Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Abstract

Akciğer kanseri (LC) kanser bağlı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. Diğer kanser hücrelerinin, LC hücreleri temel karakteristik düzensiz yayılması ve hücre bölünmesi benzer. Hücre döngüsü ilerleme durdurma tarafından yayılması inhibisyonu LC dahil olmak üzere kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım gibi gösterilmiştir.

miRNA therapeutics önemli çoğu gen düzenleyiciler ortaya çıkan ve giderek kanser tedavisinde kullanılmak incelendiği. Son çalışmada, iki miRNAs, miR-143 ve miR-506, hücre döngüsü ilerleme düzenlemek için kullanılan. A549 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücreleri transfected, gen ifade değişikliklerini analiz edildi ve apoptotik etkinliği nedeniyle tedavi sonunda analiz edildi. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) downregülasyon algılandı (yani, CDK1, CDK4 ve CDK6), ve hücre döngüsü G1/S ve G2/M faz geçişleri durdurdu. Yolu analiz yaklaşım çok yönlü aktivitesiyle endows tedavinin potansiyel anjiogenik faaliyet göstermiştir. Burada açıklanan angiogenez inhibisyonu tarafından miRNA aktiviteyle ilgili hücre döngüsü inhibisyon, Apoptozis indüksiyon ve endotel hücreleri tedavisinin etkileri tanımlamak için kullanılan yöntemleri vardır. Burada sunulan yöntemleri gelecekteki araştırma miRNA therapeutics ve karşılık gelen etkinliğini destekleyecek ve temsilcisi veri deneysel analizleri sırasında diğer araştırmacılar rehberlik edecek umulmaktadır.

Introduction

Hücre döngüsü DNA ve Hücre proliferasyonu ile Mitotik süreci1tekrarını izin birden çok düzenleyici olayların bir kombinasyonudur. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) düzenleyen ve hücre döngüsü2teşvik. Bunlar arasında Mitotik CDK (CDK1) ve Interphase CDKs (CDK2, CDK4 ve CDK6) hücre döngüsü ilerleme3' te bir rol var. Retinoblastom protein (Rb) CDK4/hücre döngüsü ilerleme4izin vermek için CDK6 tarafından karmaşık fosforile ve CDK1 etkinleştirme başarılı hücre bölünmesi5için esastır. Çok sayıda CDK inhibitörleri geliştirilen ve CDKs kanser tedavisinde hedefleme potansiyeli gösteren son birkaç on yıl içinde klinik deneylere değerlendirildi. Aslında, üç CDK inhibitörleri meme kanseri tedavisi için onaylanmış olan son zamanlarda6,7,8,9,10. Böylece, CDKs, ve özellikle, CDK1 ve CDK4/6, kanser hücre ilerleme düzenlenmesinde büyük ilgi.

miRNAs (miRs) küçük, kodlamayan RNA'ların ve tüm insan genlerinin11yaklaşık % 30'u düzenleyen gen ifadesinin çoğu düzenleyiciler vardır. Faaliyetlerini translasyonel baskı ya da haberci RNA (mRNA)12bozulma dayanır. Onların biyolojik önemi açıklayıcı, 5.000'den fazla miRNAs tespit edilmiştir ve bir tek miRNA molekül birden çok gen11,13düzenleyen. Daha da önemlisi, miRNA ifade hastalık durumları, kanser13de dahil olmak üzere ve farklı hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Aslında, miRNAs kadar oncogenic ile karakterize veya tümör bastırıcılarının, teşvik veya tümör gelişme ve ilerleme14,15bastırmak için yetenekli olmak. MiRNAs hastalıklı dokuları içinde göreli ifade hastalık ilerleme düzenleyen; Böylece, miRNAs eksojen teslimini terapötik bir potansiyele sahiptir.

Akciğer kanseri olduğu önde gelen neden kanser ile ilgili ölümlerin ve daha büyük daha tüm akciğer maligniteler % 60'ı küçük hücre akciğer kanserleri16,17, 5 yıllık sağkalım oranı az % 20 ile18. MiR-143-3 p ve miR-506-3 p kullanımı son zamanlarda akciğer kanseri hücreleri11hücre döngülerle hedefleme için değerlendirilmiştir. miR-143 ve miR-506 tamamlayıcılık CDK1 ve CDK4/CDK6 dizileri ve A549 hücreleri bu iki miRs etkilerini analiz edildi. Deneysel detayları sundu ve bu yazıda ele. Gen ifadesinin, hücre döngüsü ilerleme ve Apoptozis farklı deneysel tasarım ve transfection takip timepoints kullanarak değerlendirildi. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemleri ile birlikte Mikroarray analiz belirli bir gen ifade ölçmek için kullanılan ve yeni nesil RNA sıralama küresel gen bozukluk11belirlemek için kullanılmıştır. Genler binlerce tek bir deneysel analizi analiz edilebilir iken ikinci yöntemi ile yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik, her genin transkript göreli bolluk tanımlar. Ayrıca, apoptotik analiz miRNA tedavi nedeniyle yapıldı ve burada anlatılan. Biyoinformatik yolu analiz desteklenmiştir. Burada sunulan iletişim kuralları analiz tedavi için Kombinatorik miR-143, potansiyel ve miR-506 kullanılır.

Ana amacı bu iletişim kuralı, miRNAs hücrelerde, hücre döngüsü odaklanarak etkilerini belirlemektir. Çeşitli teknikler burada yayılma alanından gen ifade analizi öncesi çeviri (ayrıntı için qPCR kullanarak) ve yeni sunulan teknikleri gen Analizi Mikroarray çözümlemesi gibi protein düzeyinde için. Bu rapor araştırmacılar miRNAs ile çalışmak için yararlıdır umulmaktadır. Ayrıca, metodoloji Apoptozis hücre ve hücre döngüsünün akış sitometrik analizi için sunulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. miR-143 ve miR-506 transfection

: Lateks eldiven, koruyucu gözlük ve bir laboratuvar kat açıklanan deneyler yaparken dikkatli olun. Gerektiğinde, Biyogüvenlik kabini, solunum yolları engelleme veya laminar hava akımı rahatsız olmadan kabine fan ile kullanın. Her zaman koruma cam pencere uygun yüksekliğe üretici tarafından açıklandığı gibi ayarlayın.

  1. Tohum NSCLC A549 hücreleri bir T25 cm2 şişe/6/96 iyi plaka DMEM/F12K medya % 10 FBS ve % 1 penisilin-streptomisin (kültür medya) doku kültürü Hood ile desteklenmiş ve gecede %5 CO2 bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. MiR-143 ve/veya miR-506 taklit eder askıya alma veya karıştırmak transfecting maddesi ile siRNA (miR 2.4 µg transfecting Ajan 14 µL ile karışık; Tablo reçetesibakın) transfection medya ve 1,5 mL serum ve antibiyotik ücretsiz 500 µL içinde DMEM/F12K medya, bir son miRNA konsantrasyon 100 nM. miRNA tutar optimizasyonu farklı hücreleri ve konsantrasyonları gerektirebilir. Uygun bir yaklaşım ile artan konsantrasyonları miRNA (yani, 50-200 nM) ve faiz genlerin ifade downregülasyon değerlendirilmesi hücrelerinin transfection içerir.
  3. Şişesi/plaka kültür ortamını çıkarın ve bir kez 1 x PBS ile yıkayın.
  4. MiRNA/scramble-transfecting Ajan kompleksleri ekleyin ve 37 ° c 6 h %5 CO2 ile kuluçkaya (ebatı eklenen kuluçka birimi tanımlar).
  5. 4 mL ile Kültür medya ortamı değiştirin ve hücreler 24 h ve/veya 48 h için kuluçkaya.
  6. Transfected hücreleri her T25 cm2 şişeye tripsin-EDTA 1 mL ekleyerek trypsinization, hasat, 5-10 dk 37 ° C'de için kuluçkaya ve kültür hücreleri hasat için medya 3 mL ekleyin. Her şişe içeriğini ayrı, işaretli 15 mL tüp içine yerleştirin. Doku kültürü mahallede çalışıyorum.
  7. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
    Not: ajitasyon tüp hücrelerinin kaybı neden olabilir dikkat olarak süpernatant kaldırma sırasında gereklidir.
  8. 2 mL 1 x PBS ve 5 min için santrifüj 751 x g. Ekle
  9. Adım 7 ve 8 bir kez medya ve süpernatant izlerini kaldırmak için yineleyin.
    Not: Bu aşamada örnek tüpler-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir.

2. RNA çıkarma

  1. Çalışma alanının % 70 izopropil alkol ve RNAse dekontaminasyon çözüm ile püskürtülerek temiz.
  2. RNA ayıklama uygun bir RNA kullanılarak gerçekleştirilmesi (bkz. Tablo reçetesi) kit.
  3. -80 ° C'den tüpler kaldırın ve çözülme izin. 300 µL lizis arabellek ve hücre zarının yukarı ve aşağı kırmaya pipet ekleyin.
  4. % 100 ultra-saf etanol eşit bir hacmi ekleyin.
  5. İyice karıştırın ve sütun ayıran yer.
  6. 11 ve 16 x g 30 s ve Kaldır akışı aracılığıyla arasındaki santrifüj kapasitesi.
  7. Tampon ve arabellek kaldırmak için santrifüj yıkama 400 µL ekleyin.
  8. Ben 75 µL DNA sindirim ile her örnek içinde tampon ve 15 min için kuluçkaya Dnaz 5 µL ekleyin.
  9. Örnek 400 µL RNA hazırlık arabelleği ile yıkayın.
  10. 2 x RNA yıkama arabellek ile yıkayın.
  11. Nükleaz ücretsiz su sütunu için santrifüj, sonra toplamak RNA ekleyin.
  12. Toplam RNA konsantrasyon UV Spektrofotometre ile ölçmek.

3. RT-qPCR

  1. RT-qPCR önce cDNA sentez. RNA konsantrasyon miktar sonraki tepki cDNA PCR tüp içinde hazırlamak için 20 µL son hacmi 1 µg RNA'ın yerleştirin. Her zaman temiz bir bankta çalışır.
  2. Diğer gerekli tüm malzemeler Tablo 1' e eklenmiştir.
Malzemeler Miktar (µL) / örnekleme (20 µL)
5 X cDNA Master mix 4
dNTPs 2
Rastgele hexamers 1
RT artırıcı 1
Verso enzim karışımı 1
Dnaz ve RNase ücretsiz su 20 µL yapmak için RNA ekledikten sonra gerekli miktar

Tablo 1: RNA örneklerinden cDNA sentezi için malzemeler. CDNA sentezi için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için ilgili maddeler miktarda gerekli.

  1. Aşağıdaki sıcaklık koşulları ile termal cycler kuluçkaya: 42 ° C 30 dakika; 2 min için 95 ° C; 4 ° C kadar örnekleri topluluğu.
  2. Hemen düzenli PCR veya qPCR kullanın veya cDNA-20 ° C'de depolayın
  3. Dnaz/RNase-Alerjik ile ileriye ve geriye doğru astar çözümleri su 10 µM hisse senedi astar çözümden bir konsantrasyon, hazır olun.
  4. Her gen, örnek sayısına göre tespit için ayrı ana karışımları hazırlayın. Her cDNA örnek (qPCR iyi) için tepki miktarı Tablo 2göre hazırlanır.
Malzemeler Miktar (µL) / örnekleme (20 µL)
SYBR master mix 10
Primer - 10 mikron ileri 2
Primer - 10 mikron ters 2
Dnaz ve RNase ücretsiz su 3
cDNA örnek 3

Tablo 2: malzemeler cDNA örneklerinden nicel gerçek zamanlı PCR. QPCR için bir örnek bir ana karışım hazırlamak için maddeler miktarı gerekli.

  1. Her örnek kendi wells yerleştirin.
  2. 96 iyi qPCR plaka için örnek düzeni tasarlayın. Her örnek ve analiz gen için reaksiyon triplicates ya da yapmak en azından içinde çoğaltır.
  3. Optik net yapışkanlı bir kapak ile 96 iyi plaka mühür.
  4. Hızlı-spin kalıbı her kuyunun ulaşmak tepki karışım izin verin.
  5. RT-qPCR göre aşağıdaki termal degrade çalıştırın:
    1) 2 min için 50 ° C
    2) 95 ° C için 2 dk
    3) 95 ° C 15 s
    4) okuma al
    5) 1,5 dk 60 ° C
    6) adım 3 için 39 kez tekrarlayın
  6. Aşağıdaki termal degrade yukarıda tek ürün amplifikasyon gösteren erime eğrisi belirlemek için devamı olarak çalıştırın.
    7) 0.31 min için 65 ° C
    8) +0.5 ° C/döngüsü
    9) plaka okuma
    10) 8 için 95 ° C ulaşan kadar 60 kez yineleyin
    11) 72 ° C için 2 dk

4. özel Jel Elektroforez tek gen amplifikasyon onaylamak için

  1. % 1'özel jel 1 x TBE tampon hazırlayın.
  2. Son konsantrasyonu yaklaşık 0,2-0,5 ulaşmak kadar sıcak (~ 50 ° C) jel etidyum bromür (EtBr) eklemek µg/mL. EtBR DNA ile bağlar ve UV jel Imager içinde ışığı altında görüntülenmeyecektir sağlar.
  3. Sıcak Jel Elektroforez jel kutusu ile sağlanan bir jel tepsi dökmek. Sıkı bir şekilde üniforma wells için sağlanan tarak iliştirin.
  4. Geri kalanı için jel ve oda sıcaklığında (RT) soğumaya ~ 30 min için izin verir.
  5. Ne zaman jel katılaşmış, jel ve tepsi jel kutuya koyun.
  6. Jel kutusu ile 1 x TBE tampon dolduramazsınız jel tamamen kaplıdır.
  7. DNA PCR güçlendirme işleminden bir UV Spektrometre kullanılarak konsantrasyonu ölçmek.
  8. ~ 15 al DNA ng küçük bir PCR tüp boya 5 µL ekleyip nükleaz ücretsiz su 15 µL toplam hacmi elde etmek için gerekli miktarda ekleyin.
  9. DNA merdiven ve örnekleri kuyu yükleyin.
  10. Yaklaşık % 75-%80 aşağı jel boya çizgidir kadar jel 100 V çalıştırın.
    Not: jel bir negatif pozitif giderlerini yayınladığından emin olun.
  11. Jel kaldırmak ve DNA görselleştirmek için jel Imager yerleştirin.

5. Hücre döngüsü analizi

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.
  4. 751 x g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. Resuspend ve pipetting tarafından buz gibi 1 x PBS 200 µL ekleyerek Pelet kesin.
  8. Hücreleri % 70 buz gibi etanol dropwise 2 mL tüp vortexing ederken yavaşça ekleyerek düzeltmek.
  9. Tüpler, RT 30 dk için kuluçkaya ve tüpler için 1 h 4 ° C'de yer.
  10. 4 ° C ve 5 min için vasıl 751 x g santrifüj tüpleri çıkarın.
  11. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  12. 1 x PBS propidium iyodür (50 µg/mL) ve ribonükleaz bir (200 µg/mL) ile 500 µL Ekle
  13. RT, 30 dk için örnekleri ışıktan koruyarak kuluçkaya.
  14. Akış Sitometresi verileri elde etmek. İleri en üstte ve üst tarafı dağılım (FSC FSC SSC yoğunluğu arsa ve hücre kümeleri sol alt köşesinde enkaz hariç hücrelerinin ana nüfus seçmek için SSC) vs kullanın-FSC SSC yoğunluğu arsa sağ tarafında.
  15. Hücre döngüsü aşamasını uygun yazılım ile başına hücre popülasyonlarının tanımlanması için verileri analiz.

6. Apoptosis tahlil

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her bir T25 cm2 şişeye örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL steril tüpler için transfer ve onları düzgün etiket.
  4. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. Artık medya kaldırmak için 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. 10 x 1 x ile buz gibi dH2O. Annexin V bağlayıcı arabelleğe sulandırmak
  8. 1 mL 1 x V Annexin bağlama arabellek her örnek tüp ekleyin ve hafifçe resuspend.
  9. 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yer 96 µL of hücre süspansiyon.
  10. Annexin V-FITC eşlenik 1 µL ve propidium iyodür (PI) 12.5 µL hücre süspansiyon içeren tüp ekleyin.
  11. Hücre süspansiyon buz karanlıkta 10 min için kuluçkaya.
  12. Annexin V bağlama arabellek x 250 µL buz gibi 1 sulandırmak için her örnek tüp ekleyin.
  13. Akış Sitometresi ile örnekleri hemen analiz edin.

7. protein ifade antikor hücre döngüsü Mikroarray tarafından

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.
  4. Vasıl 751 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Buz gibi 1 x PBS 2 mL ekleyin, girdap ve 5 dakika süreyle vasıl 751 x g santrifüj süpernatant atın.
  6. 1 x PBS ile çamaşır adımı yineleyin.
  7. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş lizis arabelleği 150 µL ekleyin. Damlalıklı yukarı ve aşağı yavaşça hücre zarlarında bozmaya.
  8. Herhangi bir lizis arabellek etkilenmemesi için üreticinin solvent alışverişi sütunları kullanarak etiketleme arabellek ile lizis tampon yerine bir arabellek değişimi gerçekleştirmek.
  9. Toplam protein BCA tahlil ile ölçmek.
  10. 70 µg protein örneği alıp 75 µL son hacmi elde etmek için etiketleme arabellek ekleyin.
  11. Dimethylformamide (DMF) 100 µL 1 mg biotin reaktif (biotin/DMF) ekleyin.
  12. Biotin/DMF 3 µL her protein örnek (biotinylated protein örnek) ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya
  13. Vortexing tarafından 35 µL dur reaktif ve karışımı ekleyin.
  14. RT, örnekleri 30 dk için kuluçkaya.
  15. Böylece onlar için 1S kullanmadan önce RT için sıcak Mikroarray slaytlar buzdolabından çıkarın.
  16. Non-spesifik bağlama için 45 dk RT. az için sürekli sallayarak ile bir petri içinde % 3 kuru süt çözümde (engelleme reaktif üreticisi tarafından sağlanan) ile slaytlar kuluçka tarafından engelleme gerçekleştirmek
  17. Slaytlar GKD2O su ile yıkamak (aksi belirtilmedikçe, çamaşır GKD2O ile yer alır).
  18. Çamaşır ~ 10 x tamamen engelleme çözüm slayt yüzeyler arasında kaldırmak için adımları yineleyin. Bu bir üniforma ve düşük arka plan elde etmek önemlidir.
  19. Slayt yüzeyler arasında aşırı su çıkarın ve kuru slayt izin olmadan sonraki adıma geçin.
  20. Kaplin çözüm kaplin reaktif % 3 kuru süt çözülerek hazırlayın.
  21. 6 mL kaplin çözüm ve önceden hazırlanmış biotinylated protein örnek tam miktarı 7.12 adımından ekleyin.
  22. Kaplin odasının bir iyi yer bir slayt satıcı tarafından sağlanan ve protein karışımı için kaplin ~ 6 mL ekleyin.
    Not: Slayt tamamen protein karışımı çözüm kaplin sular altında olun.
  23. Kaplin odası kapak ve RT 2 h ile bir orbital shaker sürekli ajitasyon için kuluçkaya.
  24. Slaytları bir Petri kabına aktarın ve arabellek yıkama x 1 30 mL ekleyin. Orbital Çalkalayıcı Petri kabına koyun, 10 dakikadır sallamak ve çözüm atın.
  25. Adımı yineleyin 7.24 2 x.
  26. 7,17 ve 7.18 adımlarda açıklandığı gibi kapsamlı slaytlar GKD2O su ile durulama ve hemen kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.
  27. Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) 30 µL algılama arabelleği 30 mL ekleyin.
  28. Slayt bir Petri kabına yerleştirin ve algılama arabelleği Cy3-streptavidin içeren 30 mL ekleyin.
  29. Orbital shaker sürekli ışıktan korunan sallayarak ile 20 dk için kuluçkaya.
    Not: Bir floresan boya Cy-3'tür. Alüminyum folyo ile kapatın veya floresan yoğunluğu korumak için karanlık koşullar altında çalışır.
  30. 7.24 7.26 adımlarını gerçekleştirin ve kuru hava yumuşak akışı kullanarak veya bir 50 mL konik tüp ve 5-10dk için 1300 x g , santrifüj slayt yerleştirmek slayt izin.
  31. Slaydı slayt tutucu ve alüminyum folyo ile kapatın yerleştirin.
  32. Uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında Mikroarray tarayıcıyla slayt tarama. Cy3 söz konusu olduğunda, uyarma dalga boyu zirve 570 ~ ~ 550 nm ve emisyon zirvesinde yer almaktadır nm.
  33. «««Analiz) ( Tablo malzemelerigörmek) veri için kullanılan yazılım.

8. RNA sıralama

  1. Tohum 5 x 105 hücreleri her T25 cm2 şişeler içinde örnek ve bir transfection adım 1-5 1, bölümünde açıklanan protokolüne göre gerçekleştirin.
  2. 24 saat ve 48 saat sonra hücreleri tarafından trypsinization hasat.
  3. Hücre süspansiyonlar 15 mL tüpler için transfer ve onları buna göre etiket.
  4. RNA Bölüm 2, 1-6 adımları göre ayıklayın.
  5. Konsantrasyon ile bir bioanalyzer yanı sıra RNA kalite kontrol edin. Bir RNA bütünlük (RIN) sekiz puan ve uygun çubuk grafikler RNA kalite onaylamak gerekli.
  6. Toplam RNA, RNA (Toplam RNA üzerinden mesajcı RNA) sıralama için ~ 2 µg örnek kullanın
  7. Yeni nesil Sekanslama11kullanılarak sırası.
  8. Kalite düzeltme çalıştırmak ve makine11sıralama RNA oluşturulan FASTQ dosyalarından başvuru genom ile eşleyin.
  9. FASTQ dosyaları ve ham okuma sayısı verileri talimatları takip Genebank için upload < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Web sitesi.
    Not: önceki sonuçları için katılım numarası SRP133420 bakın.

9. tüp oluşumu tahlil

  1. MiRNA transfected insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) 36 h sonrası transfection, anjiogenik potansiyelinin 1, adım 1-5, HUVEC hücre A549 hücreler yerine kullanarak kısmında açıklandığı gibi değerlendirmek.
  2. 37 ° C % 5 CO2ile 4 h için M199 açlık medya ile HUVECs açlıktan.
  3. Düşük büyüme faktörü membran matris kabarcık oluşumu ve polimerizasyon önlemek kademeli çözdürme izin-80 ° C ve mağaza bir gecede 4 ° C'de kaldırın.
  4. Yavaş yavaş ve dikkatli 96 iyi plaka wells kabarcık oluşumu kaçınarak düşük büyüme faktörü membran matrisinin 0,04 mL ile kat. Laminar akış başlık altında tüm yordamı gerçekleştirin.
  5. 96 iyi plaka bitişik wells nem korumak ve sıcaklığı korumak için PBS 0.1 mL ile doldurulması.
  6. Böylece polimerizasyon membran ekstresinin elde 96 iyi plaka için en az 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Daha 1 h için kuluçkaya değil.
  7. Her gruptan transfected HUVECs trypsinize ve orta M199, 1 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon içinde resuspend.
  8. Her hücre süspansiyon 0.1 mL polimerli membran matris 96 iyi plaka içeren wells ekleyin.
  9. Hazırlık büyüme faktörlerinin yer alır iken % 5 CO2 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya. Büyüme faktörleri hazırlanması da laminar akış başlık altında yer alır.
  10. Büyüme faktörü (VEGF) son istenen konsantrasyonu (2 ng/mL nihai toplama 4 ng/mL konsantrasyona) x 2 sulandırmak ve büyüme faktörü içeren M199 açlık orta üst kısmında M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL 0.1 mL ekleyin. VEGF tedavi kuyular için 0,1 mL M199 açlık orta M199 açlık orta hücreleri ile 0.1 mL üstüne ekleyin.
  11. 6 h %5 CO2ile 37 ° C'de 96 iyi plaka kuluçkaya.
  12. Kuluçka dönemi sonunda, her şey bir dijital kamera ile bağlı bir aydınlık alan mikroskop kullanarak 4 x büyütme ile görüntü elde.
  13. Yazılım bir "angiogenez analyzer" eklenti19ile donatılmış ile işlemi görüntüler. Üç parametre, düğüm sayısı, kavşaklar ve toplam Filiz uzunluğu, anjiogenez üzerinde miRNA tedavisinin etkileri karşılaştırmak için kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RT-qPCR ve Jel Elektroforez kullanarak gen ifade analizi

RT-qPCR kullanarak farklı gen ifade analizi önemli downregülasyon hedeflenen genlerin CDK1, CDK4 ve CDK6 gösterdi. CDK1 ve CDK4/6 sırasıyla G2/M ve G1/S geçişleri için etkili olduğu gösterilmiştir. Gerçekleştirilen analiz bireysel miRs ve Kombinatorik miR aktivite arasında doğrudan karşılaştırma izin. Scramble siRNA yordamdan gelen herhangi bir müdahale değerlendirilmesi üzerinde izin verilen transfecting maddesi ile kullanımı gen downregülasyon, hangi en az algıladı. Verilerin istatistiksel olarak iki kuyruklu Öğrenci tkullanarak analiz edildi-test, vep < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı (şekil 1) olarak kabul. QPCR önce astar-BLAST kullanarak astar dizileri değerlendirildi < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> tek gen amplifikasyon için. Bu da Jel Elektroforez ile amplifikasyon ürünleri analiz ederek doğrulandı. DNA ürünlerin tek bir bant tek gen amplifikasyon onaylayan her analiz için gen (şekil 1 d) tespit edilmiştir. Tek amplifikasyon oldu CDK6 (veri gösterilmez) doğruladı.

Figure 1
Resim 1 : QPCR ve Jel Elektroforez analiz DNA amplifikasyon ürünleri tarafından tespit gibi CDK1, CDK4 ve CDK6 gen göreli ifade. miR-143 ve miR-506 transfection A549 hücre CDK1 (A), CDK4 (B) ve CDK6 (C) downregülasyon 24 saat ve 48 saat sonrası transfection downregülasyon indüklenen. DNA amplifikasyon ürünleri Jel Elektroforez tek gen amplifikasyon onaylamak için (D) tarafından değerlendirildi. GAPDH referans gen kullanıldı. Ortalama ± SEM, * p < 0,05; ** p < 0,01, iki kuyruklu t-test. Bu rakam Hossian vd.11' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Akış Sitometresi kullanarak hücre döngüsü dağıtım

Propidium iyodür hücresel nükleik asitleri boyama hücre nüfusu hücre döngüsünün farklı aşamalarında DNA içeriği Nefelometri tarafından görselleştirmek için standart bir yöntemdir. MiR-143 ve miR-506 Kombinatorik tedavisi akış sitometrik analizi (Şekil 2) belirtildiği gibi iki denetim noktaları, G0/G1 ve G2/M, hücre döngüsü durdurdu.

Figure 2
Resim 2 : Hücre döngüsü analizi A549 hücre transfected miR-143 ve miR-506 24 saat ve 48 saat sonrası transfection. Hücre popülasyonları yüzdeleri her hücre döngüsü Akış Sitometresi ve DNA'ya bağlanıcı propidium iyodür tarafından belirlenmiştir. Ortalama ± SEM Bu rakam Hossian vd.11değişikliklerle yeniden basıldıBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Annexin V/PI apoptosis tahlil Akış Sitometresi tarafından

Transfection miR-143 ve miR-506 A549 hücrelerinin bir apoptoz tahlil Annexin V ve PI boyama ve Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirildi. Kombinatorik tedavi 24 saat ve 48 saat timepoints itibariyle önemli apoptosis indüklenen tespit edilmiştir. Negatif kontrollere göre yüzde değişim apoptotik hücre şekil 3' te sunulan miR tedavi nedeniyle Annexin V pozitif hücreleri tarafından tespit olarak tespit edilmiştir.

Figure 3
Şekil 3 : Apoptotik hücre açıklayıcı analiz. Transeksiyon miR-143 ve miR-506 Annexin V pozitif A549 hücrelerinin yüzde arttı. Ortalama ± SEM * p < 0,05, ** p < 0,01, iki kuyruklu t-test. Bu rakam Hossian vd.11' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre döngüsü antikor Mikroarray

Mekanik yanıt tedavi için protein ifadesindeki değişiklikleri ile tespit edilebilir. Fark ifade bir yol özgü antikor Mikroarray kullanarak hücre döngüsü yolu ile ilişkili genlerin bir protein düzeyinde değerlendirilmiştir. Proteini özleri analiz hücrelerden miR-143/506 ile transfected için kullanıldı. Her spesifik antikor için altı çoğaltır ile ~ 60 proteinler, hücre döngüsü ilişkili yarı kantitatif analiz için izin Mikroarray analizi. Yaklaşım mekanik davranış belirli bir yol, daha fazla değerlendirme için moleküler hedefleri tanımlaması ve analiz translasyon düzeyinde gerçekleştirme içinde daha geniş bir perspektif sağlar. Yöntem yarı kantitatif prensibi nedeniyle, belirli genler üzerinde herhangi bir sonuç Batı kurutma ile konfirme edilmesi gerekmektedir. İndicatively, bu analizde, proteinlerin hücre döngüsü ilerleme ile ilişkili azalmış bir ifade algılandı. Bu hedeflenen CDK1 ve CDK4 24 saat ve 48 saat sonrası transfection (şekil 4A) qPCR tarafından tespit de içeriyordu.

Figure 4
Şekil 4 : Mikroarray ve RNA sıralama analizi tarafından tespit gibi Gene bozukluk. (A) miR-143 ile transfected ve miR-506, 24 saat ve 48 saat sonrası transfection A549 hücrelerindeki protein Analizi Mikroarray tarafından tespit gibi hücre döngüsü yolu gen ifade Heatmap ayıklar. (B) kat Değiştir hücre döngüsü yolu gen ifade A549 hücrelerden miR-143 ve miR-506, RNA sıralama tarafından tespit gibi 24 saat sonrası transfection ile transfected. Yolu analiz yazılımı RNA sıralama elde edilen verilerden tarafından analiz gibi (C) yolu etkinliği. Bu rakam Hossian et al. modifiye 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

RNA analizi yolu analiz yazılımı kullanarak sıralama ve yol

Yeni nesil sıralama doğru gen ekspresyonu RNA düzeyde analiz eder. Yöntemi birden çok gen değişiklikleri tek bir analizi ile tanımlanması için sağlar (Bu protokol için analiz ifade tespit > 18.000 genler). Algılanan genler çok sayıda nedeniyle, Biyoinformatik analizi yolu davranış (şekil 4B) verimli belirlenmesi için kullanıldı. Yazılım daha sonra kullanılan (bakınız Tablo reçetesiG1/S ve G2/M faz tutuklamalar ve S downregülasyon faz başlatma (şekil 4 c) tahmin etmek için). Ayrıca, RNA sıralama sonuçları qPCR veri için karşılaştırılabilir. Bu çalışmada, RNA nasıl yapılacağını CDK1 downregülasyon gösteren qPCR analiz bulguları teyit (% 48 p < 0,001, FDR < 0.001), CDK4 (% 68'i, p < 0,001, FDR < 0.001) ve CDK6 (% 71, < 0,001, FDR < 0,001) nedeniyle Kombinatorik miR-143 ve miR-506 aktivite. İstatistiksel analiz kullanarak Negatif binom20,21 p değerlerinin hesaplanması göreli gen ekspresyonu hesaplanmasında kullanılan EdgeR yazılım tarafından gerçekleştirildi. Şekil 5' te gösterildiği gibi işlevsel değerlendirme miRNA faaliyet ve potansiyel moleküler hedeflerin, tahmin için Biyoinformatik analizi gerçekleştirilebilir.

Figure 5
Şekil 5 : Açıklayıcı yolu ve mekanik analiz yolu analiz aoftware tarafından sunulan olarak. RNA sıralama veri yolu analiz yazılımı ve tanımlanan kurallı yollar ile en düşük (A) veya en yüksek (B) etkinleştirme puanı kullanarak miR-143 ve miR-506, 24 saat sonrası transfection ile transfected A549 hücrelerden analiz edildi. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı da tahmin işlevleri (C) ve potansiyel ters yönde düzenleyiciler/hedef (D) sağladı. Bu rakam Hossian. ark düşük yayımlanmaktadır 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Endotelyal tüp oluşumu tahlil

Tüp Bebek endotelyal tüp oluşumu tahlil angiogenez incelemek için yaygın olarak kullanılır ve güvenilir, otomatik ve ölçülebilir22yaşında. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) bir iyi bilinen anjiogenik büyüme faktörü23,24 ve endotelyal tüp oluşumu organizatörü olduğunu. Bu çalışmada, miR-143 ve miR-506 Kombinatorik tedavisi VEGF kaynaklı angiogenez abrogates tespit edilmiştir. Tüp oluşumu gösterge niteliğindeki görüntü ve tedavinin etkilerini şekil 6' da sunulmuştur.

Figure 6
Şekil 6 : Endotel lahanası VEGF tedavi tedavi HUVECs vs temsilcisi görüntülerini transfected kapış miRNA, miRNA-143, miRNA-506 veya bunların bir kombinasyonu ile. Resimler bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış aydınlık alan mikroskop altında küçük 4 x büyütme elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNAs kanser tedavisi, ifade seviyelerinde bozukluk tanıma için hedeflenmiş tedaviler olarak çalışabilir hastalıklı normal dokuların vs. Bu çalışmada potansiyel olarak birden çok aşamaları sırasında hücre döngüsü ilerleme durdurmak miRNAs belirlemek amaçlanmıştır. MiR-143 ve miR-506 hücre döngüsü bu Kombinatorik miRNA tedavinin etkinliğini anlamayı amaçlayan sunulan iletişim kuralları ve kanser hücrelerinin durdurmak tespit edilmiştir.

Açıklanan yöntemleri miRNAs fonksiyonu üzerinde kapsamlı bir anlayış sağlamak. MiRNAs eğitim sorunları birden çok gen hedef ve böylece birden çok yolları etkiler için onların kapasite ile ilişkilidir. Tedavi öncesinde belirli çok önemlidir Eğer açıklanan qPCR analiz kimlik ilgi belirli genlerin ifade sağlar. Örneğin, ana odak burada CDK1 ve CDK4/6 ve hücre döngüsünün ifadesi oldu.

Böylece, propidium iyodür ve Akış Sitometresi protokolünü kullanarak hücre döngüsü analizi hücre popülasyonlarının onların sahne hücre döngüsünün göre değişiklikleri algılamak için güvenilir bir yaklaşımdır. DNA, hücre döngüsü aşamasına karşılık gelen bağlar PI Floresans sinyalinin orantılı artış yöntemi kullanır. Kısaca, S faz hücrelerde DNA G0/G1 evresi hücrelerde ve G2 faz hücrelerde DNA'ları, en yoğun sinyal üreten çoğaltılamaz daha yüksek sinyalleri inducing, sentez.

Kanıt biriken hasar hücre döngüsü için bağlantı ve Apoptozis25/ tetikleyen gösterir. Annexin VI/PI kullanarak Akış Sitometresi yöntemi sürekli kemoterapi tedavisi arasındaki indüklenen apoptosis tanımlanması için kullanılmıştır. İndicatively, güçlü apoptotik yanıt bireysel miRNAs kıyasla daha güçlü Kombinatorik miRNA tedavisi nedeniyle tespit edilmiştir.

Yarı kantitatif protein antikoru Mikroarray protein ifade değişiklikler ilgili belirli biyolojik yanıt-e doğru26,27tanımlamak için hassas ve güvenilir bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı ifade değişiklikleri tedavi ve tedavi edilmezse hücreleri arasında ~ 60 gen tespit bir hücre döngüsü yol özgü antikor Mikroarray kullanılır. Dikkat çamaşır adımları sırasında süreci iyice sahne aldı emin olmak için ve arka plan sinyal en aza indirmek için gereklidir. Ayrıca, slaytları denemenin tamamlanması kadar kuru olmak gerekir değil.

Buna ek olarak, RNA sıralama kantitatif gen ifadeleri sonrası transkripsiyon düzeyinde birden çok gen analizini sunuyor. Analiz genler önemli ölçüde çok sayıda (> 60 Mikroarray için vs RNA-seq için 18.000) birden fazla yolları ve moleküler hedeflerin ve yüksek doğruluk ile eş zamanlı analiz için izin verir. Böyle geniş analizi tek miRNA bağlanmak ve farklı mRNA'ların hedef olarak önemli değildir. Buna ek olarak, çok sayıda gen dysregulations yolu analizini doğal olarak meydan okuyor. Bizim qPCR veri ile ilgili CDK1 ve CDK4/6 downregülasyon miRNA tedavi nedeniyle RNA nasıl yapılacağını doğruladı, örneğin, analiz Ayrıca veri de inmişti genler binlerce verilse- veya yukarı düzenlenir. Böyle çok sayıda gen dysregulations bağlam sağlamak için yol analiz yazılımı farklı yol ve hücresel işlevler tedavisinin genel etkileri belirlemek için kullanıldı. İndicatively, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı harekete geçirmek (pozitif z puanı) ya da inactivation (olumsuz z skor) belirli işlevleri veya yolları yanı sıra analiz (şekil 5)28istatistiksel anlamlılık için puanları temsilcisi sağladı.

Sonuç olarak, miRNA etkinlik çalışması zor bir işlemdir. Birden çok genleri etkiler miRNAs doğal kapasitesini potansiyel etkinliği tanımlamak için birden çok ayrıntılı ve karmaşık analitik yöntemler gerektirir. Doğal olarak, daha fazla çalışma miR-143 ve miR-506 akciğer Kanserinde faaliyetlerinin tam olarak anlamak için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar Louisiana State Üniversitesi'nde John Caskey yolu analizi RNA sıralama veri ve University of Texas Southwestern Tıp Merkezi, McDermott Merkezi sonraki nesil sıralama çekirdek için onun yardımını kabul etmek istiyorum RNA sıralama ve veri çözümlemesi gerçekleştirme. Bu araştırma üniversite eczacılık, Louisiana Üniversitesi Monroe başlangıç finansman ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) aracılığıyla Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi bilim hibe 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 tarafından desteklenmiştir.

Acknowledgments

Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

Kanser araştırmaları sayı: 145 transfection miRNA akciğer kanseri hücre döngüsü Apoptozis anjiogenez RNA sıralama

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter