Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse av kombinasjon miRNA behandlinger for å regulere cellen syklus og angiogenese

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA therapeutics har betydelig potensial i å regulere kreft progresjon. Demonstrert her brukes analytiske metoder for identifikasjon av aktiviteten til en kombinasjon miRNA behandling stanse cellen syklus og angiogenese.

Abstract

Lungekreft (Langbane) er den ledende årsaken til kreft-relaterte dødsfall over hele verden. Lik andre kreftceller, grunnleggende karakteristisk for LC celler er uregulert spredning og celledeling. Hemming av spredning ved å stoppe celle syklus progresjon har vist seg å være en lovende tilnærming til kreftbehandling, inkludert LC.

miRNA therapeutics har dukket opp som viktige post-transcriptional gene regulatorer og stadig blir undersøkt for bruk i kreftbehandling. I siste arbeid benyttet vi to miRNAs, miR-143 og miR-506, å regulere celle syklus progresjon. A549 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellene var transfekterte gene expression endringer ble analysert og apoptotisk aktivitet på grunn av behandlingen var endelig analysert. Downregulation av cyclin-avhengige kinaser (CDKs) ble oppdaget (dvs. CDK1, CDK4 og CDK6), og celle syklus stoppet på G1/S og G2/M fase overgangene. Sti analyse indikerte potensielle antiangiogenic aktivitet av behandlingen, som endows tilnærming med mangefasettert aktivitet. Her beskrives er metodikkene som brukes til å identifisere miRNA aktivitet om cellen syklus hemming, induksjon av apoptose, og effekten av behandling på endotelceller ved hemming av angiogenese. Håpet er at metodene presenteres her vil støtte fremtidig forskning på miRNA legemiddelselskap og tilsvarende aktivitet og at datatypen representant vil lede andre forskere under eksperimentelle analyser.

Introduction

Cellen syklusen er en kombinasjon av flere regulatoriske hendelser som tillater duplisering av DNA og celle spredning gjennom mitotisk prosessen1. Cyclin-avhengige kinaser (CDKs) regulere og fremme cellen syklus2. Blant dem har mitotisk CDK (CDK1) og interphase CDKs (CDK2, CDK4 og CDK6) en avgjørende rolle i cellen syklus progresjon3. Retinoblastoma protein (Rb) er fosforylert av den CDK4/CDK6 kompleks at cellen syklus progresjon4, og CDK1 aktivisering er avgjørende for vellykket celledeling5. Mange CDK-hemmere er utviklet og evaluert i kliniske studier de siste tiårene, indikerer potensialet for målretting CDKs i kreftbehandling. Faktisk tre CDK-hemmere er godkjent for behandling av brystkreft nylig6,7,8,9,10. Dermed CDKs, og spesielt CDK1 og CDK4/6, er av stor interesse i å regulere kreft cellen progresjon.

miRNAs (miRs) er små, ikke-koding RNAs og post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, regulere ca 30% av alle menneskelige gener11. Deres virksomhet er basert på translasjonsforskning undertrykkelse eller degradering av messenger RNAs (mRNAs)12. Illustrerende for deres biologisk betydning, mer enn 5000 miRNAs har blitt identifisert og et enkelt miRNA molekyl kan regulere flere gener11,13. Enda viktigere, er miRNA uttrykk tilknyttet ulike sykdommer og sykdom statuser, inkludert kreft13. Faktisk, miRNAs har vært preget som kreftfremkallende eller svulst suppressors, å være i stand til å fremme eller undertrykke tumor utvikling og progresjon14,15. Relativ uttrykk for miRNAs i sykt vev kan regulere sykdomsprogresjon; Dermed har eksogene levering av miRNAs terapeutiske potensial.

Lungekreft er den ledende årsaken til kreft dødsfall og større enn 60% av alle lunge malignancies er ikke liten celle lunge kreft16,17, med en 5-års overlevelse på mindre enn 20%18. Bruk av miR-143-3 p og miR-506-3 p ble nylig evaluert for målretting cellen sykluser hos lunge kreft celler11. miR-143 og miR-506 har sekvenser som komplementaritet CDK1 og CDK4/CDK6, og effekten av disse to miRs på A549 celler ble analysert. Eksperimentell detaljene er presentert og diskutert i denne artikkelen. Genuttrykk og celle syklus progresjon apoptose ble vurdert ved hjelp av forskjellige eksperimentell design og timepoints etter hva. Vi brukte sanntid kvantitative PCR (RT-qPCR) metoder med microarray analyse måle bestemt genekspresjon, og neste generasjons RNA sekvensering ble brukt til å bestemme globale genet feilregulering11. Sistnevnte identifiserer den relative overfloden av hver genet utskrift med høy følsomhet og reproduserbarhet, mens tusenvis av gener kan analyseres fra en enkelt eksperimentanalyse. I tillegg apoptotisk analyse på grunn av miRNA behandling ble utført og er beskrevet her. Bioinformatikk supplert sti analyse. Presenteres her brukes protokoller til analyse av den terapeutiske potensialet i kombinasjon miR-143 og miR-506.

Hovedformålet med denne protokollen er å identifisere effekten av miRNAs i celler, med fokus på cellen syklus. Ulike teknikker presenteres her spenn fra gene expression analyse før oversettelse (med qPCR) utdype og romanen teknikker for genet analyse på protein nivå, som microarray analyse. Håpet er at denne rapporten er nyttig for forskere interessert i å jobbe med miRNAs. I tillegg vises metodikk for flyt cytometric analyse av cellen syklus og apoptose celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. miR-143 og miR-506 transfection

Advarsel: Bruk latex hansker, beskyttende briller og en laboratoriet frakk mens du utfører beskrevet eksperimenter. Ved behov, bruk biosikkerhet kabinettet med kabinett viften på, uten blokkerer luftveiene eller forstyrre laminær luftstrøm. Alltid sette beskytte glasset vinduet til ønsket høyde, som beskrevet av produsenten.

  1. Frø NSCLC A549 celler i en T25 cm2 kolbe/6/96 godt plate i DMEM/F12K media supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (kultur media) i vev kultur hette og ruge over natten på 37 ° C med 5% CO2 i en vev kultur inkubator.
  2. Suspendere miR-143 og/eller miR-506 imiterer eller rykke ut siRNA med transfecting agent (2,4 µg av miR ble blandet med 14 µL transfecting agent, se Tabellen for materiale) i 500 µL av hva media og 1,5 mL av serum og antibiotika-fri DMEM/F12K media på en siste miRNA konsentrasjon av 100 nM. miRNA beløpet kan kreve optimalisering på forskjellige celler og konsentrasjoner. Aktuelle tilnærmingsmåtene er hva celler med økende konsentrasjoner av miRNA (dvs. 50-200 nM) og evaluering av uttrykk downregulation av genene rundt.
  3. Fjerne kultur medier fra kolbe/plate og vask en gang med 1 x PBS.
  4. Legg miRNA/scramble-transfecting agent komplekser og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 6 h (kolbe størrelse definerer lagt inkubasjon volumet).
  5. Erstatt media med 4 mL kultur medier og ruge celler for 24t og/eller 48 timer.
  6. Høste transfekterte celler av trypsinization, ved å legge 1 mL av trypsin-EDTA i hver T25 cm2 kolbe ruge i 5-10 min på 37 ° C og legge 3 mL kultur medier å høste celler. Plass innholdet i hver kolbe i en egen, merket 15 mL tube. Arbeid i vev kultur hette.
  7. Sentrifuge 751 x g i 5 min og fjerne nedbryting.
    Merk: Forsiktig kreves under supernatant fjerning, omrøring av røret kan forårsake tap av celler.
  8. Legge 2 mL 1 x PBS og sentrifuge for 5 min på 751 x g.
  9. Gjenta trinn 7 og 8 én gang for å fjerne alle spor av media og nedbryting.
    Merk: På dette stadiet, prøve rør kan lagres på-80 ° C eller kan brukes umiddelbart.

2. RNA utvinning

  1. Rengjøring av arbeidsområdet ved å sprøyte med 70% isopropylalkohol og RNAse dekontaminering løsning.
  2. RNA utvinning skal utføres ved hjelp av en passende RNA kit (se Tabell for materiale).
  3. Ta ut rør fra-80 ° C og tillate dem å tine. Legge til 300 µL lyseringsbuffer og pipette opp og ned for å bryte cellemembranen.
  4. Legge til en lik volum på 100% ultra ren etanol.
  5. Bland godt og plasser i skille kolonnen.
  6. Sentrifuge mellom 11 og 16 x g for 30 s og fjern gjennomflytsenhet.
  7. Legge til 400 µL vaske bufferen og sentrifuger fjerne bufferen.
  8. Legge til 5 µL av DNAse med 75 µL av DNA fordøyelsen bufre i hvert utvalg og ruge i 15 min.
  9. Vask prøven med 400 µL av RNA prep buffer.
  10. Vask 2 x med RNA vaskebuffer.
  11. Legge til nuclease-fritt vann kolonnen sentrifuge, deretter samle RNA.
  12. Måler totalt RNA konsentrasjon med et UV spektrofotometer.

3. RT-qPCR

  1. Før RT-qPCR, syntetisere cDNA. Etter RNA konsentrasjon kvantifisering, sett 1 µg av RNA i en 20 µL siste bind i reaksjon å forberede cDNA i et PCR-rør. Alltid arbeide på en ren benk.
  2. Alle andre nødvendige ingrediensene er inkludert i tabell 1.
Ingredienser Antall (µL) / prøve (20 µL)
5 X cDNA Master mix 4
dNTPs 2
Tilfeldige hexamers 1
RT enhancer 1
Verso enzym blanding 1
DNase og RNase gratis vann Nødvendig antall etter RNA slik at 20 µL

Tabell 1: Materialer for cDNA syntese fra RNA prøver. Nødvendig antall respektive ingredienser å forberede en master blanding ett utvalg for cDNA syntese.

  1. Inkuber i en termisk cycler med følgende temperatur: 42 ° C i 30 min; 95 ° C i 2 min; 4 ° C til samling av eksempler.
  2. Bruk umiddelbart i vanlig PCR eller qPCR, eller lagre cDNA på 20 ° C.
  3. Forberede forover og bakover grunning løsninger med DNase/RNase-gratis vann i en konsentrasjon av 10 µM fra lager primer løsning.
  4. Forbered separat master mikser for hver genet kan oppdages, etter antall eksempler. For hver cDNA prøve (qPCR godt), er hvor reaksjon utarbeidet etter tabell 2.
Ingredienser Antall (µL) / prøve (20 µL)
SYBR master mix 10
Videresende Primer - 10 μM 2
Omvendt Primer - 10 μM 2
DNase og RNase gratis vann 3
cDNA utvalg 3

Tabell 2: materialer for kvantitative sanntid PCR fra cDNA prøver. Nødvendig antall ingredienser å forberede en master blanding ett utvalg for qPCR.

  1. Plass hvert utvalg i de respektive brønnene.
  2. Utforme eksempel 96 godt qPCR platen. For hver prøve og analysert genet, utføre reaksjonen triplicates eller på minst i duplikater.
  3. Forsegle 96 godt platen med en optisk klart selvklebende deksel.
  4. Rask-spin platen tillate reaksjonsblandingen å nå bunnen av hver brønn.
  5. Kjøres RT-qPCR i følgende termisk gradient:
    1) 50 ° C i 2 minutter
    2) 95 ° C i 2 minutter
    3) 95 ° C i 15 s
    4) ta lesing
    5) 60 ° C i 1,5 min
    6) Gjenta trinn 3 for 39 ganger
  6. Kjør følgende termisk forløpningen i fortsettelsen av ovennevnte å bestemme smeltende kurve som angir enkelt produkt forsterkning.
    7) 65 ° C i 0.31 min
    8) +0.5 ° C/syklus
    9) plate lese
    10) Gjenta trinn 8 for 60 ganger fram 95 ° C
    11) 72 ° C i 2 minutter

4. Agarose gel geleelektroforese å bekrefte enkelt gene forsterkning

  1. Forberede 1% agarose gel 1 x TBE buffer.
  2. Legge til ethidium bromide (EtBr) i varm (~ 50 ° C) gel til å oppnå en siste konsentrasjon av lag 0,2 0,5 µg/mL. EtBR binder med DNA og kan visualiseres under UV-lys i en gel imager.
  3. Hell varm gel i en gel skuff leveres med en geleelektroforese gel for. Koble den medfølgende kam tett for uniform brønner.
  4. Tillat gel resten og avkjøles til romtemperatur (RT) for ~ 30 min.
  5. Når gel er styrket, plasser gel og brett i boksen gel.
  6. Fyll boksen gel med 1 x TBE buffer til gel er helt dekket.
  7. Måle konsentrasjonen av DNA fra PCR forsterkning prosessen ved hjelp av en UV spectrometer.
  8. Ta ~ 15 ng DNA i en liten PCR-tube, legge 5 µL fargestoff, og legge til den nødvendige mengden av nuclease-fritt vann å oppnå et 15 µL totalvolum.
  9. Legg DNA stigen og eksempler i brønnene.
  10. Løpe gel på 100 V til fargestoff linjen er ca 75% - 80% ned gel.
    Merk: Kontroller at gel går fra en negativ til positiv kostnad.
  11. Fjern gel og plasserer den i gel imager visualisere DNA.

5. celle syklus analyse

  1. Frø 5 x 105 celler for hver smak i en T25 cm2 bolle og utføre en transfection i henhold til protokollen som beskrevet i del 1, trinn 1-5.
  2. Etter 24 timer og 48 timer, deretter høste celler av trypsinization.
  3. Overføre celle suspensjoner til 15 mL steril rør og etikettere dem riktig.
  4. Sentrifuge prøver 751 x g i 5 min og kast nedbryting.
  5. Legg 2 mL iskald 1 x PBS, vortex og sentrifuge 751 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
  6. Gjenta trinnet vask med 1 x PBS fjerne gjenværende media.
  7. Resuspend og bryte pellet ved å legge til 200 µL av iskalde 1 x PBS av pipettering.
  8. Fastsette cellene ved å legge 2 mL 70% iskald etanol dropwise til røret mens vortexing forsiktig.
  9. Inkuber rør for 30 min på RT og plassere rør i 4 ° C i 1 time.
  10. Fjerne rør fra 4 ° C og sentrifuge 751 x g for 5 min.
  11. Legg 2 mL iskald 1 x PBS, vortex og sentrifuge 751 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
  12. Legge til 500 µL av 1 x PBS med propidium iodide (50 µg/mL) og ribonuclease en (200 µg/mL)
  13. Inkuber i 30 min på RT samtidig beskytte prøvene fra lys.
  14. Hente data flyt cytometer. Bruk frem vs siden xy (FSC vs SSC) velge viktigste befolkningen av celler, unntatt rusk nederst i venstre hjørne FSC vs SSC tetthet plot og celle sektorgruppene øverst til toppen-høyre FSC vs SSC tetthet tomten.
  15. Analysere data for identifikasjon av celle populasjoner per celle syklus scenen med passende programvare.

6. apoptose analysen

  1. Frø 5 x 105 celler for hver smak i en T25 cm2 bolle og utføre en transfection i henhold til protokollen som beskrevet i del 1, trinn 1-5.
  2. Etter 24 timer og 48 h, høste celler av trypsinization.
  3. Overføre celle suspensjoner til 15 mL steril rør og etikettere dem riktig.
  4. Sentrifuge 751 x g i 5 min og kast nedbryting.
  5. Legg 2 mL iskald 1 x PBS, vortex og sentrifuge 751 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
  6. Gjenta trinnet vask med 1 x PBS fjerne gjenværende media.
  7. Fortynne 10 x Annexin V bindende buffer til 1 x med iskald dH2O.
  8. Legg 1 mL 1 x Annexin V bindende buffer til hver eksempel rør og resuspend forsiktig.
  9. Sted 96 µL av cellen suspensjon i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  10. Legg 1 µL av Annexin V-FITC konjugert og 12,5 µL av propidium iodide (PI) til røret som inneholder cellen suspensjon.
  11. Inkuber celle suspensjon i 10 min på isen i mørket.
  12. Legge til 250 µL iskald 1 x Annexin V bindende buffer hver eksempel rør å fortynne.
  13. Analysere prøver med flyt cytometer umiddelbart.

7. protein uttrykk av antistoff celle syklus microarray

  1. Frø 5 x 105 celler for hver smak i T25 cm2 flasker og utføre en transfection i henhold til protokollen som beskrevet i del 1, trinn 1-5.
  2. Etter 24 timer og 48 h, høste celler av trypsinization.
  3. Overføre celle suspensjoner til 15 mL rør og etikettere dem tilsvarende.
  4. Sentrifuge 751 x g i 5 min og kast nedbryting.
  5. Legg 2 mL iskald 1 x PBS, vortex og sentrifuge 751 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
  6. Gjenta trinnet vask med 1 x PBS.
  7. Legge til 150 µL av lyseringsbuffer supplert med proteasehemmere. Pipetter opp og ned forsiktig å forstyrre cellemembraner.
  8. For å hindre lysis buffer forstyrrelser, utføre en buffer utveksling for å erstatte lyseringsbuffer med merking buffer, bruker produsentens løsemiddel utveksle kolonner.
  9. Kvantifisere totale protein med en BCA analysen.
  10. Ta 70 µg av protein prøve og legge merking buffer for å oppnå et endelig antall 75 µL.
  11. Legge til 100 µL av vannistedenfor (DMF) i 1 mg av biotin reagensen (biotin/DMF).
  12. Legg til 3 µL av biotin/DMF hver protein prøven (biotinylated protein prøve) og ruge 2 h på RT.
  13. Legge til 35 µL av stopp reagens og bland ved vortexing.
  14. Inkuber eksempler på RT for 30 min.
  15. Fjern microarray lysbildene fra kjøleskapet slik at de varme til RT 1t før bruk.
  16. Utføre blokkering for ikke-spesifikk tilknytning av rugende lysbildene med 3% tørr melk løsning (i blokkering reagens fra produsenten av) i en Petriskål med kontinuerlig rister for 45 min på RT.
  17. Vask lysbildene med ddH2O vann (med mindre annet vask foregår med ddH2O).
  18. Gjenta vask trinnet ~ 10 x å fjerne blokkering løsningen fra lysbildet overflater. Dette er viktig å oppnå en enhetlig og lav bakgrunn.
  19. Fjern overdreven vann fra lysbildet overflater og fortsette til neste trinn uten å la lysbildene tørr.
  20. Forberede kopling løsning ved å løse opp 3% tørr melk i en kopling reagens.
  21. Legge til 6 mL av kobling løsningen og hele antallet tidligere forberedt biotinylated protein prøven fra trinn 7.12.
  22. Sted ett lysbilde i en brønn av kopling chamber levert av leverandøren og Legg ~ 6 mL protein kopling blanding til den.
    Merk: Kontroller at lysbildet er helt dekket i protein kopling blanding løsning.
  23. Dekker kopling kammeret og ruge 2 h på RT med kontinuerlig uro i en orbital shaker.
  24. Overføre lysbilder til en Petriskål og legge til 30 mL 1 x vaske bufferen. Plasser Petriskål i orbital shaker, riste i 10 min, og forkaste løsningen.
  25. Gjenta trinn 7.24 2 x.
  26. Skyll lysbildene med ddH2O vann mye som beskrevet i trinn 7.17 og 7.18 og Fortsett til neste steg å unngå tørking.
  27. Legge til 30 µL av Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) i 30 mL oppdagelsen bufferen.
  28. Plasser lysbildet i en Petriskål og legge til 30 mL oppdagelsen bufferen som inneholder Cy3-streptavidin.
  29. Inkuber i en orbital shaker i 20 minutter med kontinuerlig skjelvende beskyttet mot lyset.
    Merk: Cy-3 er en fluorescerende farge. Dekk med aluminiumsfolie eller opererer under mørke forhold å opprettholde fluorescens intensitet.
  30. Fremgangsmåten 7.24-7.26 og la lysbildet tørke med en svak strøm av luft eller plassere lysbildet i en 50 mL konisk rør og sentrifuger 1300 x g i 5-10 min.
  31. Sett lysbildet i lysbildeholderen og dekk med aluminiumsfolie.
  32. Skanne lysbildet i en microarray skanner med passende eksitasjon og utslipp bølgelengdene. Når det gjelder Cy3, eksitasjon bølgelengde toppen er ~ 550 nm og utslipp peak på ~ 570 nm.
  33. Analysere dataene (se Tabell for materiale) programvaren brukes).

8. RNA sekvensering

  1. Frø 5 x 105 celler for hver smak i T25 cm2 flasker og utføre en transfection i henhold til protokollen som beskrevet i del 1, trinn 1-5.
  2. Etter 24 timer og 48 h, høste celler av trypsinization.
  3. Overføre celle suspensjoner til 15 mL rør og etikettere dem tilsvarende.
  4. Ekstra RNA i sprøyte 2, trinn 1 til 6.
  5. Sjekk RNA kvalitet samt konsentrasjon med en bioanalyzer. RNA integritet score (RIN) over åtte og passende histogrammer er nødvendig for å bekrefte RNA kvalitet.
  6. Fra den totale RNA, bruke ~ 2 µg av utvalget for RNA sekvensering (budbringer RNA fra total RNA)
  7. Rekkefølge ved hjelp av en neste generasjons sequencer11.
  8. Kjør kvalitet trimming og kart med en referanse genomet fra FASTQ filer generert fra RNA sekvensering maskin11.
  9. Laste opp FASTQ filer og lese rådata telle data til Genebank, følge instruksjonene på den < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> nettsted.
    Merk: Se tiltredelse nummer SRP133420 for tidligere resultater.

9. rør formasjon analysen

  1. Vurdere angiogenic potensialet i miRNA-transfekterte menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) 36 h etter transfection, som beskrevet i del 1, trinn 1-5, med HUVEC celler i stedet for A549 celler.
  2. Sulte HUVECs med M199 sult media 4 h på 37 ° C med 5% CO2.
  3. Fjerne redusert vekst faktor kjelleren membran matrise av-80 ° C og butikk på 4 ° C over natten, slik at gradvis tining å unngå boble dannes og polymerisasjon.
  4. Sakte og forsiktig strøk brønner av en 96 godt plate med 0.04 mL redusert vekstfaktor kjelleren membran matrise, unngå boble formasjon. Utføre hele prosedyren under laminær strømning hette.
  5. Fylle tilstøtende brønner av 96 godt plate med 0,1 mL PBS å opprettholde fuktighet og bevare temperatur.
  6. Inkuber 96 godt platen ved 37 ° C i minst 20 min slik at av kjelleren membran ekstrakt er oppnådd. Ikke ruge over 1t.
  7. Trypsinize transfekterte HUVECs fra hver gruppe og resuspend i middels M199 i en konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL.
  8. Legge til 0,1 mL av hver celle suspensjon brønnene som inneholder polymerized kjelleren membran matrise i 96 godt plate.
  9. Inkuber 96 godt platen på 37 ° C med 5% CO2 mens forberedelser av vekstfaktorer foregår. Forberedelser av vekstfaktorer også foregår under panseret laminær strømning.
  10. Rekonstituer vekstfaktorer (VEGF) i 2 x den endelige ønskede konsentrasjonen (4 ng/mL konsentrasjonen for 2 ng/mL siste konsentrasjon) og legge til 0,1 mL av vekstfaktor inneholder M199 sult medium på 0,1 mL av M199 sult medium med celler. Ikke-VEGF-behandlet brønner, legger du til 0,1 mL M199 sult medium på 0,1 mL av M199 sult medium med celler.
  11. Inkuber 96 godt platen i 6 h 37 ° C med 5% CO2.
  12. På slutten av inkubasjonstiden, kan du få bilder av hver brønn med 4 x forstørrelse, bruker brightfield mikroskop med et digitalkamera.
  13. Process bilder med programvare utstyrt med en "angiogenese analyzer" plug-in19. Bruk tre parametere, antall noder, veikryss og totale spire lengde, for å sammenligne effekten av miRNA behandling på angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gene expression analyse ved hjelp av RT-qPCR og gel geleelektroforese

Differensial gene expression analyse ved hjelp av RT-qPCR vist betydelig downregulation av målrettet genene CDK1, CDK4 og CDK6. CDK1 og CDK4/6 ble vist å være medvirkende for G2/M og G1/S overganger, henholdsvis. Utført analysen tillatt direkte sammenligning mellom individuelle miRs og kombinasjon miR aktivitet. Bruk av scramble siRNA med transfecting agent tillatt evaluering av interferens fra prosedyren på oppdaget genet downregulation, som var minimal. Dataene ble statistisk analysert ved hjelp av en tosidige student t-test, ogp < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant (figur 1). Før qPCR, primer sekvenser ble evaluert med primer-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> for enkel genet forsterkning. Dette ble også bekreftet ved å analysere forsterkning produkter gjennom gel geleelektroforese. Et enkelt band av DNA ble oppdaget for hver analysert genet (figur 1 d), bekrefter enkelt gene forsterkning. CDK6 enkelt forsterkning ble bekreftet (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1 : Relative uttrykk for CDK1, CDK4 og CDK6 gener som oppdages av qPCR og gel geleelektroforese analyse av DNA amplifikasjon produktene. miR-143 og miR-506 transfection A549 celler indusert downregulation av CDK1 (A), CDK4 (B) og CDK6 (C) downregulation 24 timer og 48 timer etter hva. DNA amplifikasjon produkter ble vurdert av gel geleelektroforese (D) å bekrefte enkelt gene forsterkning. GAPDH ble brukt som referanse genet. Gjennomsnittlig ± SEM, * p < 0,05; ** p < 0.01, tosidige t-test. Dette tallet er endret fra Hossian et al.11Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cellen syklus distribusjon ved hjelp av flowcytometri

Propidium iodide farging av mobilnettet nukleinsyrer er en standard å visualisere celle befolkningen i ulike stadier av celle syklus av kvantifisering av DNA innhold. Kombinasjon behandling av miR-143 og miR-506 stoppet cellen syklus på to sjekkpunkter, G0/G1 og G2/M, som indikert gjennom flyt cytometric analyse (figur 2).

Figure 2
Figur 2 : Cellen syklus analyse av A549 celler transfekterte med miR-143 og miR-506 24 timer og 48 timer etter transfection. Celle populasjoner prosenter for hver celle syklus ble fastsatt av flowcytometri og DNA-bindende propidium iodide. Gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er gjengitt med endringer fra Hossian et al.11Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Annexin V/PI apoptose analysen av flowcytometri

Etter hva A549 celler med miR-143 og miR-506, apoptose analysen ble utført med Annexin V og PI flekker og flyt cytometri. Det ble oppdaget at kombinasjon behandling indusert betydelig apoptose på 24 h og 48 h timepoints. I forhold til negative kontrollene, identifiserte prosent-endring av apoptotisk celler som oppdages av Annexin V positiv cellene, på grunn av miR behandling som vises i Figur 3.

Figure 3
Figur 3 : Illustrerende analyse av apoptotisk celler. Transection miR-143 og miR-506 økt prosent av Annexin V positiv A549 celler. Gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, tosidige t-test. Dette tallet er endret fra Hossian et al.11Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cellen syklus antistoff microarray

Mekanistisk svar til behandling kan identifiseres gjennom endringer i protein uttrykk. Differensial uttrykket ble vurdert på et protein gener forbundet med cellen syklus veien med en sti-spesifikke antistoffer microarray. Protein ekstrakter ble brukt for analyse fra celler transfekterte med miR-143/506. Microarray analysen tillatt for semi kvantitativ analyse av ~ 60 celle syklus-assosiert proteiner, med seks gjentak for hver spesifikt antistoff. Tilnærmingen gir et bredere perspektiv mekanistisk atferd i en spesifikk sti, identifikasjon av molekylære mål for videre evaluering og utføre analyse på post-translasjonell nivå. På grunn av semi kvantitative prinsippet om metoden må noen resultater på bestemte gener bekreftes gjennom vestlige blotting. Indicatively, i denne analysen var ble et redusert uttrykk for proteiner forbundet med cellen syklus progresjon oppdaget. Dette inkluderte målrettet CDK1 og CDK4 både 24 timer og 48 timer etter transfection (figur 4A), som oppdages av qPCR.

Figure 4
Figur 4 : Gene feilregulering som oppdages av microarray og RNA sekvensering analyse. (A) Heatmap av cellen syklus veien genet uttrykk som oppdages av microarray analyse i protein utskrifter fra A549 celler transfekterte med miR-143 og miR-506, 24 timer og 48 timer etter hva. (B) fold endring av cellen syklus veien genet uttrykk fra A549 celler transfekterte med miR-143 og miR-506 på 24 timer etter hva som oppdages av RNA sekvensering. (C) Pathway aktivitet som analyseres av sti analyseprogramvare fra data fra RNA sekvensering. Dette tallet er endret fra Hossian et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

RNA sekvensering og sti analyse bruker sti analyseprogramvare

Neste generasjons sekvensering analyserer nøyaktig genuttrykk på RNA nivå. Den tillater for identifikasjon av flere genet endringer gjennom en enkelt analyse (i denne protokollen, analysen oppdaget uttrykk for > 18 000 gener). På grunn av det store antallet oppdaget gener, ble bioinformatikk analyser brukt for effektiv fastsettelse av veien atferd (figur 4B). Programvare ble brukt (se Tabell for materiale) å forutsi G1/S og G2/M fase arrestasjoner og downregulation s fase innvielse (figur 4C). Videre kan RNA sekvensering resultatene bli sammenliknet med qPCR data. I denne studien den RNA sekvensering bekreftet resultatene fra qPCR analysen, som indikerer en downregulation av CDK1 (48%, p < 0,001, FDR < 0,001), CDK4 (68%, p < 0,001, FDR < 0,001), og CDK6 (71%, < 0,001, FDR < 0,001) grunn kombinasjon miR-143 og miR-506 aktivitet. Statistisk analyse var utført av EdgeR programvaren brukes for beregning av den relative genuttrykk, beregne p -verdier ved hjelp av Negative binomiske20,21. Bioinformatikk analyse kan utføres for funksjonell evalueringen miRNA aktivitet og prediksjon av mulige molekylære mål, som vist i figur 5.

Figure 5
Figur 5 : Illustrerende veien og mekanistisk analyse presentert ved sti analyse aoftware. RNA sekvensering data ble analysert fra A549 celler transfekterte med miR-143 og miR-506, 24 timer etter transfection, med sti analyseprogramvare og identifiserte kanoniske trasé laveste (A) eller høyeste (B) aktivisering score. Programvaren leveres også spådd funksjoner (C) og potensielle oppstrøms regulatorer/mål (D). Dette tallet er gjengitt fra Hossian et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Endothelial tube formasjon analysen

I vitro endothelial tube formasjon analysen er mye brukt til å studere angiogenese og er pålitelig, automatisert og kvantifiserbare22. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en velkjent angiogenic vekstfaktor23,24 og endothelial tube formasjon promoter. I denne studien ble det identifisert at kombinasjon behandling av miR-143 og miR-506 opphever VEGF-indusert angiogenese. Indikativ bilder av rør dannelse og effekten av behandling presenteres i figur 6.

Figure 6
Figur 6 : Representant bilder av endothelial rosenkål av VEGF-behandlet vs ikke-behandlet HUVECs transfekterte med scramble miRNA, miRNA-143, miRNA-506 eller en kombinasjon av disse. Bildene ble innhentet under brightfield mikroskop utstyrt med et digitalt kamera under 4 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNAs kan fungere som målrettet terapi for kreftbehandling, erkjenner feilregulering av uttrykk i syke vs normalt vev. Denne studien som skulle avgjøre miRNAs som potensielt stoppe celle syklus progresjon i flere etapper. Det ble identifisert som miR-143 og miR-506 stoppe cellen syklus av kreftceller og presentert protokollene å forstå aktiviteten til denne kombinasjon miRNA behandlingen.

De beskrevne metodikkene gir en overordnet forståelse på funksjon av miRNAs. Utfordringene med å studere miRNAs er forbundet med evnen til å målrette flere gener og dermed påvirke flere veier. Beskrevet qPCR analysen kan identifikasjon av uttrykket av bestemte gener av interesse, om konkrete mål identifiseres før behandling. For eksempel var at hovedfokus her et uttrykk for CDK1 og CDK4/6 og celle syklus.

Dermed er celle syklus analyse med propidium iodide og flyt cytometri protokollen en pålitelig tilnærming til å oppdage endringer i celle populasjoner ifølge deres scenen i cellen syklus. Metoden bruker forholdsmessig øker fluorescens signal av PI, som binder seg til DNA, tilsvarer scenen i cellen syklus. Kort, celler i S fase syntetisere DNA, inducing høyere signaler enn celler i G0/G1 fase, og celler i G2 fase har duplisert DNA, produserer det mest intense signalet.

Samler bevis indikerer tilkoblingen skade til cellen syklus og utløser apoptose25. Flow cytometri metoden bruker Annexin VI/PI er konsekvent brukt til å identifisere indusert apoptose i cellene fra kjemoterapi behandling. Indicatively, ble sterk apoptotisk svar identifisert på grunn av kombinasjon miRNA terapi, som var mer potente i forhold til den individuelle miRNAs.

Semi kvantitative protein antistoff microarray er en sensitiv og pålitelig metode for å identifisere protein uttrykk endringer gjelder bestemte biologiske responser26,27. Denne protokollen brukes en celle syklus sti-spesifikke antistoffer microarray, som fant uttrykk i ~ 60 gener mellom behandlet og ubehandlet celler. Forsiktig er nødvendig under vask trinnene slik at prosessen er utført grundig og minimere bakgrunn signalet. I tillegg bør lysbildene ikke bli tørr før ferdigstillelse av eksperimentet.

Derimot gir RNA sekvensering kvantitative gene uttrykk analyse av flere gener, på post transkripsjon nivå. Betydelig større antall analysert gener (> 18.000 for RNA-seq vs 60 for microarray) tillater samtidig analyse av flere stier og molekylære mål, og med økt nøyaktighet. Så bredt analyse er viktig, som en enkelt miRNA kan binde til og målrette ulike mRNAs. Derimot er sti analyse av store antall genet dysregulations iboende utfordrende. For eksempel selv den RNA sekvensering bekreftet vår qPCR data om CDK1 og CDK4/6 downregulation på grunn av miRNA behandling, analysen også gitt data om tusenvis av gener som var ned- eller opp-regulert. For å gi sammenheng til så mange genet dysregulations, ble sti analyseprogramvare brukt til å bestemme samlede effekten av behandlingen på ulike veien og cellular funksjonene. Indicatively, gitt programvaren score representant til Aktivisering (positiv z score) eller inaktivering (negativ z score) av bestemte funksjoner eller veier, samt statistiske betydning av analyse (figur 5)28.

Avslutningsvis er studiet av miRNA aktivitet en utfordrende prosedyre. Iboende kapasiteten til miRNAs å påvirke flere gener krever bruk av flere omfattende og kompliserte analytiske metoder å identifisere potensielle aktivitet. Ikke overraskende, er videre arbeid nødvendig for å fullt ut forstå aktivitetene til miR-143 og miR-506 i lungekreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ønsker å erkjenne John Caskey ved Louisiana State University for hans hjelp på sti analyse av RNA sekvensering dataene og University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center neste generasjons sekvensering kjernen for utfører RNA sekvensering og data analyse. Denne forskningen ble støttet av College of Pharmacy, Universitetet i Louisiana Monroe oppstart finansiering og the National Institutes of Health (NIH) gjennom National Institute for generell medisinsk vitenskap tilskudd 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

Ingen konflikter av interesse er deklarert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

Kreftforskning problemet 145 hva miRNA lungekreft celle syklus apoptose angiogenese RNA sekvensering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analyse av kombinasjon miRNA behandlinger for å regulere cellen syklus og angiogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter