Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Анализ комбинаторной Мирна процедуры регулируют клеточный цикл и ангиогенез

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Мирна терапии имеют значительный потенциал в регулировании прогрессии рака. Продемонстрировали здесь аналитические подходы используются для идентификации деятельности комбинаторной Мирна лечения в прекращение клеточного цикла и ангиогенеза.

Abstract

Рак легких (LC) является ведущая причина рак родственных смертей во всем мире. Другие раковые клетки, фундаментальной характеристикой LC клеток является Нерегулируемое распространение и деление клеток. Было показано, что ингибирование распространения путем прекращения клеточного цикла прогрессии быть перспективным подходом для лечения рака, в том числе LC.

Мирна терапии появились как важный post-transcriptional генов регуляторов и все чаще в настоящее время изучаются для использования в лечении рака. В недавней работе мы использовали два адаптивной, мир-143 и мир-506, регулировать клеточный цикл прогрессии. A549 легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) клетки были transfected, были проанализированы изменения выражения гена, и наконец была проанализирована apoptotic активности из-за лечения. Даунрегуляция циклин зависимых киназ (CDKs) были обнаружены (то есть, CDK1, CDK4 и CDK6), и клеточного цикла в G1 (Ы) и G2/М фазовых переходов. Путь анализ свидетельствует о потенциальной деятельности антиангиогенных лечения, который наделяет подход с многогранной деятельности. Описанные здесь методологии, используемые для идентификации Мирна деятельности относительно ингибированием клеточного цикла, индукции апоптоза и эффекты лечения на эндотелиальных клеток торможение ангиогенеза. Предполагается, что представленные здесь методы будут поддерживать будущие исследования Мирна терапии и соответствующей деятельности и что репрезентативных данных будет руководствоваться другие исследователи в ходе экспериментальных анализов.

Introduction

Клеточный цикл представляет собой сочетание нескольких регулирования событий, которые позволяют дублирования ДНК и клеток распространения через mitotic процессов1. Циклин зависимых киназ (CDKs) регулирования и содействия клеточного цикла2. Среди них митотическая CDK (CDK1) и межфазных CDKs (CDK2, CDK4 и CDK6) имеют ключевую роль в клеточный цикл прогрессия3. Белка ретинобластомы (Rb) фосфорилированных, комплекс CDK4/CDK6 разрешить клеточного цикла прогрессии4, и CDK1 активация необходима для успешного клеточного деления5. Многочисленные CDK ингибиторы были разработаны и оценены в клинических испытаниях за последние несколько десятилетий, что свидетельствует о возможности таргетинга CDKs в лечении рака. В самом деле, три CDK ингибиторы были одобрены для лечения рака молочной железы недавно6,,78,9,10. Таким образом, CDKs, и в частности, CDK1 и CDK4/6, представляют большой интерес в регулировании прогрессии рака клеток.

небольшие, некодирующих РНК и post-transcriptional регуляторы экспрессии генов, регулирующих примерно 30% всех человеческих генов11интерферирующим (Мирс). Их деятельность основана на поступательной репрессий или деградации messenger РНК (мРНК)12. Характеризует их биологическое значение, были определены более чем 5000 адаптивной и один Мирна молекула может регулировать несколько генов11,13. Что еще более важно Мирна выражение был связан с различными заболеваниями и статусов болезней, включая рак13. В самом деле, адаптивной характеризовались как онкогенных или супрессоров, способного содействовать или подавлять опухоли и развитие14,15. Относительное выражение интерферирующим в пораженной ткани можно регулировать прогрессирования заболевания; Таким образом экзогенных доставки интерферирующим имеет терапевтический потенциал.

Рак легких является ведущая причина рак родственных смертей и более чем 60% всех злокачественных опухолей легких немелкоклеточного клетки легких Рак16,17, с 5-летняя выживаемость менее чем 20%18. Использование мир-143-3 p и мир-506-3 p недавно была проведена оценка для ориентации клетки циклов в легких рак клеток11. Мир-143 и мир-506, последовательности, взаимодополняемости, CDK1 и CDK4/CDK6, и были проанализированы последствия этих двух Мирс на A549 клетки. Экспериментальные данные представляются и обсуждаются в настоящем документе. Экспрессии генов, клеточный цикл прогрессии и апоптоз были оценены с использованием различных экспериментальных образцов и после transfection timepoints. Мы использовали реального времени количественные методы PCR (RT-ПЦР) наряду с microarray анализ для оценки экспрессии определенных генов, и следующего поколения РНК последовательности был использован для определения глобальных гена dysregulation11. Последний метод определяет относительное обилие транскрипт каждого гена с высокой чувствительностью и воспроизводимости результатов, в то время как тысячи генов могут быть проанализированы из одного экспериментального анализа. Кроме того анализ apoptotic вследствие обращения Мирна была выполнена и описан здесь. Биоинформатика дополнены путь анализа. Здесь представлены протоколы используются для анализа терапевтический потенциал комбинаторной мир-143 и мир-506.

Основная цель настоящего Протокола заключается в идентификации эффекты интерферирующим в клетках, с акцентом на клеточный цикл. Разнообразие методов представлены здесь диапазон из анализа выражения гена предварительный перевод (с помощью ПЦР) для разработки и новые методы для анализа гена на уровне белков, таких как microarray анализ. Остается надеяться, что этот доклад является полезным для исследователей, заинтересованных в работе с адаптивной. Кроме того представлена методология анализа потока гранулярных клеточного цикла и апоптоз клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. мир-143 и мир-506 Трансфекция

Предупреждение: Используйте латексные перчатки, защитные очки и пальто лаборатории при выполнении описанных экспериментов. При необходимости, используйте биобезопасности кабинет с корпусной Вентилятор, без блокирования дыхательных путей или нарушая ламинарного воздушного потока. Всегда устанавливайте защитные стекла на соответствующую высоту, как описано заводом-изготовителем.

  1. Семя НМРЛ A549 клетки в T25 см2 колбу/6/96 хорошо пластины в среде DMEM/F12K СМИ дополнена 10% FBS и 1% пенициллин стрептомицином (Культура СМИ) в культуре ткани капюшоном и инкубировать на ночь при 37 ° C с 5% CO2 в инкубатор культуры ткани.
  2. Приостановить мир-143 и/или мир-506 мимики, или карабкаться siRNA с transfecting агента (2,4 мкг мир были смешаны с 14 мкл transfecting агента; см. Таблицу материалы) в 500 мкл трансфекции СМИ и 1,5 мл сыворотки и антибиотик бесплатно DMEM/F12K СМИ Окончательный Мирна концентрации 100 Нм. Мирна сумма может потребоваться оптимизация на различных клеток и концентрации. Соответствующие подходы включают transfection клетки с увеличением концентрации микроРНК (т.е., 50-200 Нм) и оценки Даунрегуляция выражение генов интерес.
  3. Извлеките культуры из колбы/плиты и мыть раз с ПБС.
  4. Добавить Мирна/схватка transfecting агент комплексов и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 на 6 ч (фляга размер определяет объем добавлен инкубации).
  5. Замените 4 мл культуры средств массовой информации СМИ и инкубации клеток для 48 ч или 24 ч.
  6. Урожай transfected клеток trypsinization, добавляя 1 мл трипсина-ЭДТА в каждом T25 см2 фляги, Проинкубируйте 5-10 мин при 37 ° C и добавить 3 мл культуры средств массовой информации для сбора клеток. Поместите содержимое каждого колбу в отдельный, отмеченные 15 мл трубку. Работа в культуре ткани капюшоном.
  7. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
    Примечание: Осторожность требуется во время удаления супернатанта, как возбуждение трубки может привести к потере клеток.
  8. Добавить 2 мл ПБС и центрифуги для 5 мин в 751 x g.
  9. Повторите шаги 7 и 8 раз, чтобы удалить все следы средств массовой информации и супернатант.
    Примечание: На данном этапе, пробоотборные трубки могут храниться при температуре-80 ° C или могут быть использованы немедленно.

2. РНК добыча

  1. Очистите рабочую область путем распыления с 70% изопропиловый спирт и РНКазы обеззараживания решения.
  2. Извлечение RNA должны производиться с использованием соответствующих РНК комплекта (см. Таблицу материалы).
  3. Удаление трубы от-80 ° C и позволяют им оттепель. Добавьте 300 мкл буфера lysis и пипетки вверх и вниз, чтобы разорвать клеточной мембраны.
  4. Добавление равным объемом 100% ультра-чистого этанола.
  5. Хорошо перемешайте и место в разделения столбцов.
  6. Центрифуга между 11 и 16 x g 30 s и удаление потока через.
  7. 400 мкл отмывающего буфера и центрифуги для удаления буфера.
  8. 5 мкл DNAse I с 75 мкл ДНК пищеварения буфер в каждом образце и Инкубируйте 15 мин.
  9. Вымойте образца с 400 мкл буфера приготовительный РНК.
  10. Вымойте 2 x с РНК мыть буфера.
  11. Добавьте нуклеиназы свободной воды в столбец, центрифуги, затем собирают РНК.
  12. Мера общая концентрация РНК с Спектрофотометр UV.

3. RT-ПЦР

  1. До RT-ПЦР синтеза cDNA. После количественного определения концентрации РНК место 1 мкг РНК в 20 мкл конечный объем реакции подготовить cDNA в ПЦР-пробирку. Всегда работает на чистой скамейке.
  2. Все другие необходимые ингредиенты включены в таблице 1.
Ингредиенты Количество (мкл) / sample (20 мкл)
5 X cDNA мастер смесь 4
дНТФ 2
Случайные hexamers 1
RT-усилитель 1
Verso фермент смесь 1
DNase и РНКазы свободной воды Требуемый объем после добавления РНК сделать 20 мкл

Таблица 1: Материалы для синтеза cDNA от образцов РНК. Требуется количество соответствующих ингредиентов для подготовки мастер смесь одного образца для синтеза cDNA.

  1. Инкубировать в тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий температуры: 42 ° C в течение 30 мин; 95 ° C на 2 мин; 4 ° C до сбора образцов.
  2. Сразу использовать в обычных ПЦР или ПЦР, или хранение cDNA при-20 ° C.
  3. Подготовка решений прямого и обратного грунт с DNase/РНКазы бесплатно воды в концентрации 10 мкм от штока грунтовочный раствор.
  4. Подготовьте отдельный мастер смеси для каждого гена быть обнаруженным, согласно количество выборок. Для каждого образца cDNA (ПЦР хорошо) реакции количество готовится согласно таблице 2.
Ингредиенты Количество (мкл) / sample (20 мкл)
Главный микс SYBR 10
Форвард грунт - 10 мкм 2
Обратный грунт - 10 мкм 2
DNase и РНКазы свободной воды 3
Образец cDNA 3

Таблица 2: материалы для количественной ПЦР в реальном времени от образцов cDNA. Требуется количество ингредиентов для подготовки мастер смесь одного образца для ПЦР.

  1. Место каждого образца в соответствующих скважин.
  2. Разработка макета образца для 96 хорошо ПЦР плиты. Для каждого образца и проанализированы гена, выполняют реакции в triplicates, или по крайней мере в дубликаты.
  3. Печать 96 также пластины с оптически ясно клей крышкой.
  4. Быстрый спин пластине позволяют реакционную смесь добраться до нижней части каждой скважины.
  5. Запустите RT-ПЦР согласно следующей тепловой градиент:
    1) 50 ° C на 2 мин
    2) 95 ° C на 2 мин
    3) 95 ° C 15 s
    4) принять чтения
    5) 60 ° C для 1.5 мин
    6) повторите шаг 3 для 39 раз
  6. Запустите следующие тепловой градиент в продолжение выше, чтобы определить кривую плавления, которая указывает на усиление одного продукта.
    7) 65 ° C для 0.31 мин
    8) +0.5 ° C/цикл
    9) плита читать
    10) повторите шаг 8 для 60 раз до достижения 95 ° C
    11) 72 ° C на 2 мин

4. геля агарозы для подтверждения одного амплификации генов

  1. Подготовьте гель агарозы 1% в 1 x TBE буфера.
  2. Добавить бромид ethidium (бромистый этидий) в геля теплой (~ 50 ° C) до достижения окончательного концентрации примерно 0,2-0,5 мкг/мл. Бромистый этидий связывается с ДНК и позволяет ему быть визуализированы под ультрафиолетовым светом в гель тепловизор.
  3. Залейте теплой гель в каппу, поставляется с коробкой электрофореза геля. Прикрепите предоставленный гребень плотно для единообразного скважин.
  4. Разрешить гель для отдыха и остыть до комнатной температуры (RT) ~ 30 мин.
  5. Когда гель затвердевает, место в поле гель гель и лоток.
  6. Заполните поле гель с 1 x TBE буфера до тех пор, пока гель полностью покрыты.
  7. Измерение концентрации ДНК от процесса амплификации PCR с помощью УФ спектрометр.
  8. Возьмите ~ 15 нг ДНК в небольшой ПЦР-пробирку, 5 мкл красителя и добавить необходимое количество воды, свободной от нуклеиназы, для достижения общего объема 15 мкл.
  9. Загрузите лестница ДНК и образцы в колодцы.
  10. Побегите гель на 100 V до тех пор, пока краска линия является примерно 75-80% вниз геля.
    Примечание: Убедитесь, что гель проходит от отрицательных к положительным зарядом.
  11. Удалить гелем и поместите его в гель томографа визуализировать ДНК.

5. клеточный цикл анализа

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в колбе2 см T25 и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч затем урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий в 15 мл стерильные пробирки и маркировать их должным образом.
  4. Центрифугуйте образцы на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС для удаления остаточных средств массовой информации.
  7. Ресуспензируйте и разорвать гранулы путем добавления 200 мкл ледяной ПБС закупорить.
  8. Исправьте клетки путем добавления 2 мл 70% ледяной этанола прикапывают в трубу во время vortexing аккуратно.
  9. Инкубировать трубы для 30 мин на RT и трубы на 4 ° C на 1 час.
  10. Удаление трубы из 4 ° C и центрифуги на 751 x g за 5 мин.
  11. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  12. 500 мкл ПБС пропидий йодидом (50 мкг/мл) и рибонуклеазы (200 мкг/мл)
  13. Инкубируйте 30 мин на RT защищая образцы от света.
  14. Получение данных о проточный цитометр. Используйте вперед против стороны точечной (FSC против SSC), чтобы выбрать основное население клеток, исключая мусора в левом нижнем углу FSC против SSC плотность сюжет и клеток кластеров в верхней Топ-правой стороне участка плотность FSC против SSC.
  15. Анализ данных для выявления клеточных популяций на стадии клеточного цикла с соответствующим программным обеспечением.

6. апоптоз пробирного

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в колбе2 см T25 и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий в 15 мл стерильные пробирки и маркировать их должным образом.
  4. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС для удаления остаточных средств массовой информации.
  7. Разбавить 10 x буфер привязки Annexin V 1 x с ледяной dH2O.
  8. Добавьте 1 mL 1 x буфер Annexin V привязки для каждого образца трубки и нежно ресуспензируйте.
  9. Суспензию клеток из мкл 96 место в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  10. Добавьте 1 мкл конъюгата Annexin V-FITC и 12,5 мкл пропидий йодидом (PI) в пробирку, содержащую суспензию клеток.
  11. Инкубируйте суспензию клеток для 10 мин на льду в темноте.
  12. Добавьте 250 мкл ледяной 1 x Annexin V привязки буфера в каждую пробирку образца для разбавления.
  13. Анализ образцов с проточный цитометр немедленно.

7. белков по microarray антитела клеточного цикла

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в T25 см2 фляги и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий для 15 мл пробирок и маркировать их соответствующим образом.
  4. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС.
  7. 150 мкл буфера lysis дополнена ингибиторов протеазы. Накапайте вверх и вниз осторожно, чтобы нарушить клеточные мембраны.
  8. Для предотвращения любых помех буфера lysis, выполняют буфера обмена заменить маркировки буфера, используя производителя растворителей обмена столбцы буфера lysis.
  9. Количественное определение общего белка с BCA assay.
  10. Возьмите 70 мкг белка образца и добавление меток буфера для достижения окончательный объем 75 мкл.
  11. Добавьте 100 мкл диметилформамида (DMF) 1 мг, биотина реагента (биотина/DMF).
  12. 3 мкл ДМФ биотина для каждого белка образец (биотинилированным белка) и проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  13. Мкл 35 стоп реагента и смешать с vortexing.
  14. Проинкубируйте образцы в РТ за 30 мин.
  15. Удалите microarray слайды из холодильника, так что они теплые РТ за 1 час перед использованием.
  16. Выполнить блокировку для неспецифической привязки инкубировать слайды с 3% молока и сухого раствора (в блокировки реагента, предоставленный производителем) в чашку Петри с непрерывной тряски по 45 мин на RT.
  17. Вымойте слайды с водой2O ddH (если не указано иное, стирки происходит с ddH2O).
  18. Повторите шаг Стиральная ~ 10 x полностью удалить блокирующий решение от поверхности слайда. Это имеет важное значение для достижения единообразного и низкой фон.
  19. Удалить излишки воды с поверхности слайда и переходите к следующему шагу, не давая слайды сухой.
  20. Готовят раствор муфта, растворяя 3% сухое молоко в муфта реагента.
  21. Добавьте 6 мл раствора сцепления и полное количество образец протеина ранее подготовленных биотинилированным из шага 7.12.
  22. Место один слайд в одной скважиной камеры сцепления, предоставляемыми поставщиком и добавить ~ 6 мл белка, муфты микс на него.
    Примечание: Убедитесь, что слайд полностью погружен в сцепления раствора смеси белков.
  23. Обложка камеры сцепления и проинкубируйте втечение 2 ч на RT с непрерывной агитации в орбитальный шейкер.
  24. Перенести слайды в чашку Петри и добавьте 30 мл 1 x отмывающего буфера. Место в орбитальный шейкер чашку Петри, трясти за 10 мин и отменить решение.
  25. Повторите шаг 7.24 2 x.
  26. Промойте слайды с водой2O ddH широко, как описано в шагах 7.17 и 7.18 и переходите к следующему шагу немедленно, чтобы избежать высыхания.
  27. 30 мкл Cy3-стрептавидина (0.5 мг/мл), 30 мл буфера обнаружения.
  28. Слайд в чашку Петри и добавьте 30 мл обнаружения буфер, содержащий Cy3-стрептавидина.
  29. Инкубируйте в орбитальный шейкер для 20 мин с непрерывной тряски защищенный от света.
    Примечание: Cy-3 является Люминесцентную краску. Накрыть алюминиевой фольгой или работают в темных условиях для поддержания интенсивности флуоресценции.
  30. Выполните шаги 7.24-7.26 и позволяют на слайд, чтобы высушить с помощью нежный поток воздуха или размещение слайд в 50 мл Конические трубки и центрифуги на 1300 x g 5-10 мин.
  31. Поместите слайд слайд владельца и накрыть алюминиевой фольгой.
  32. Сканирование слайдов в microarray сканер с соответствующей длины волны возбуждения и выбросов. В случае Cy3, пик волны возбуждения находится в ~ 550 Нм и выбросов пика ~ 570 Нм.
  33. Анализ данных (см. Таблицу материалы) для используемого программного обеспечения).

8. РНК последовательности

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в T25 см2 фляги и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий для 15 мл пробирок и маркировать их соответствующим образом.
  4. Извлечь РНК согласно разделу 2, шаги 1-6.
  5. Проверьте качество РНК, а также концентрации с bioanalyzer. Целостность РНК Оценка (Рин) выше восемь и соответствующих гистограммах необходимы для подтверждения качества РНК.
  6. От всего РНК используйте ~ 2 мкг образца для РНК последовательности (РНК от всего РНК)
  7. Последовательность с помощью следующего поколения секвенсор11.
  8. Запустите качество отделки и карта с геном ссылку из FASTQ файлов, созданных из РНК последовательности машина11.
  9. Загружать файлы FASTQ и сырые чтения данных игр в генных банков, следуя инструкциям из < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> веб-сайт.
    Примечание: См. присоединение SRP133420 для предыдущих результатов.

9. трубка формирования пробирного

  1. Оценить потенциал ангиогенных Мирна transfected человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) 36 ч после трансфекции, как описано в разделе 1, шаги 1-5, с использованием клеток HUVEC вместо A549 клетки.
  2. Голодать HUVECs с M199 голода СМИ за 4 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  3. Удаление уменьшение фактора роста базальной мембраны матрица от-80 ° C и хранить при 4 ° C на ночь, позволяя постепенного таяния во избежание формирования пузыря и полимеризации.
  4. Тщательно и медленно пальто скважин 96 также пластины с 0,04 мл снижения фактора роста базальной мембраны матрицы, избегая формирования пузыря. Выполните всю процедуру под капотом ламинарного потока.
  5. Заполните соседних скважин 96 также пластины с 0,1 мл PBS для поддержания влажности и сохранения температуры.
  6. Инкубируйте 96 хорошо пластины при 37 ° C для по крайней мере 20 минут, чтобы достичь полимеризации экстракта базальной мембраны. Не инкубировать для более чем 1 час.
  7. Trypsinize transfected HUVECs от каждой группы и Ресуспензируйте в средних M199 в концентрации 1 х 105 кл/мл.
  8. Добавьте 0,1 мл каждого суспензию клеток к скважинам, содержащий полимеризованной базальной мембраны матрицы в 96 хорошо пластины.
  9. Инкубируйте 96 хорошо пластины при 37 ° C с 5% CO2 , в то время как подготовка факторов роста происходит. Подготовка факторов роста также происходит под капотом ламинарного потока.
  10. Воссоздания факторы роста (VEGF) в 2 x окончательного желаемой концентрации (4 нг/мл концентрация для 2 конечная концентрация нг/мл) и добавить 0,1 мл, содержащие фактор роста средних голода M199 поверх 0,1 мл M199 голода среды с клетками. Для не лечение VEGF скважин добавьте 0,1 мл среды голода M199 поверх 0,1 мл M199 голода среды с клетками.
  11. Инкубируйте 96 хорошо пластина для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  12. В конце инкубационного периода получите изображения каждой скважины с 4 крат, используя микроскоп brightfield, связанных с цифровой камерой.
  13. Обработка изображений с программным обеспечением, оснащенных подключаемого модуля «Анализатор ангиогенеза»19. Используйте три параметра, количество узлов, количество узлов и Длина общая Росток, чтобы сравнить эффекты обращения Мирна по ангиогенез.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ выражения гена с помощью RT-ПЦР и гель-электрофорез

Дифференциальный гена анализ выражения с помощью RT-ПЦР продемонстрировал значительные Даунрегуляция целевых генов, CDK1, CDK4 и CDK6. CDK1 и CDK4/6 было показано для G2/M и переходы G1/S, соответственно. Проведенный анализ позволил прямое сравнение между отдельными Мирс и комбинаторные мир деятельности. Использование малых интерферирующих РНК схватка с transfecting агент разрешено оценки любого вмешательства из процедуры на обнаружен ген Даунрегуляция, который был минимальным. Данные были статистически проанализированы с использованием двух Стьюдента t-тест, иp < 0,05 считался статистически значимой (рис. 1). До ПЦР, последовательностей праймера были оценены, используя праймер ДОМЕННАЯ < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> для одного амплификации генов. Это было также подтверждено анализа продуктов амплификации через гель-электрофорез. Для каждого анализируемого гена (рис. 1 d), подтверждающий одного амплификации генов был обнаружен однодиапазонный ДНК продукции. CDK6, находился один амплификации подтверждено (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1 : Относительное выражение генов CDK1, CDK4 и CDK6 как обнаружены ПЦР и анализ электрофореза геля продуктов амплификации ДНК. Мир-143 и мир-506 transfection клетки A549 индуцированных Даунрегуляция CDK1 (A), CDK4 (B) и CDK6 (C) Даунрегуляция 24 h и 48 ч после transfection. Были оценены продуктов амплификации ДНК электрофорез геля (D) для подтверждения одного амплификации генов. GAPDH был использован как ссылка ген. Среднее ± SEM, * p < 0,05; ** p < 0,01, двустороннюю t-теста. Эта цифра была изменена с Hossian et al.11пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Клеточный цикл распределения с помощью проточной цитометрии

Пропидий йодидом пятнать клеточных нуклеиновых кислот – стандартный метод для визуализации популяции клеток в разных стадиях клеточного цикла, количественный содержание ДНК. Комбинаторного лечения мир-143 и мир-506 остановить клеточный цикл на двух контрольно-пропускных пунктах, G0/G1 и G2/M, как указано через гранулярных анализа потока (рис. 2).

Figure 2
Рисунок 2 : Transfected клеточного цикла анализа A549 клеток с мир-143 и мир-506 в 24 ч и 48 ч после transfection. Проценты популяций клеток для каждого цикла клетки были определены проточной цитометрии и ДНК связывающих пропидий йодидом. Среднее ± SEM. Эта цифра перепечатана с изменениями от Hossian et al.11пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Annexin V/PI апоптоз пробирного подачей cytometry

После transfection клеток A549 с мир-143 и мир-506 апоптоз assay проводилось с использованием Annexin V и PI окрашивания и потока цитометрии. Было определено, что комбинаторного лечения индуцированных значительно apoptosis в 24 h и 48 h timepoints. По сравнению с негативный контроль, % изменение apoptotic клеток определяли как определяется Annexin V позитивные клетки, из-за лечения мир, представленные на рисунке 3.

Figure 3
Рисунок 3 : Примерный анализ apoptotic клеток. Перерезка с мир-143 и мир-506 увеличился процент Annexin V A549 клеток. Среднее ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, двустороннюю t-теста. Эта цифра была изменена с Hossian et al.11пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Клеточный цикл антитело microarray

Механистический ответы на обращения могут быть определены путем изменения выражения протеина. Дифференциальные выражение оценивалась на уровне белок генов, связанных с путь клеточного цикла, используя путь конкретных антитело microarray. Белка экстракты использовались для анализа от клеток transfected с мир-143/506. Анализ microarray дна, разрешено для полуколичественного анализа ~ 60 клеточного цикла связанных белков, с шестью реплицирует для каждой конкретной антитела. Такой подход позволяет более широкой перспективе механистический поведения в рамках конкретного пути, выявление молекулярных целей для дальнейшей оценки и проведение анализа на уровне столб-поступательные. Из-за принципа полуколичественного метода любые результаты на конкретные гены необходимо подтвердить через западный blotting. Ориентировочно в этом анализе, было обнаружено снижение экспрессию белков, связанные с прогрессированием клеточного цикла. Это включает целевые CDK1 и CDK4 на 24 h и 48 ч после трансфекции (рис. 4A), как определяется ПЦР.

Figure 4
Рисунок 4 : Регуляции генов как обнаружено microarray дна и RNA последовательности анализа. (A) Heatmap клеточного цикла путь выражения гена как определяется Анализ microarray протеина выдержки из A549 клеток transfected с мир-143 и мир-506, 24 h и 48 ч после transfection. (B) раз изменения клеточного цикла путь выражения гена из A549 клеток transfected с мир-143 и мир-506 на 24 ч после трансфекции как определяется РНК последовательности. (C) путь активность как анализируемой путь анализа программного обеспечения от данных, полученных из РНК последовательности. Эта цифра была изменена с Hossian et al. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

РНК последовательности и путь анализ с использованием путь анализа программного обеспечения

Секвенирование нового поколения точно анализирует экспрессии генов на уровне РНК. Этот метод позволяет выявить несколько генных изменений через одного анализа (в настоящем Протоколе, анализ обнаружил выражение > 18 000 генов). Из-за большого числа выявленных генов Биоинформатика анализ был использован для эффективного определения пути поведения (рис. 4В). Затем используется программное обеспечение (см. Таблицу материалы) для прогнозирования G1 (Ы) и G2/М этап арестов и Даунрегуляция S фаза посвящения (рис. 4 c). Кроме того РНК последовательности результаты можно сравнить с данным ПЦР. В этом исследовании, РНК последовательности подтвердила выводы из анализа ПЦР, указывающее Даунрегуляция CDK1 (48%, p < 0,001, ФДР < 0,001), CDK4 (68%, p < 0,001, ФДР < 0,001) и CDK6 (71%, < 0,001, ФДР < 0,001) из-за комбинаторные мир-143 и мир-506 активность. Статистический анализ была исполнена Эджер программное обеспечение, используемое для вычисления выражения относительной гена, вычисление значений p , используя отрицательное биномиальное20,21. Биоинформатика анализ может выполняться для функциональной оценки деятельности Мирна и прогнозирования возможных молекулярных целей, как показано на рисунке 5.

Figure 5
Рисунок 5 : Иллюстративный пути и механистические анализ как представленные путь анализа aoftware. От A549 клеток transfected с мир-143 и мир-506, 24 ч после трансфекции, используя путь анализа программного обеспечения и выявленных канонические пути с низким (A) или высоких активации (B) Оценка была проанализирована РНК последовательности данных. Программное обеспечение также предоставляет предсказал функции (C) и потенциальных вверх регуляторы / (D). Эта цифра перепечатана из Hossian et al. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пробки в эндотелия формирования пробирного

В пробирке эндотелиальной трубки формирования широко используется для изучения ангиогенеза и является надежным, автоматизированных и количественному22. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) — известный ангиогенных факторов роста23,24 и эндотелиальных трубки формирования промоутер. В этом исследовании было определено, что комбинаторного лечения мир-143 и мир-506 аннулирует VEGF-индуцированной ангиогенеза. На рисунке 6представлены ориентировочные изображения трубки формирования и эффекты лечения.

Figure 6
Рисунок 6 : Transfected представитель изображения эндотелиальной ростки VEGF-лечение против-лечение HUVECs с схватка Мирна, Мирна-143, Мирна-506 или их сочетания. Фотографии были получены под микроскопом brightfield оснащен цифровой камерой под 4 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

интерферирующим могут действовать в качестве целевой терапии для лечения рака, признавая dysregulation уровни выражения в больной против нормальных тканей. Это исследование стремились определить адаптивной, что потенциально остановить прогрессирование клеточного цикла в течение нескольких этапов. Было определено, что мир-143 и мир-506 остановить клеточный цикл раковых клеток, и представленных протоколов, направленных понять деятельность этого лечения комбинаторной Мирна.

Описаны методики обеспечивают общие понимания на функцию адаптивной. Проблемы изучения адаптивной связано с их способностью целевой несколько генов и таким образом повлиять на несколько путей. Анализ описанных ПЦР позволяет выявить экспрессии определенных генов интерес, если конкретные цели определены до начала лечения. Например основное внимание здесь было выражение CDK1 и CDK4/6 и клеточного цикла.

Таким образом анализ клеточного цикла, протоколу пропидий йодидом и потока цитометрии является надежный подход для выявления изменений в клеточных популяций согласно их стадии клеточного цикла. Метод основан на пропорционального увеличения сигнала флуоресценции, PI, который связывается с ДНК, относящиеся к стадии клеточного цикла. Кратко клеток в S фазе синтеза ДНК, вызывая выше сигналы, чем клетки в стадии G0/G1 и клетки в G2 фазе одинаковыми их ДНК, производства наиболее интенсивно сигнала.

Накапливая доказательства указывает подключение повреждение клеточного цикла и вызывает апоптоз25. Метод потока цитометрии с помощью Annexin VI/PI неизменно был использован для идентификации индуцированного апоптоза клеток от химиотерапии. Ориентировочно сильный апоптотической реакции была определена из-за терапии комбинаторной Мирна, который был более мощным по сравнению с отдельными адаптивной.

Полуколичественного протеина microarray антитела является чувствительным и надежный метод для определения белков выражение изменений касающихся конкретных биологических реакций26,27. Этот протокол используется путь конкретных антитело microarray клеточного цикла, который в ~ 60 генов между обработанных и необработанных клетки обнаружены изменения выражения. Осторожность требуется во время стирки шаги для обеспечения тщательного выполнения процесса и свести к минимуму фонового сигнала. Кроме того слайды не должен становиться сухой до завершения эксперимента.

В отличие от РНК последовательности обеспечивает анализ выражения количественный ген нескольких генов, на уровне после транскрипции. Значительно большое количество анализируемых генов (> 18000 для РНК seq против 60 для microarray) позволяет для одновременного анализа нескольких путей и молекулярных целей и с повышенной точностью. Такой широкий анализ имеет важное значение, как один Мирна можно связать и целевых различных мРНК. Напротив путь анализ большого числа генов dysregulations изначально сложно. Например, хотя РНК последовательности подтвердили наши ПЦР данные о CDK1 и CDK4/6 Даунрегуляция вследствие обращения Мирна, анализ также представили данные о тысячи генов, которые также были в вниз- или регулируется вверх. Для предоставления контекста для таких многочисленных гена dysregulations, путь анализа программного обеспечения был использован для определения общего воздействия на различные пути и клеточных функций лечения. Ориентировочно программное обеспечение для активации (положительный z счёт) или инактивация (отрицательный z счёт) конкретных функций или пути, а также статистическую значимость анализа (рис. 5)28баллов представитель.

В заключение изучение деятельности Мирна является сложной процедурой. Присущие интерферирующим способность влиять на несколько генов требует использования нескольких сложных и сложных аналитических методов для выявления потенциальной деятельности. Не удивительно необходима дальнейшая работа в полной мере понять деятельность мир-143 и мир-506 в рак легких.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы хотели бы признать Джон Caskey государственного университета Луизианы за его помощь на пути анализа данных последовательности РНК, и университета Техаса Юго-медицинский центр, МакДермотт центр следующего поколения Core последовательности для выполнение анализа данных и последовательности РНК. Это исследование было поддержано фармацевтический колледж, Университет штата Луизиана Монро начальное финансирование и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) через Национальный институт общей медицинской науки грантов 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 P20-15S1.

Acknowledgments

Отсутствие конфликта интересов объявляются.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

Исследования рака выпуск 145 transfection Мирна рак легких клеточного цикла апоптоз ангиогенез РНК последовательности

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Анализ комбинаторной Мирна процедуры регулируют клеточный цикл и ангиогенез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter