단을 부드럽게.
- 어떤 세포의 용 해 버퍼 간섭 방지 하려면 제조업체의 용 매 교환 열을 사용 하 여 레이블 버퍼에 세포의 용 해 버퍼를 바꿉니다 버퍼 exchange를 수행 합니다.
- BCA 분석 결과 함께 총 단백질 계량.
- 70 µ g 단백질 샘플의 고 75 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 레이블 버퍼를 추가.
- 시 약 비오 틴 (biotin/DMF)의 1 밀리 그램의 dimethylformamide (DMF) 100 µ L를 추가 합니다.
- 각 단백질 샘플 (biotinylated 단백질 샘플) biotin/DMF의 3 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
- Vortexing에 의해 정지 시 약의 혼합 35 µ L를 추가 합니다.
- 30 분 동안 RT에서 샘플을 품 어.
- 그렇게 그들은 사용 하기 전에 1 시간을 위한 rt 따뜻한 냉장고에서 microarray 슬라이드를 제거 합니다.
- 일반적인 바인딩 (차단 시 약 제조업체에서 제공)에 3% 건조 우유 솔루션 슬라이드 실시간에서 45 분 연속 떨고와 페 트리 접시에 배양 하 여 차단 수행
- DdH2O 물으로 슬라이드를 세척 (다른 규정이 없는 한, 세척으로 일어난다 ddH2O).
- 세척 단계 ~ 10 x 슬라이드 표면에서 차단 솔루션을 완전히 제거를 반복 합니다. 이것은 균일 하 고 낮은 배경 달성 해야 합니다.
- 과도 한 물 슬라이드 표면에서 제거 하 고 건조 하는 슬라이드 없이 다음 단계로 진행.
- 결합 시에 3% 건조 우유를 용 해 하 여 커플링 솔루션을 준비 합니다.
- 단계의 7.12 이전 준비 biotinylated 단백질 샘플의 전체 수량을 커플링 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
- 장소 슬라이드에 커플링 챔버에의 한 잘 공급 업체에서 제공 하 고 혼합 결합 단백질의 ~ 6 mL를 추가 합니다.
참고: 슬라이드 혼합 솔루션을 결합 하는 단백질에 완전히 빠져들 확인 합니다. - 커플링 챔버를 커버 하 고 궤도 셰이 커에 지속적인 동요와 RT에 2 h에 대 한 품 어.
- 페 트리 접시에 슬라이드를 전송 하 고 버퍼를 세척 하는 x 1의 30 mL를 추가 합니다. 페 트리 접시 궤도 통에, 10 분 동안 흔들어 놓고 솔루션을 삭제 합니다.
- 반복 단계 7.24 2 x.
- 7.17-7.18 단계에 설명 된 대로 광범위 하 게 ddH2O 물으로 슬라이드를 헹 구 고 건조 하지 않도록 하는 즉시 다음 단계를 수행 하십시오.
- 검색 버퍼의 30 ml에서 Cy3 streptavidin (0.5 mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
- 슬라이드를 페 트리 접시에 놓고 Cy3 streptavidin 포함 된 감지 버퍼의 30 mL를 추가 합니다.
- 20 분 연속 떨고 빛에서 보호와 궤도 통에서 품 어.
참고: Cy-3는 형광 성 염료. 알루미늄 호 일로 다룹니다 또는 형광 강도 유지 하기 위해 어두운 조건 하에서 운영. - 7.24-7.26 단계를 수행 하 고 건조 한 공기의 부드러운 스트림을 사용 하 여 또는 50 mL 원뿔 튜브와 5-10 분 동안 1300 x g 에서 원심 분리기에 슬라이드를 삽입 하려면 슬라이드 허용.
- 슬라이드 슬라이드 홀더 및 알루미늄 호 일 덮개에 놓습니다.
- 적절 한 여기 및 방출 파장 microarray 스캐너에 슬라이드를 검사 합니다. Cy3, 경우 여기 파장 피크 ~ 550 ~ 570 nm와 방출 피크에 이다 nm.
- 소프트웨어 사용에 대 한 ( 재료의 표참조) 데이터 분석).
8. RNA 시퀀싱
- 각 씨앗 5 x 105 셀 T25 cm2 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
- 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
- 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 그에 따라 그들을 분류.
- 섹션 2, 1-6 단계에 따라 RNA를 추출 합니다.
- 농도 bioanalyzer와로 서 RNA 품질을 확인 합니다. RNA 무결성 (린) 8 위 점수와 적절 한 히스토그램은 RNA 품질을 확인 하는 데 필요한.
- 총 RNA에서 RNA 시퀀싱 (총 RNA에서 메신저 RNA)에 대 한 샘플의 ~ 2 µ g을 사용
- 11다음-세대 시퀀서 사용 하 여 시퀀스입니다.
- 품질 트리밍 실행 하 고 RNA 시퀀싱 컴퓨터11에서 생성 된 FASTQ 파일에서 참조 게놈 지도.
- FASTQ 파일 및 원시 읽기 카운트 데이터를 업로드의 지침에 따라 Genebank는 < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> 웹사이트.
참고: 이전 결과 대 한 승인 번호를 SRP133420을 참조 하십시오.
9. 관 형성 분석 결과
- 섹션 1, 대신 A549 세포 HUVEC 세포를 사용 하 여 1-5 단계에에서 설명 된 대로 miRNA 페 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 36 h 후 transfection, 신생 잠재력을 평가 합니다.
- 5% CO2와 37 ℃에서 4 h M199 기아 미디어와 HUVECs을 굶 어.
- 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스-80 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 저장소 버블 형성 및 중 합 방지 하기 위해 점진적 재개 허용을 제거 합니다.
- 신중 하 고 천천히 감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스, 거품 형성 방지의 0.04 mL와 함께 96 잘 접시의 웰 스 코트. 층 류 흐름 후드 아래 모든 절차를 수행 합니다.
- 습도 유지 하 고 온도 보존 하는 PBS의 0.1 mL로 96 잘 접시의 인접 한 우물을 채우십시오.
- 지하실 막 추출의 중 합 달성 된다 그래야 적어도 20 분 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 1 시간 이상에 대 한 품 어 하지 마십시오.
- 각 그룹에서 transfected HUVECs trypsinize 그리고 1 x 105 셀/mL의 농도에서 중간 M199에 resuspend.
- 96 잘 접시에 지하실 멤브레인 생산 매트릭스를 포함 하는 우물에 각 세포 현 탁 액 0.1 mL를 추가 합니다.
- 성장 요인의 준비는 동안 5% CO2 와 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 성장 요인의 준비 층 류 두건에서 또한 일어난다.
- Reconstitute 최종 원하는 농도 (4 ng/mL 농도 2 ng/mL 최종 농도) x 2에서 성장 인자 (VEGF)와 셀으로 M199 기아 매체의 0.1 mL 위에 M199 기아 매체 포함 하는 성장 인자의 0.1 mL를 추가 합니다. VEGF 치료 비 웰 스에 대 한 셀으로 M199 기아 매체의 0.1 mL 위에 M199 기아 매체의 0.1 mL를 추가 합니다.
- 5% CO2와 37 ℃에서 6 h 96 잘 접시를 품 어.
- 잠복기의 끝에, 4 배 확대, 명시 야 현미경 디지털 카메라 연결을 사용 하 여 각 잘의 이미지를 얻을.
- "신생 분석기" 플러그인19를 갖춘 소프트웨어 프로세스 이미지. 세 개의 매개 변수를 사용 하 여, 노드 수, 접합, 및 총의 수 새싹 길이, 신생에 미르 치료의 효과 비교.
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Representative Results
실시간 정량 Pcr 및 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 유전자 표정 분석
실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 차동 유전자 표정 분석 대상된 유전자 CDK1, CDK4, 및 CDK6의 상당한 downregulation 시연. CDK1 및 CDK4/6 될 G2/M과 g 1/S 전환에 대 한 각각을 표시 했다. 수행된 분석 개별 미르와 미르 조합 활동 사이 직접적인 비교를 허용. 평가 절차에서 어떠한 간섭의 허용 transfecting 에이전트와 함께 출 격 siRNA 사용 하 여 감지 유전자 downregulation를 최소화 했다. 데이터는 양측 스튜던트 t를 사용 하 여 분석 통계 되었다-테스트, 그리고p < 0.05 통계적 (그림 1)으로 간주 되었다. 정량, 전에 뇌관 시퀀스 뇌관 폭발을 사용 하 여 평가 했다 < 단일 유전자 증폭에 대 한 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/>. 이것 또한 젤 전기 이동 법을 통해 증폭 제품 분석에 의해 확인 되었다. DNA 제품의 단일 밴드 각 분석 된 유전자 (그림 1D), 단일 유전자 증폭을 확인에 대 한 검색 되었습니다. CDK6 단일 증폭 했다 확인 (데이터 표시 되지 않음).
그림 1 : CDK1, CDK4, 및 CDK6 유전자 정량, 그리고 DNA 증폭 제품의 젤 전기 이동 법 분석에 의해 감지의 상대 식. 143 미르와 미르-506 A549 세포의 transfection downregulation 24 시간 및 48 h 후 transfection에 CDK1 (A), CDK4 (B), CDK6 (C) downregulation의 유도. DNA 증폭 제품 젤 전기 이동 법 (D) 단일 유전자 증폭을 확인 하 여 평가 되었다. GAPDH 참조 유전자로 사용 되었다. 평균 ± SEM * p < 0.05; * * p < 0.01, 두 꼬리 t-테스트. 이 그림에서 Hossian 외.11수정 되었습니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
세포 주기 분포 cytometry 사용 하 여
Propidium 요오드 화물 세포 핵 산의 얼룩이 DNA 콘텐츠의 정량에 의해 세포 주기의 다른 단계에 있는 세포 인구를 시각화 하는 표준 방법입니다. 143 미르와 미르-506의 조합 치료 흐름 cytometric 분석 (그림 2)을 통해 표시 된 대로 두 개의 검문소, G0/G1 및 G2/M에서 세포 주기를 중단.
그림 2 : A549 세포의 세포 주기 분석 143 미르와 미르-506 24 시간 및 48 h 후 transfection transfected. 각 세포 주기 세포 인구 비율 cytometry 및 DNA 바인딩 propidium 요오드 화물에 의해 결정 되었다. 평균 ± SEM. 이 그림 수정 Hossian 외.11에서 재 인 쇄입니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Cytometry에 의해 annexin V/PI apoptosis 분석 결과
따라 143 미르와 미르-506 A549 세포의 transfection, apoptosis 분석 결과 Annexin V 및 PI 얼룩이 지 고 교류 cytometry 사용 하 여 수행 되었다. 그것은 조합 치료 24 시간 및 48 h timepoints에 중요 한 apoptosis를 유도 확인 되었다. 부정적인 컨트롤에 비해, apoptotic 세포의 % 변화 때문에 그림 3에 제시 된으로 미르 치료 Annexin V 긍정적인 세포에 의해 감지를 결정 했다.
그림 3 : Apoptotic 세포의 설명을 분석. 143 미르와 미르-506 transection Annexin V 긍정적인 A549 세포의 % 증가 했다. 평균 ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, 두 꼬리 t-테스트. 이 그림에서 Hossian 외.11수정 되었습니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
세포 주기 항 체 microarray
치료에 대 한 기계적 응답 단백질 표정 변화를 통해 확인할 수 있습니다. 차동 식 통로 특정 항 체 microarray를 사용 하 여 세포 주기 통로와 관련 된 유전자의 단백질 수준에서 평가 했다. 단백질 추출 셀 미르-143/506와 페에서 분석을 위해 사용 되었다. Microarray 분석 각 특정 항 체에 대 한 6 복제와 ~ 60 세포 주기 관련 단백질의 반 정량 분석에 대 한 허용. 접근 특정 통로, 추가 평가 대 한 분자 목표의 확인과 닢 수준에서 분석의 수행 내 기계적 행동의 광범위 한 관점을 수 있습니다. 방법의 반 양적 원리 때문 특정 유전자에 어떤 결과 서 부 럽을 통해 확인 될 필요가 있다. Indicatively,이 분석, 세포 주기 진행과 관련 된 단백질의 감소 식 감지 되었습니다. 이 포함 대상 CDK1 및 CDK4 24 시간 및 48 h 후 transfection (그림 4A), 정량에 의해 감지.
그림 4 : 유전자 dysregulation microarray 및 RNA 시퀀싱 분석에 의해 감지. (A) 세포 주기 통로 유전자 표현 microarray 분석 단백질에 의해 감지 Heatmap 미르-143와 transfected와 미르-506, 24 시간 및 48 h 후 transfection A549 세포에서 추출 합니다. (B) 배 변화 A549 세포에서 세포 주기 통로 유전자 식의 143 미르와 미르-506 24 h 후 transfection RNA 시퀀싱에 의해 감지에서 페. (C) 통로 활동에서 RNA 시퀀싱 데이터에서 경로 분석 소프트웨어에 의해 분석. 이 그림에서 Hossian 외. 수정 되었습니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
경로 분석 소프트웨어를 사용 하 여 RNA 시퀀싱 및 경로 분석
다음-세대 시퀀싱은 정확 하 게 RNA 수준에서 유전자 발현을 분석합니다. 메서드를 단일 분석을 통해 여러 유전자 변화의 식별에 대 한 수 있습니다 (이 프로토콜 분석 감지의 식 > 18000 유전자). 검색 된 유전자의 큰 숫자 때문에 생물 정보학 분석 통로 동작 (그림 4B)의 효율적인 결정 사용 되었다. 소프트웨어를 다음으로 사용 ( 재료의 표참조) G1/S와 G2/M 단계 체포와 S의 downregulation 단계 개시 (그림 4C) 예측. 또한, RNA 시퀀싱 결과 정량 데이터를 비교할 수 있습니다. 이 연구에서 RNA 시퀀싱 CDK1 downregulation를 나타내는 정량 분석에서 결과 확인 (48%, p < 0.001, 루즈벨트 < 0.001), CDK4 (68%, p < 0.001, 루즈벨트 < 0.001), 및 CDK6 (71%, < 0.001, 루즈벨트 < 0.001)로 인해 조합 143 미르와 미르-506 활동. 통계 분석은 부정적인 이항20,21을 사용 하 여 p 값을 계산 하는 상대 유전자 발현의 계산에 사용 되는 저 소프트웨어에 의해 수행 되었다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 miRNA 활동의 기능 평가 및 잠재적인 분자 대상의 예측에 대 한 생물 정보학 분석을 수행할 수 있습니다.
그림 5 : 설명 통로 통로 분석 aoftware에서와 같이 기계 분석. RNA 시퀀싱 데이터 143 미르와 미르-506, 24 h 후 transfection, 통로 분석 소프트웨어와 확인 된 정식 경로 사용 하 여 (A) 또는 높은 (B) 활성화 점수와 페 A549 세포에서 분석 했다. 소프트웨어는 또한 예측된 기능 (C) 및 잠재적인 업스트림 레 귤 레이 터/대상 (D) 제공. 이 그림은 Hossian 외 알. 에서 재 인 쇄 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
내 피 관 형성 분석 결과
생체 외에서 내 피 관 형성 분석 결과 신생 연구에 널리 이용 되 고 안정적이 고 자동화, 정량22. 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)는 잘 알려진 신생 성장 인자23,24 및 내 피 관 형성 발기인. 이 연구에서 그것은 143 미르와 미르-506의 조합 치료 VEGF 유발 신생 되어있는 확인 되었다. 관 형성의 지표 이미지와 치료의 효과 그림 6에 표시 됩니다.
그림 6 : 치료 비 HUVECs 대 VEGF 치료의 내 피 콩나물의 대표 이미지 출 격 미르, 미르-143, 미르-506, 또는 조합을 transfected. 사진 아래 4 배 확대 디지털 카메라를 갖춘 명시 야 현미경으로 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
miRNAs의 식 수준 dysregulation를 인식 하는 암 치료에 대 한 표적으로 한 치료로 서 작동할 수 정상 조직의 대 병. 이 연구 목적 miRNAs 잠재적으로 여러 단계 세포 주기 진행 중단을 결정. 그것은 143 미르와 미르-506 암 세포, 그리고이 조합 미르 치료의 활동을 이해 하는 목적으로 제시 프로토콜의 세포 주기 정지 확인 되었다.
설명된 방법론 miRNAs의 기능에 지배적인 이해를 제공합니다. 공부 하는 miRNAs의도 전에 그들의 능력을 여러 개의 유전자를 대상으로 하 고 따라서 여러 경로 영향을 미칠와 연결 됩니다. 설명된 정량 분석 구체적인 목표는 치료 전에 식별 하는 경우 관심의 특정 유전자의 표정의 식별 수 있습니다. 예를 들어 여기에 주요 초점 CDK1 및 CDK4/6과 세포 주기의 표현 이었다.
따라서, 세포 주기 분석 propidium 요오드 화물 및 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 세포 주기에서 그들의 단계에 따라 세포 인구에서 변경 감지 하는 신뢰할 수 있는 접근 이다. 방법은 형광 신호 세포 주기 단계에 해당 하는 DNA에 PI의 비례 증가에 의존 합니다. 간단히, S 단계에서 세포 G0/G1 단계에서 셀 및 셀 g 2 단계에서 가장 강한 신호를 생성 하는 그들의 DNA 복제는 보다 높은 신호를 유도 하는 DNA, 음성 합성.
증거를 축적의 세포 주기 손상의 연결 및 apoptosis25의 나타냅니다. Annexin VI/PI를 사용 하 여 교류 cytometry 방법은 지속적으로 화학 요법 치료에서 세포에서 유도 된 apoptosis의 식별을 위해 사용 되었습니다. Indicatively, 강한 apoptotic 응답 개별 miRNAs에 비해 더 강력 했다 조합 미르 치료 인 확인 되었다.
반 정량적 단백질 항 체 microarray 단백질 식 변경 관련된 특정 생물학 응답26,27를 식별 하는 과민 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 프로토콜은 ~ 60 유전자 치료 및 치료 세포 사이에서 식 변화를 감지 하는 세포 주기 통로 특정 항 체 microarray를 사용 합니다. 주의 세척 단계 과정 철저 하 게 수행 되도록 하 고 배경 신호를 최소화 하기 위해 필요 합니다. 또한, 슬라이드 해야 되지 건조 실험의 완료까지.
반면, RNA 시퀀싱 후 전사 수준에서 여러 유전자의 정량 유전자 표정 분석을 제공합니다. 분석 된 유전자의 상당히 많은 수 (> microarray에 대 한 60 대 RNA-seq에 대 한 18000) 동시 분석 높은 정확도 다중 경로 및 분자 표적에 대 한 수 있습니다. 이러한 광범위 한 분석은 하나의 miRNA 바인딩할 수 및 다른 mRNAs를 대상으로 중요 합니다. 반면, 유전자 dysregulations의 다 수의 경로 분석은 본질적으로 도전적 이다. 예를 들어 CDK1 및 CDK4/6 downregulation 미르 처리 때문에 관한 우리의 정량 데이터를 확인 하는 RNA 시퀀싱, 비록 분석 또한 제공 데이터 다운 했다 유전자의 수천에-위로 또는. 같은 수많은 유전자 dysregulations에 대 한 컨텍스트를 제공 하려면 경로 분석 소프트웨어 다른 통로 세포 기능에는 치료의 전반적인 효과 결정 하기 위해 사용 되었다. Indicatively, 소프트웨어 제공 (긍정적인 z 점수)를 활성화 또는 비활성화 (부정적인 z 점수) 분석 (그림 5)28의 통계적 의미 뿐 아니라 특정 기능 또는 경로, 점수 대표.
결론적으로, miRNA 활동의 연구는 어려운 절차 이다. 여러 유전자에 영향을 미칠 miRNAs의 고유의 용량 잠재적인 활동을 식별 하기 위해 여러 복잡 하 고 정교한 분석 방법의 활용을 필요 합니다. 아니나 다를까, 추가 작업은 완전히 143 미르와 미르-506 폐암에서의 활동을 이해 하는 데 필요한.
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Disclosures
저자는 RNA 시퀀싱 데이터 그리고 텍사스 대학 남서 의료 센터, 맥 더 못에 대 한 센터 다음 세대 시퀀싱 코어의 경로 분석에 대 한 그의 도움에 대 한 존 Caskey 루이지애나 주립 대학에서 인정 하 고 싶습니다. RNA 시퀀싱 데이터 분석을 수행. 이 연구는 약 학 대학, 대학교의 루이지애나 몬로 시작, 자금과 국립 보건원 (NIH) 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 통해 의해 지원 되었다.
Acknowledgments
관심 없음 충돌 선언 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
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암 연구 문제 145 transfection 미르 폐 암 세포 주기 apoptosis 신생 RNA 시퀀싱Erratum
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
