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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Abstract

Cáncer de pulmón (LC) es la causa principal de muertes relacionadas con cáncer en todo el mundo. Similares a otras células de cáncer, una característica fundamental de las células del LC es la proliferación no regulada y la división celular. Inhibición de la proliferación por detener la progresión del ciclo celular ha demostrado ser un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer, incluyendo LC.

terapéutica de miRNA se han convertido en reguladores del gen postranscripcional importante y cada vez más están siendo estudiados para su uso en el tratamiento del cáncer. En trabajos recientes, se utilizaron dos miRNAs, miR-143 y miR-506, para regular la progresión del ciclo celular. Células de cáncer (CPCNP) de pulmón de células no pequeñas A549 fueron transfectadas, alteraciones de expresión del gene fueron analizados y finalmente se analizó la actividad apoptótica debido al tratamiento. Downregulation de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) fueron detectados (CDK1, CDK4 y CDK6), y ciclo celular se detiene en las transiciones de fase G1/S y G2/M. Análisis de la vía indican potencial actividad angiogénica del tratamiento, que dota el enfoque de actividad multifacética. Aquí se describe son las metodologías utilizadas para identificar la actividad del miRNA con respecto a la inhibición del ciclo celular, inducción de apoptosis y efectos del tratamiento sobre las células endoteliales por la inhibición de la angiogénesis. Se espera que los métodos presentados aquí apoyará investigaciones futuras sobre terapéutica de miRNA y la actividad correspondiente y que los datos representativos guiará a otros investigadores en análisis experimentales.

Introduction

El ciclo celular es una combinación de varios eventos regulatorios que permiten la duplicación del ADN y proliferación celular mediante el proceso mitótico1. Quinasas Ciclina-Dependientes (CDKs) regularan y promoción el ciclo celular2. Entre ellos, el CDK mitótica (CDK1) y la interfase CDKs (CDK2, CDK4 y CDK6) tienen un papel fundamental en el ciclo celular avance3. Proteína del retinoblastoma (Rb) es fosforilada por la CDK4/CDK6 complejos para permitir de la progresión del ciclo celular4y activación de CDK1 es esencial para la exitosa División de la célula5. Numerosos inhibidores de CDK se han desarrollado y evaluado en ensayos clínicos durante las últimas décadas, indicando el potencial de dirigirse las CDKs en tratamiento contra el cáncer. De hecho, tres inhibidores de CDK han sido aprobados para el tratamiento del cáncer de mama recientemente6,7,8,9,10. Así, las CDKs, y en particular, CDK1 y CDK4/6, son de gran interés en la regulación de la progresión del cáncer de la célula.

miRNAs (miRs) son pequeños, no-codificación RNAs y reguladores postranscripcional de la expresión génica, regulación de aproximadamente 30% de todos los genes humanos11. Su actividad se basa en la represión de translación o degradación del mensajero RNAs (mRNAs)12. Ilustrativo de su significación biológica, se han identificado más de 5.000 miRNAs y una molécula de miRNA solo puede regular múltiples genes11,13. Lo más importante, expresión de miRNA se ha asociado con diferentes enfermedades y Estados de enfermedad, incluyendo cáncer13. De hecho, miRNAs se han caracterizado como oncogénicos o supresores de tumor, siendo capaz de promover o suprimir el tumor y14,15. La expresión relativa de miRNAs en los tejidos enfermos puede regular progresión de la enfermedad; así, el suministro exógeno de miRNAs tiene potencial terapéutico.

Cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer y más de 60% de todas las malignidades pulmonares son pequeñas células de pulmón cáncer16,17, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 20%18. El uso de miR-143-3 p y p de miR-506-3 fue evaluado recientemente para apuntar los ciclos celulares de las células de cáncer de pulmón11. miR-143 y miR-506 tienen secuencias complementariedad CDK1 y CDK4/CDK6, y se analizaron los efectos de estos dos miRs en células A549. Los datos experimentales se presentan y discuten en este documento. Expresión génica, la progresión del ciclo celular y la apoptosis fueron evaluadas utilizando diferentes diseños experimentales y los puntos de tiempo después de transfección. Se utilizaron los métodos PCR (RT-qPCR) cuantitativos en tiempo real junto con el análisis de microarrays para medir la expresión de genes específicos, y secuenciación de próxima generación RNA se utilizó para determinar gen global dysregulation11. El último método identifica la abundancia relativa de transcripción de cada gen con alta sensibilidad y reproducibilidad, mientras que miles de genes pueden ser analizadas desde un único análisis experimental. Además, análisis de apoptosis por miRNA tratamiento fue realizada y se describen aquí. Bioinformática complementa el análisis de la vía. Presentados aquí son protocolos utilizados para análisis del terapéutico potencial de la combinatoria de miR-143 y miR-506.

El objetivo principal de este protocolo es identificar los efectos de los miRNAs en células, con un enfoque en el ciclo celular. La variedad de técnicas presentadas aquí útil de análisis de expresión génica novela y traducción antes (usando qPCR) para la elaboración de técnicas para el análisis del gene en el nivel de proteína, tales como análisis de microarrays. Se espera que este informe es útil para los investigadores interesados en trabajar con miRNAs. Además, se presenta una metodología para el análisis cytometric del flujo del ciclo celular y apoptosis de las células.

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Protocol

1. miR-143 y miR-506 transfección

PRECAUCIÓN: Use guantes de látex, gafas protectoras y una capa de laboratorio al realizar los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilizar el gabinete de seguridad de la biotecnología con el ventilador gabinete, sin bloqueo de las vías respiratorias o perturbar el flujo laminar. Siempre ponga la ventana protección de cristal a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.

  1. Las células A549 NSCLC de semilla un T25 cm2 frasco/6/96 bien placa en medio DMEM/F12K suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina (medios de cultivo) en una campana de cultivo de tejidos e incuban durante una noche a 37 ° C con 5% CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos.
  2. Suspender imitadores de miR-143 y miR-506 o codificar siRNA con el agente de transferencia (2.4 μg de miR se mezclaron con 14 μl del agente transfectar; véase Tabla de materiales) en 500 μl de medio de transfección y 1,5 mL de suero y antibióticos medios DMEM/F12K en un concentración final miRNA de 100 nM. cantidad de miRNA puede requerir optimización de diversas células y concentraciones. Enfoques apropiados incluyen la transfección de las células con el aumento de las concentraciones de miRNA (es decir, 50-200 nM) y la evaluación de la desregulación de la expresión de los genes de interés.
  3. Retire los medios de cultivo del frasco/de la placa y lavar una vez con PBS 1 x.
  4. Añadir complejos agente miRNA/despegue en tiempo mínimo-transferencia e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 6 h (tamaño de matraz define el volumen añadido de la incubación).
  5. Sustituir los medios de comunicación con 4 mL de medio de cultivo e incubar las células para 24 h o 48 h.
  6. Cosecha de células transfected por tripsinización, añadiendo 1 mL de tripsina-EDTA en cada frasco de2 cm T25, incube durante 5-10 min a 37 ° C y añadir 3 mL de medio de cultivo para cosechar las células. Coloque el contenido de cada frasco en un tubo separado, marcado 15 mL. Trabajar en una campana de cultivo de tejidos.
  7. Centrifugue a 751 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
    Nota: PRECAUCIÓN se requiere durante la extracción del sobrenadante, como agitación del tubo puede causar la pérdida de las células.
  8. Añadir 2 mL de 1 x PBS y centrifugar durante 5 min en 751 x g.
  9. Repita los pasos 7 y 8 una vez para eliminar cualquier rastro de los medios de comunicación y sobrenadante.
    Nota: En esta etapa, tubos de ensayo pueden ser almacenados a-80 ° C o se pueden utilizar inmediatamente.

2. extracción de RNA

  1. Limpie el área de trabajo mediante pulverización con solución de descontaminación de RNasa y alcohol isopropílico al 70%.
  2. Extracción de RNA debe realizarse con un RNA apropiado kit (véase Tabla de materiales).
  3. Retirar los tubos de-80 ° C y que puedan descongelar. Añadir 300 μL de tampón de lisis y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana de la célula.
  4. Añadir un volumen igual de etanol ultra puro 100%.
  5. Mezclar bien y colocar en la columna de separación.
  6. Centrifugar entre 11 y 16 x g durante 30 s y quitar el flujo a través.
  7. Añadir 400 μL de buffer y centrifugadora para retirar el tampón de lavado.
  8. Añadir 5 μl de DNasa I con 75 μl de la digestión del ADN del búfer en cada muestra e incube durante 15 minutos.
  9. Lavar la muestra con 400 μL de tampón preparación de RNA.
  10. Lavar 2 x con tampón de lavado de RNA.
  11. Añadir agua libre de nucleasa a la columna, centrífuga, luego recoge el ARN.
  12. Concentración de RNA total medida con un espectrofotómetro UV.

3. RT-qPCR

  1. Antes de la RT-qPCR, sintetizar el cDNA. Con posterioridad a la cuantificación de la concentración de RNA, coloque 1 μg de RNA en un volumen final de 20 μl de reacción para preparar cDNA en un tubo PCR. Trabaje siempre sobre una mesa de trabajo limpia.
  2. Todos los ingredientes necesarios están incluidos en la tabla 1.
Ingredientes Cantidad (μL) muestra (20 μl)
5 X cDNA Master mix 4
dNTPs 2
Random hexamers 1
Reforzador de la RT 1
Mezcla de enzima verso 1
Agua libre de DNAsas y ARNasas Cantidad requerida tras añadir RNA para hacer 20 μl

Tabla 1: Materiales para síntesis de cDNA de las muestras de RNA. Requiere cantidades de ingredientes respectivos para preparar una mezcla principal para una muestra para síntesis de cDNA.

  1. Incubar en un termociclador con las siguientes condiciones de temperatura: 42 ° C por 30 min; 95 ° C por 2 min; 4 ° C hasta la recogida de muestras.
  2. Utilizar inmediatamente de PCR o qPCR o almacenar cDNA a-20 ° C.
  3. Preparar soluciones de primer avance y retroceso con DNasa/Rnasa-libre de agua a una concentración de 10 μm de la solución stock cartilla.
  4. Preparar mezclas principales independientes para cada gen ser detectado, según el número de muestras. Para cada muestra de cDNA (qPCR bien), la cantidad de reacción se prepara según la tabla 2.
Ingredientes Cantidad (μL) muestra (20 μl)
Mezcla maestra SYBR 10
Primer avance - 10 μM 2
Cartilla inversión - 10 μM 2
Agua libre de DNAsas y ARNasas 3
muestra de cDNA 3

Tabla 2: materiales para la PCR cuantitativa en tiempo real de las muestras de cDNA. Necesaria la cantidad de ingredientes para preparar una mezcla principal para una muestra para qPCR.

  1. Colocar cada muestra en los pocillos respectivos.
  2. Diseño el diseño de la muestra de la placa de 96 qPCR bien. Para cada muestra y cada gen analizado, realizar la reacción en triplicado, o al menos en duplicado.
  3. Sello del 96 bien la placa con una cubierta adhesiva clara.
  4. Rápido-hacer girar la placa para permitir que la mezcla de reacción alcanzar el fondo de cada pozo.
  5. Ejecutar RT-qPCR según el gradiente térmico siguiente:
    1) 50 ° C por 2 min
    2) 95 ° C por 2 min
    3) 95 ° C por 15 s
    4) tomar lectura
    5) 60 ° C durante 1,5 min.
    6) Repita el paso 3 para 39 veces
  6. Ejecute el siguiente gradiente térmico en la continuación de la anterior para determinar la curva de fusión indica la amplificación de solo producto.
    7) 65 ° C por minuto 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) lectura de placa
    10) Repita el paso 8 para 60 veces hasta llegar a 95 ° C
    11) 72 ° C por 2 min

4. electroforesis en agarosa para confirmar una amplificación del gen

  1. Preparar el gel de agarosa al 1% en buffer de x TBE 1.
  2. Añadir bromuro de etidio (EtBr) en gel caliente (~ 50 ° C) hasta lograr una concentración final de aproximadamente 0.2-0.5 μg/mL. EtBR se une con el ADN y le permite ser visualizado bajo la luz de un formador de gel UV.
  3. Vierta el gel caliente en una bandeja de gel provista de una caja del gel de electroforesis. Instale el peine siempre firmemente para pozos uniforme.
  4. Permita que el gel al resto y dejar enfriar a temperatura ambiente (RT) ~ 30 min.
  5. Cuando el gel se solidifica, coloque el gel y la bandeja en la caja de gel.
  6. Llene la caja de gel con 1 x TBE buffer hasta cubre completamente el gel.
  7. Medir la concentración de la DNA del proceso de amplificación de PCR usando un espectrómetro UV.
  8. Tomar ~ 15 ng de ADN en un pequeño tubo PCR, añadir 5 μl de colorante y agregar la cantidad necesaria de agua libre de nucleasa para alcanzar un volumen total de 15 μl.
  9. Coloque la escalera de ADN y muestras en los pozos.
  10. Correr el gel a 100 V hasta la línea del tinte es aproximadamente 75-80% por el gel.
    Nota: Asegúrese de que el gel funciona de una negativa a la carga positiva.
  11. Retirar el gel y colóquelo en el reproductor de imágenes de gel para visualizar el ADN.

5. análisis del ciclo de la célula

  1. Semilla 5 x 105 células cada muestra en un matraz de2 cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
  2. Después de 24 h y 48 h, luego recoger las células por tripsinización.
  3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos estériles de 15 mL y etiquetarlos correctamente.
  4. Centrifugar las muestras a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
  6. Repetir el lavado con 1 x PBS para quitar los restos de medios.
  7. Suspender y romper el precipitado mediante la adición de 200 μL de PBS 1 x helada por pipeteo.
  8. Fijar las células añadiendo 2 mL de etanol al 70% helada gota a gota en el tubo mientras un vórtex suavemente.
  9. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente y colocar los tubos a 4 º C durante 1 hora.
  10. Retirar tubos de 4 ° C y centrifugar a 751 x g durante 5 minutos.
  11. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
  12. Añadir 500 μl de 1 x PBS con yoduro de propidio (50 μg/mL) y ribonucleasa (200 μg/mL)
  13. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente mientras que la protección de las muestras de la luz.
  14. Adquirir datos en citómetro de flujo. Utilice hacia adelante vs scatter (FSC y SSC) para seleccionar la población principal de las células, excepto residuos en la esquina inferior izquierda de los clusters de parcela y de la célula de densidad FSC vs SSC de lado en la parte superior hacia arriba-derecha de la parcela de la densidad FSC y SSC.
  15. Analizar los datos para la identificación de poblaciones celulares por etapa del ciclo celular con el software apropiado.

6. Apoptosis ensayo

  1. Semilla 5 x 105 células cada muestra en un matraz de2 cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
  2. Después de 24 h y 48 h, recoger las células por tripsinización.
  3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos estériles de 15 mL y etiquetarlos correctamente.
  4. Centrifugue a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
  6. Repetir el lavado con 1 x PBS para quitar los restos de medios.
  7. Diluir 10 x tampón de Unión anexina V 1 x con helada dH2O.
  8. Añadir 1 mL de 1 x de tampón de unión de la anexina V a cada tubo de muestras y resuspender suavemente.
  9. Suspensión de células de lugar 96 μl of en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  10. Añadir 1 μl de conjugado anexina V-FITC y 12,5 μl de yoduro de propidio (PI) para el tubo que contiene la suspensión de células.
  11. Incubar la suspensión celular por 10 min en hielo en la oscuridad.
  12. Añadir 250 μl helada 1 x de tampón de unión de anexina V a cada tubo de muestra para diluir.
  13. Analizar inmediatamente las muestras con citómetro de flujo.

7. expresión de la proteína por ciclo celular microarrays de anticuerpos

  1. Semilla 5 x 105 células cada muestra en frascos de2 cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
  2. Después de 24 h y 48 h, recoger células por tripsinización.
  3. Transferencia de suspensiones celulares para tubos de 15 mL y etiquetarlos en consecuencia.
  4. Centrifugue a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
  6. Repetir el lavado con 1 x PBS.
  7. Añadir 150 μL de tampón de lisis con inhibidores de la proteasa. Pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para alterar las membranas celulares.
  8. Para evitar cualquier interferencia de buffer de lisis, realizar un intercambio de búfer para reemplazar el tampón de lisis con tampón etiquetado, utilizando columnas de intercambio solvente del fabricante.
  9. Cuantificar las proteínas totales con un ensayo BCA.
  10. 70 μg de muestra de la proteína y añadir tampón etiquetado para alcanzar un volumen final de 75 μl.
  11. Añadir 100 μl de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reactivo de la biotina (biotin/DMF).
  12. Agregar 3 μl de biotina/DMF a cada muestra de proteína (muestra de proteína biotinilada) e incubar por 2 h a TA.
  13. Añadir 35 μl de reactivo de parada y mezclar con un vórtex.
  14. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  15. Sacar los portaobjetos de microarray de la nevera para que caliente a RT para 1 h antes de su uso.
  16. Realizar bloqueo de fijación no específica por incubar los portaobjetos con solución 3% leche en polvo (en bloqueo reactivo proporcionado por el fabricante) en una placa Petri con agitación continua por 45 min a TA.
  17. Lavar los portaobjetos con ddH2O agua (a menos que se especifique lo contrario, lavado ocurre con ddH2O).
  18. Repetir el lavado ~ 10 x para eliminar completamente la solución de bloqueo de las superficies de deslizamiento. Esto es importante para lograr un fondo uniforme y baja.
  19. Eliminar el exceso de agua de las superficies de deslizamiento y proceder al siguiente paso sin dejar que las diapositivas en seco.
  20. Preparar la solución de acoplamiento disolviendo 3% leche en polvo en un reactivo de acoplamiento.
  21. Añadir 6 mL de la solución de acoplamiento y a la cantidad completa de la muestra de proteína biotinilada previamente preparado en el paso 7.12.
  22. Lugar una diapositiva en un pozo de la cámara de acoplamiento suministrado por el proveedor y añadir ~ 6 mL de proteína mezcla de acoplamiento a él.
    Nota: Asegúrese de que la diapositiva esté totalmente sumergida en la proteína de acoplamiento solución de mezcla.
  23. Cubrir la cámara de acoplamiento e incubar por 2 h a temperatura ambiente con agitación en un agitador orbital.
  24. Transfiera los portaobjetos a un plato de Petri y añadir 30 mL de 1 x de tampón de lavado. Coloque el plato Petri en Agitador orbital, agitar durante 10 minutos y descartar la solución.
  25. Repita el paso 7,24 2 x.
  26. Enjuague los portaobjetos con ddH2O agua extensivamente como se describe en los pasos 7.17 y 7.18 y proceder al siguiente paso inmediatamente para evitar que se sequen.
  27. Añadir 30 μl de Cy3-estreptavidina (0.5 mg/mL) en 30 mL de tampón de detección.
  28. Coloque el portaobjetos en una caja Petri y añadir 30 mL de tampón de detección que contiene Cy3-estreptavidina.
  29. Incubar en un agitador orbital durante 20 min con agitación continua protegida de la luz.
    Nota: Cy-3 es un colorante fluorescente. Cubrir con papel de aluminio u operan bajo condiciones de oscuridad para mantener la intensidad de la fluorescencia.
  30. Ejecutar los pasos 7.24 7.26 y permita que el portaobjetos secar utilizando una suave corriente de aire o colocar el portaobjetos en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 1300 x g durante 5-10 minutos.
  31. Coloque el portaobjetos en portaobjetos y cubierta con papel de aluminio.
  32. Analizar la diapositiva en un escáner de microarreglos con las correspondientes longitudes de onda de excitación y emisión. En el caso de Cy3, el pico de longitud de onda de excitación es en ~ 550 nm y emisión máxima a ~ 570 nm.
  33. Analizar los datos (véase Tabla de materiales) para el software utilizado).

8. la secuencia de RNA

  1. Semilla 5 x 105 células cada muestra en frascos de2 cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
  2. Después de 24 h y 48 h, recoger las células por tripsinización.
  3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos de 15 mL y etiquetarlos en consecuencia.
  4. Acuerdo con la sección 2, pasos 1-6 Extracto de RNA.
  5. Verificar calidad de RNA concentración con un bioanalyzer. Una integridad del RNA puntuación (RIN) por encima de ocho y su caso histogramas son necesarios para confirmar la calidad del RNA.
  6. De ARN total, use ~ 2 μg de la muestra de RNA (RNA del Mensajero de ARN total) de la secuencia
  7. Secuencia utilizando un secuenciador de última generación11.
  8. Ejecutar el ajuste de calidad y mapas con un genoma de referencia de FASTQ archivos generados a partir del ARN secuencia máquina11.
  9. Subir archivos FASTQ y crudo leer los datos de cuenta para Banco de germoplasma, siguiendo las instrucciones de la < página web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.
    Nota: Ver número SRP133420 de los resultados anteriores.

9. ensayo de formación de tubo de

  1. Evaluar el potencial angiogénico de vena umbilical humana miRNA transfected las células endoteliales (HUVECs) 36 h después la transfección, como se describe en la sección 1, pasos 1-5, utilizando células HUVEC en lugar de células A549.
  2. De hambre HUVECs con M199 medios de hambre durante 4 h a 37 ° C con 5% CO2.
  3. Quitar matriz de membrana basal reducido factor de crecimiento de-80 ° C y almacenar a 4 ° C durante la noche, permitiendo la descongelación gradual evitar la polimerización y la formación de burbujas.
  4. Lentamente y con cuidado cubra los pocillos de una placa bien 96 con 0,04 mL de matriz de la membrana del sótano de reducido factor de crecimiento, evitando formación de burbujas. Realizar todo el procedimiento bajo una campana de flujo laminar.
  5. Llenan de pozos adyacentes de la placa de la pozo 96 0,1 mL de PBS para mantener la humedad y preservar la temperatura.
  6. Incube la placa bien 96 a 37 ° C por al menos 20 min para que se logra la polimerización del extracto de la membrana del sótano. No incubar más de 1 h.
  7. Trypsinize transfected HUVECs de cada grupo y resuspender en medio M199 a una concentración de 1 x 105 células/mL.
  8. Añadir 0,1 mL de cada suspensión en los pocillos que contienen matriz polimerizada la membrana del sótano en la placa de la pozo 96.
  9. Incube la placa bien 96 a 37 ° C con 5% CO2 y preparación de los factores de crecimiento lleva a cabo. Preparación de factores de crecimiento también ocurre bajo la campana de flujo laminar.
  10. Reconstituir los factores de crecimiento (VEGF) en 2 x la concentración final deseada (concentración de 4 ng/mL para la concentración final de 2 ng/mL) y añadir 0,1 mL de medio de inanición de M199 que contienen factor de crecimiento encima de la 0,1 mL de medio de hambre M199 con las células. Para pozos no tratadas de VEGF, Añadir 0,1 mL de medio de hambre M199 encima de la 0,1 mL de medio de hambre M199 con las células.
  11. Incube la placa bien 96 por 6 h a 37 ° C con 5% CO2.
  12. Al final de la incubación, obtener imágenes de cada pocillo con 4 aumentos, utilizando un microscopio de campo luminoso conectado con una cámara digital.
  13. Proceso de imágenes con software equipado con un plug-in "analizador de la angiogénesis"19. Utiliza tres parámetros, el número de nodos, el número de uniones y la longitud de brotes total, para comparar los efectos del tratamiento de miRNA en angiogénesis.

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Representative Results

Análisis de expresión génica utilizando RT-qPCR y gel electroforesis

Análisis de expresión génica diferencial utilizando RT-qPCR demostraron significativa desregulación de los genes específicos CDK1, CDK4 y CDK6. CDK1 y CDK4/6 fueron demostrados para ser instrumental para la G2/M y las transiciones de G1/S, respectivamente. El análisis realizado permitió comparación directa entre la actividad combinatoria miR y miRs individuales. El uso del ARNsi despegue en tiempo mínimo con el agente transfecting permitido la evaluación de cualquier interferencia del procedimiento en detectado downregulation del gen, que era mínima. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando de dos colas estudiante t-test, yp < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo (figura 1). Antes de la qPCR, las secuencias de la cartilla fueron evaluadas usando chorro de cartilla < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> para la amplificación de gen única. Esto también fue confirmado mediante el análisis de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel. Una banda única de productos de DNA fue detectada para cada gen analizado (figura 1), confirmando una amplificación del gen. CDK6 amplificación solo fue confirmada (datos no mostrados).

Figure 1
Figura 1 : Expresión relativa de genes CDK1, CDK4 y CDK6 detectada por qPCR y análisis de electroforesis de gel de los productos de amplificación de ADN. miR-143 y miR-506 la transfección de las células A549 había inducida downregulation de downregulation CDK1 (A), (B) de CDK4 y CDK6 (C) en 24 h y transfección después de 48 h. Se evaluaron productos de amplificación de ADN por electroforesis en gel (D) para confirmar una amplificación del gen. Se utilizó GAPDH gen de referencia. Promedio ± SEM, * p < 0.05; ** p < 0.01, dos colas t-test. Esta figura ha sido modificada desde Hossian et al11haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo

Yoduro de propidio tinción de ácidos nucleicos celulares es un método estándar para visualizar la población celular en diferentes etapas del ciclo celular por la cuantificación del contenido de ADN. El tratamiento combinatorio de miR-143 y miR-506 detiene el ciclo celular en dos puestos de control, G0/G1 y G2/M, como se indica a través de análisis de citometría de flujo (figura 2).

Figure 2
Figura 2 : Análisis de ciclo celular de las células A549 transfected con miR-143 y miR-506 en 24 h y transfección después de 48 h. Se determinaron porcentajes de poblaciones de células para cada ciclo celular por citometría de flujo y yoduro de propidio DNA-que atan. Promedio ± SEM. Esta figura es reproducida con modificaciones de Hossian et al11haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de apoptosis de anexina V/PI por citometría de flujo

Tras la transfección de las células A549 con miR-143 y miR-506, se realice un ensayo de apoptosis con anexina V y PI a la coloración y flujo cytometry. Se identificó que el tratamiento combinatorio indujo apoptosis significativa en puntos de tiempo 24 h y 48 h. En comparación con los controles negativos, el cambio de porcentaje de células apoptóticas se determinó según lo detectado por las anexina V las células positivas, debido al tratamiento miR tal como se presenta en la figura 3.

Figure 3
Figura 3 : Análisis ilustrativo de células apoptóticas. Corte transversal con miR-143 y miR-506 aumentó el porcentaje de las células A549 positivas anexina V. Promedio ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, dos colas t-test. Esta figura ha sido modificada desde Hossian et al11haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microarrays de anticuerpos de ciclo celular

Mecanicistas respuestas al tratamiento pueden ser identificadas a través de cambios en la expresión de la proteína. Expresión diferencial fue evaluado en un nivel de proteína de genes asociados con la vía de ciclo celular usando un anticuerpo específico vía microarray. Extractos de proteína fueron utilizados para el análisis de las células transfectadas con miR-143/506. El análisis de microarray permitido para análisis semicuantitativo de ~ 60 proteínas de ciclo celular asociado, con seis repeticiones para cada anticuerpo específico. El enfoque permite una perspectiva más amplia de comportamiento mecanicista dentro de una vía específica, identificación de dianas moleculares para la evaluación adicional y la realización de análisis a nivel de poste-de translación. Debido al principio semi cuantitativo del método, ningún resultado en genes específicos necesita ser confirmados mediante western blot. Indicativo, en este análisis, se detectó una expresión disminuida de proteínas asociadas con la progresión del ciclo celular. Esto incluyó la CDK1 y CDK4 en 24 h y transfección después de 48 h (Figura 4A), según lo detectado por qPCR.

Figure 4
Figura 4 : Dysregulation del Gene como detectados por microarray y análisis de la secuencia de ARN. (A) mapa de calor de ciclo celular vía gene expresiones detectadas por análisis de microarrays de proteínas extrae A549 células transfected con miR-143 y miR-506, en 24 h y transfección después de 48 h. (B) doble cambio de ciclo celular vía gene las expresiones de las células A549 transfected con miR-143 y miR-506 en 24 h después de la transfección como detectada por secuenciación del RNA. Actividad (C) camino, analizada por el software de análisis de camino de los datos obtenidos de la secuencia de RNA. Esta figura ha sido modificada de Hossian et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de secuenciación y camino de ARN, usando software de análisis de camino

Secuenciación de próxima generación analiza con precisión la expresión génica a nivel de RNA. El método permite la identificación de los múltiples cambios del gene a través de un único análisis (en este protocolo, el análisis detecta la expresión de > 18.000 genes). Debido al gran número de genes detectados, análisis bioinformáticos se utilizan para eficiente determinación del comportamiento de la vía (Figura 4B). Software fue utilizado (véase Tabla de materiales) para predecir arrestos de fase G1/S y G2/M y el downregulation de S fase de iniciación (figura 4). Además, los resultados de la secuencia de RNA pueden ser comparados con datos qPCR. En este estudio, la secuencia de RNA confirmó los resultados de los análisis de qPCR, indicando una downregulation de CDK1 (48%, p < 0.001, FDR < 0,001), CDK4 (68%, p < 0.001, FDR < 0,001) y CDK6 (71%, < 0.001, FDR < 0.001) debido a actividad combinatoria de miR-143 y miR-506. Análisis estadístico se realizó por el software de bordeadora utilizado para el cálculo de la expresión génica relativa, calcular los valores de p mediante la Binomial negativa20,21. Bioinformática análisis pueden realizarse para la evaluación funcional de la actividad del miRNA y la predicción de posibles dianas moleculares, como se ilustra en la figura 5.

Figure 5
Figura 5 : Vía ilustrativa y análisis mecanicista como presentado por vía análisis aoftware. Datos de la secuencia de RNA se analizan desde A549 células transfectadas con transfección después de miR-143 y miR-506, 24 h, usando software de análisis de vía y caminos canónicos identificados con el puntaje más bajo (A) o más alto (B) activación. El software también proporciona funciones previstas (C) y los reguladores/objetivos upstream potenciales (D). Esta figura es reimpreso de Hossian et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayo de formación de tubo endotelial

El ensayo de formación de tubo endotelial in vitro es ampliamente utilizado para el estudio de la angiogénesis y es automatizada, confiable y cuantificable22. Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un conocido angiogénicos factor de crecimiento23,24 y promotor de la formación del tubo endotelial. En este estudio, se identificó que el tratamiento combinatorio de miR-143 y miR-506 abroga angiogénesis inducida por VEGF. Imágenes indicativas de la formación del tubo y los efectos del tratamiento se presentan en la figura 6.

Figure 6
Figura 6 : Imágenes representativas de brotes endoteliales de VEGF tratados vs no tratados HUVECs transfected con miRNA scramble, miRNA-143, miRNA-506 o una combinación de ellas. Imágenes fueron obtenidas bajo un microscopio de campo luminoso equipado con una cámara digital bajo 4 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

miRNAs pueden operar como terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer, reconociendo la desregulación de los niveles de expresión en enfermos vs los tejidos normales. Este estudio pretende determinar miRNAs que potencialmente detener la progresión del ciclo celular en varias etapas. Se identificó que el miR-143 y miR-506 detener el ciclo celular de las células cancerosas y los protocolos presentados se pretende comprender la actividad de este tratamiento de miRNA combinatoria.

Las metodologías descritas proporcionan un entendimiento global sobre la función de miRNAs. Los desafíos de estudiar miRNAs se asocian a su capacidad a los genes múltiples y así afectar múltiples vías. El análisis de qPCR descrito permite la identificación de la expresión de genes específicos de interés, si los objetivos específicos son identificados antes del tratamiento. Por ejemplo, el foco principal aquí fue la expresión de CDK1 y CDK4/6 y el ciclo celular.

Así, el análisis del ciclo celular mediante protocolo de citometría flujo y yoduro de propidio es un método confiable para detectar alteraciones en las poblaciones celulares según su etapa en el ciclo celular. El método se basa en el aumento proporcional de la señal de fluorescencia por el PI, que se une al ADN, correspondiente a la etapa del ciclo celular. Brevemente, las células en la fase S sintetizan ADN, induciendo mayores señales de las células en la fase G0/G1 y las células en la fase G2 han duplicado su ADN, produciendo la señal más intensa.

La acumulación de pruebas indica que la conexión de daños en el ciclo celular y activación de apoptosis25. El método de citometría de flujo utilizando anexina VI/PI siempre se ha utilizado para la identificación de la apoptosis inducida en las células del tratamiento de quimioterapia. Indicativamente, se identificó una respuesta apoptótica fuerte debido a la terapia combinatoria de miRNA, que era más potente en comparación con los miRNAs individuales.

El microarray de anticuerpo proteína semi cuantitativa es un método sensible y confiable para identificar la proteína expresión alteraciones específicas relacionadas con las respuestas biológicas26,27. Este protocolo utiliza un ciclo celular anticuerpo específico vía microarrays, que detectaron cambios de expresión en ~ 60 genes entre las células tratadas y no tratadas. La precaución se requiere durante los pasos de lavado para asegurar que el proceso se ha realizado completamente y reducir al mínimo la señal de fondo. Además, las diapositivas no deben quedar seco hasta la finalización del experimento.

En contraste, la secuencia de RNA proporciona genes cuantitativos análisis de expresiones de genes múltiples, en el nivel de la transcripción. El gran número de genes analizados (> 18.000 para RNA-seq vs 60 para microarrays) permite el análisis simultáneo de múltiples vías y dianas moleculares y con mayor precisión. Dicho análisis amplio es importante, como un único miRNA puede atar a y destino diferentes mRNAs. En contraste, el análisis de la vía de un gran número de genes dysregulations es inherentemente difícil. Por ejemplo, aunque la secuencia de RNA confirma nuestros datos qPCR downregulation CDK1 y CDK4/6 debido al tratamiento de miRNA, el análisis también proporcionó datos en miles de genes que estaban abajo- o para arriba-regulados. Para dar contexto a esos numerosos dysregulations gene, software de análisis de camino se utilizó para determinar efectos globales del tratamiento en diferentes vías y funciones celulares. Indicativo, el software proporciona a representante de puntuaciones (score de z positivo) la activación o inactivación (puntuación z negativa) de funciones específicas o vías, así como la significación estadística de los análisis (figura 5)28.

En conclusión, el estudio de la actividad del miRNA es un procedimiento difícil. La capacidad inherente de miRNAs afectan varios genes requiere la utilización de múltiples métodos analíticos elaborados y complicados para identificar la potencial actividad. No en vano, trabajo adicional es necesario para comprender las actividades de miR-143 y miR-506 en cáncer de pulmón.

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Disclosures

Los autores desean reconocer John Caskey en Louisiana State University por su ayuda en el análisis de la vía de los datos de la secuencia de RNA y la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, McDermott próxima generación secuencia núcleo para realizar el análisis de datos y la secuencia de RNA. Esta investigación fue apoyada por el College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe fondos de puesta en marcha y los institutos nacionales de salud (NIH) a través del Instituto Nacional del General médica ciencia becas 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

No se declaran conflictos de interés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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Investigación de cáncer número 145 transfección miRNA cáncer de pulmón ciclo celular apoptosis angiogénesis secuenciación del RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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