Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analys av kombinatoriska miRNA behandlingar för att reglera cellcykeln och angiogenes

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA therapeutics har betydande potential i regleringen cancer progression. Visat här används analytiska metoder för att identifiera aktiviteten av en kombinatorisk miRNA behandling i att stoppa cellcykeln och angiogenes.

Abstract

Lungcancer (LC) är den vanligaste orsaken till cancer-relaterade dödsfall i världen. Liknar andra cancerceller, en grundläggande egenskap hos LC celler är oreglerad proliferation och celldelning. Hämning av spridning genom att stoppa cellcykelns förlopp har visat sig vara en lovande strategi för cancerbehandling, inklusive LC.

miRNA therapeutics har dykt upp som viktiga post-transcriptional gen regulatorer och studeras allt för användning i behandling av cancer. I senaste arbete utnyttjade vi två microRNA, miR-143 och miR-506, att reglera cellcykelns förlopp. A549 Icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cancerceller var transfekterade, gen uttryck förändringar analyserades och apoptotiska aktivitet på grund av behandlingen var slutligen analyseras. Nedreglering av cyklin-beroende kinaser (CDKs) upptäcktes (dvs. CDK1, CDK4 och CDK6), och cellen cyklar stoppas på de G1/S och G2/M fasövergångar. Väg analys indikerar potentiell antiangiogenetisk aktivitet av behandlingen, som begåvar metoden med mångfacetterad verksamhet. Här beskrivs de metoder som används för att identifiera miRNA verksamhet angående cellcykeln hämning, induktion av apoptos, och effekterna av behandling på endotelceller genom hämning av angiogenes. Förhoppningen är att de metoder som presenteras här kommer att stödja framtida forskning på miRNA therapeutics och motsvarande aktivitet och att den representativa uppgifter kommer att vägleda andra forskare under experimentella analyser.

Introduction

Cellcykeln är en kombination av flera rättsliga händelser som Tillåt duplicering av DNA och cell spridning genom mitotiska process1. Cyklin-beroende kinaser (CDKs) reglera och främja den cellcykeln2. Bland dem har den mitotiska CDK (CDK1) och interphase CDKs (CDK2, CDK4 och CDK6) en nyckelroll i cellcykeln progression3. Retinoblastom protein (Rb) är fosforyleras av den CDK4/CDK6 komplexa att tillåta cellcykeln progression4, och CDK1 aktiveringen är avgörande för framgångsrik cell division5. Talrika CDK-hämmare har utvecklats och utvärderats i kliniska studier under de senaste decennierna, som anger risken för att rikta CDKs i cancerbehandling. I själva verket tre CDK-hämmare har godkänts för behandling av bröstcancer nyligen6,7,8,9,10. Således, CDKs, och i synnerhet CDK1 och CDK4/6, är av stort intresse att reglera cancer cell progression.

microRNA (miRs) är små, icke-kodande RNAs och post-transcriptional regulatorer av genuttryck, reglera cirka 30% av alla mänskliga gener11. Deras verksamhet bygger på translationell förtryck eller nedbrytning av messenger RNA (mRNA)12. Belysande av deras biologiska betydelse, mer än 5.000 microRNA har identifierats och en enda miRNA molekyl kan reglera flera gener11,13. Viktigare, har miRNA uttryck associerats med olika sjukdomar och sjukdomar status, inklusive cancer13. I själva verket microRNA har karaktäriserats som onkogena eller tumör dämpning, att vara kapabel att antingen främja eller hämma tumör utveckling och progression14,15. Det relativa uttrycket för microRNA i sjuk vävnad kan reglera sjukdomsprogression; Således har exogen leverans av microRNA terapeutisk potential.

Lungcancer är den ledande orsaken till dödsfall och större än 60% av alla lung maligniteter är icke-small cell lung cancer16,17, med en 5-års överlevnad på mindre än 20%18. Användning av miR-143-3 p och miR-506-3 p utvärderades nyligen för att rikta de cell cyklerna i lung cancer celler11. miR-143 och miR-506 har sekvenser som är komplementaritet till CDK1 och CDK4/CDK6, och effekterna av dessa två miRs på A549 celler analyserades. De experimentella detaljerna presenteras och diskuteras i detta dokument. Genuttryck, cellcykelprogression och apoptos utvärderades med hjälp av olika experimentella designer och tidpunkter efter transfection. Vi använde realtid kvantitativ PCR (RT-qPCR) metoder tillsammans med microarray analys för att mäta specifika genuttryck och nästa generations RNA-sekvensering användes för att fastställa globala gen Dysreglering11. Den senare metoden identifierar det relativa överflödet av varje genens transkription med hög känslighet och reproducerbarhet, medan tusentals gener kan analyseras från ett enda experimentell analys. Dessutom apoptotiska analys på grund av miRNA behandling utfördes och beskrivs här. Bioinformatik kompletterat den väg analysen. Presenteras här är protokoll som används för analys av den terapeutiska potentialen av den kombinatoriska miR-143 och miR-506.

Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att identifiera effekterna av microRNA i celler, med fokus på cellcykeln. Mängden tekniker presenteras här sträcker sig från gen uttryck analys Föröversättning (med qPCR) att utarbeta och nya tekniker för gen analys på proteinnivå, såsom microarray analys. Förhoppningen är att detta betänkande är till hjälp för forskare som är intresserade av att arbeta med microRNA. Dessutom presenteras metodik för flöde flödescytometrisk analys av cellcykeln och apoptos celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. miR-143 och miR-506 transfection

Varning: Använd latex handskar, skyddsglasögon och laboratorierock samtidigt utför beskrivna experimenten. När det behövs, Använd biosäkerhet skåpet med skåp fläkten på, utan blockerar luftvägarna eller störa det laminärt luftflödet. Alltid ställa glasfönstret skydda till lämplig höjd, som beskrivs av tillverkaren.

  1. Utsäde NSCLC A549 celler i en T25 cm2 kolv/6/96 väl plåt i DMEM/F12K media kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (kultur media) i vävnadsodling huva och inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2 i en vävnadskultur inkubator.
  2. Avbryta miR-143 eller miR-506 härmar eller förvränga siRNA med transfecting agent (2,4 µg Mir blandades med 14 µL av transfecting agent, se Tabell för material) i 500 µL transfection media och 1,5 mL serum och antibiotika-fri DMEM/F12K media på en slutliga miRNA koncentrationen av 100 nM. miRNA belopp kan kräva optimering på olika celler och koncentrationer. Lämpliga metoder inkluderar transfection celler med ökande koncentrationer av miRNA (dvs. 50-200 nM) och utvärdering av uttrycket nedreglering av gener av intresse.
  3. Ta bort kultur media från kolven/plattan och tvätta en gång med 1 x PBS.
  4. Tillsätt miRNA/scramble-transfecting agent komplex och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 för 6 h (kolv storlek definierar volymen tillsatt inkubation).
  5. Ersätta media med 4 mL odlingssubstrat och inkubera cellerna för 24 h och/eller 48 h.
  6. Skörda transfekterade cellerna genom trypsinization, genom att tillsätta 1 mL av trypsin-EDTA i varje T25 cm2 kolv, Inkubera i 5-10 min vid 37 ° C och tillsätt 3 mL odlingssubstrat att skörda cellerna. Placera innehållet i varje kolv i en separat, märkt 15 mL tub. Arbeta i en vävnadskultur huva.
  7. Centrifugera vid 751 x g i 5 min och avlägsna supernatanten.
    Obs: Krävs försiktighet under supernatant borttagning, eftersom agitation av röret kan orsaka förlust av celler.
  8. Tillsätt 2 mL av 1 x PBS och Centrifugera under 5 minuter på 751 x g.
  9. Upprepa steg 7 och 8 en gång för att avlägsna alla spår av media och supernatanten.
    Obs: I detta skede provrör kan lagras vid-80 ° C eller kan användas omedelbart.

2. RNA-extraktion

  1. Ren arbetsområdet genom besprutning med 70% isopropylalkohol och RNAse sanering lösning.
  2. RNA-extraktion bör utföras med en lämplig RNA kit (se Tabell för material).
  3. Ta bort rören från-80 ° C och låt dem Tina. Tillsätt 300 μl lyseringsbuffert och pipett upp och ner att bryta cellmembranet.
  4. Tillsätt en motsvarande volym av 100% ultra ren etanol.
  5. Blanda väl och Lägg i separera kolumn.
  6. Centrifugera mellan 11 och 16 x g för 30 s och ta bort genomflöde.
  7. Tillsätt 400 µL buffert och centrifugera bort bufferten.
  8. Tillsätt 5 µL av DNAS jag med 75 µL av DNA matsmältningen buffra i varje prov och inkubera i 15 min.
  9. Tvätta provet med 400 µL av RNA prep buffert.
  10. Tvätta 2 x med RNA tvättbuffert.
  11. Tillsätt nuclease-fritt vatten till kolumnen, centrifug, sedan samla RNA.
  12. Mäta total RNA-koncentrationen med en UV-spektrofotometer.

3. RT-qPCR

  1. Innan RT-qPCR, syntetisera cDNA. Efter RNA koncentration kvantifiering, placera 1 µg av RNA i en 20 µL slutlig volym av reaktion att förbereda cDNA i en PCR-röret. Arbeta alltid på en ren bänk.
  2. Alla andra nödvändiga ingredienser ingår i tabell 1.
Ingredienser Kvantitet (µL) / urval (20 µL)
5 X cDNA Master mix 4
dNTP 2
Slumpmässigt hexamers 1
RT enhancer 1
Verso enzym mix 1
DNAS och RNase gratis vatten Krävs qty efter tillägger RNA för att göra 20 µL

Tabell 1: Material för cDNA syntes från RNA prover. Krävs mängder respektive ingredienser att förbereda en master mix för ett prov för cDNA syntes.

  1. Inkubera i en termocykel med följande temperatur villkor: 42 ° C i 30 min; 95 ° C under 2 min; 4 ° C tills provtagning.
  2. Använd omedelbart i vanlig PCR eller qPCR, eller förvara cDNA vid-20 ° C.
  3. Förbereda framåt och bakåt primer lösningar med DNAS/RNase-fritt vatten vid en koncentration på 10 µM från lager primer lösning.
  4. Bered separata master mixar för varje gen att upptäckas, enligt antalet prover. För varje cDNA prov (qPCR väl), är antalet reaktion upprättad enligt tabell 2.
Ingredienser Kvantitet (µL) / urval (20 µL)
SYBR master mix 10
Forward Primer - 10 μM 2
Reverse Primer - 10 μM 2
DNAS och RNase gratis vatten 3
cDNA prov 3

Tabell 2: material för kvantitativ realtids-PCR från cDNA prover. Krävs mängden ingredienser att förbereda en master mix för ett prov för qPCR.

  1. Placera varje prov i respektive brunnarna.
  2. Utforma layouten prov för 96 väl qPCR plattan. För varje prov och analyserad gen, utföra reaktionen i exemplar, eller åtminstone i dubbletter.
  3. Försegla 96 väl plattan med en optiskt klar självhäftande täcker.
  4. Quick-spin plattan att tillåta reaktionsblandningen att nå botten av varje brunn.
  5. Kör RT-qPCR enligt följande termisk gradient:
    (1) 50 ° C i 2 min
    (2) 95 ° C under 2 min
    (3) 95 ° C under 15 s
    (4) ta behandlingen
    (5) 60 ° C för 1,5 min
    (6) upprepa steg 3 för 39 gånger
  6. Kör följande termisk gradient i fortsättning av ovanstående att bestämma smältande kurva som anger enda produkt förstärkningen.
    (7) 65 ° C för 0,31 min
    8) +0.5 ° C/cykel
    9) plattan Läs
    10) upprepa steg 8 för 60 gånger tills de når 95 ° C
    11) 72 ° C under 2 min

4. agaros gel-elektrofores bekräfta enda gen förstärkning

  1. Bered 1% agarosgel i 1 x TBE buffert.
  2. Lägg till etidiumbromid (EtBr) i varmt (~ 50 ° C) gel tills att uppnå en slutlig koncentration på cirka 0,2-0,5 µg/mL. EtBR binder med DNA och gör det möjligt att visualiseras under UV-ljus i en gel imager.
  3. Häll varm gel i en gel bricka medföljer en elektrofores gel låda. Fäst den medföljande kammen tätt för enhetlig brunnar.
  4. Låt gelen till vila och svalna till rumstemperatur (RT) för ~ 30 min.
  5. När gelen är stelnat, placera gel och fack i rutan gel.
  6. Fyll rutan gel med 1 x TBE buffert tills gelen är helt täckt.
  7. Mätning av koncentrationen av DNA från PCR-amplifiering process med hjälp av en UV-spektrometer.
  8. Ta ~ 15 ng DNA i ett litet PCR-rör, tillsätt 5 µL av färgämne, och lägga till det begärda beloppet nuclease-fritt vatten för att uppnå en total volym på 15 µL.
  9. Ladda DNA stege och prover i brunnar.
  10. Kör gelen vid 100 V tills raden färgämne är cirka 75-80% ner gelen.
    Obs: Kontrollera gelen går från negativ till positiv laddning.
  11. Gelen och placera den i gel kameran att visualisera DNA.

5. cellcykeln analys

  1. Utsäde 5 x 105 celler för varje prov i en T25 cm2 kolv och utföra en transfection enligt protokollet beskrivs i avsnitt 1, steg 1-5.
  2. Efter 24 och 48 timmar, sedan skörda cellerna genom trypsinization.
  3. Överföra cellsuspensioner till 15 mL sterilt rör och märka dem ordentligt.
  4. Centrifugera proverna vid 751 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
  5. Tillsätt 2 mL av iskall 1 x PBS, vortex, och centrifugera vid 751 x g för 5 min. avlägsna supernatanten.
  6. Upprepa steget tvätt med 1 x PBS ta bort kvarvarande media.
  7. Omsuspendera och bryta pelleten genom att lägga till 200 µL iskall 1 x PBS av pipettering.
  8. Fixa cellerna genom att lägga till 2 mL 70% iskall etanol droppvis röret medan vortexa försiktigt.
  9. Inkubera rören i 30 min på RT och placera rören vid 4 ° C för 1 h.
  10. Ta bort rören från 4 ° C och centrifugera vid 751 x g i 5 min.
  11. Tillsätt 2 mL av iskall 1 x PBS, vortex, och centrifugera vid 751 x g för 5 min. avlägsna supernatanten.
  12. Tillsätt 500 µL av 1 x PBS med propidium jodid (50 µg/mL) och ribonunkleas en (200 µg/mL)
  13. Inkubera i 30 min på RT samtidigt skydda proverna från ljus.
  14. Uppkopplingstyp på flödescytometer. Använd framåt vs. side scatter (FSC vs. SSC) välja den största befolkningen av celler, exklusive skräp på det nedre vänstra hörnet av FSC vs. SSC densitet tomt och cell klustren längst upp till toppen-FSC vs. SSC densitet tomten till höger.
  15. Analysera data för att identifiera cellpopulationer per cell cycle scenen med lämplig programvara.

6. apoptos assay

  1. Utsäde 5 x 105 celler för varje prov i en T25 cm2 kolv och utföra en transfection enligt protokollet beskrivs i avsnitt 1, steg 1-5.
  2. Efter 24 och 48 h, skörda cellerna genom trypsinization.
  3. Överföra cellsuspensioner till 15 mL sterilt rör och märka dem ordentligt.
  4. Centrifugera vid 751 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
  5. Tillsätt 2 mL av iskall 1 x PBS, vortex, och centrifugera vid 751 x g för 5 min. avlägsna supernatanten.
  6. Upprepa steget tvätt med 1 x PBS ta bort kvarvarande media.
  7. Späd 10 x Annexin V bindande buffert till 1 x med iskall dH2O.
  8. Tillsätt 1 mL 1 x Annexin V bindande buffert till varje prov tub och resuspendera försiktigt.
  9. Plats 96 µL i cellsuspension i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  10. Tillsätt 1 µL av Annexin V-FITC-konjugat och 12,5 µL propidium jodid (PI) till röret som innehåller cellsuspension.
  11. Inkubera cellsuspensionen i 10 min på is i mörkret.
  12. Tillsätt 250 µL iskall 1 x Annexin V bindande buffert till varje prov tub att späda.
  13. Analysera prover med flödescytometer omedelbart.

7. protein uttryck av antikropp cellcykeln microarray

  1. Utsäde 5 x 105 celler för varje prov i T25 cm2 kolvar och utföra en transfection enligt protokollet beskrivs i avsnitt 1, steg 1-5.
  2. Efter 24 och 48 h, skörda celler av trypsinization.
  3. Överföra cellsuspensioner till 15 mL rör och märka dem med detta.
  4. Centrifugera vid 751 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
  5. Tillsätt 2 mL av iskall 1 x PBS, vortex och centrifugera vid 751 x g för 5 min. avlägsna supernatanten.
  6. Upprepa steget tvätt med 1 x PBS.
  7. Tillsätt 150 µL lyseringsbuffert kompletteras med proteashämmare. Pipettera upp och ner försiktigt att störa cellmembranen.
  8. För att förhindra eventuella lysis buffert störningar, utföra en buffert exchange om du vill ersätta lyseringsbuffert med märkning buffert, med tillverkarens lösningsmedel utbyte av kolumner.
  9. Kvantifiera det totala proteinet med en BCA-analysen.
  10. Ta 70 µg av protein prov och Lägg märkning buffert för att uppnå en slutlig volym av 75 µL.
  11. Tillsätt 100 µL av dimetylformamid (DMF) 1 mg biotin reagens (biotin/DMF).
  12. Lägg 3 µL av den biotin/DMF till varje protein prov (biotinylerade protein prov) och inkubera i 2 h på RT.
  13. Tillsätt 35 µL av stop reagens och mix av vortexa.
  14. Inkubera prover på RT i 30 min.
  15. Ta bort microarray bilderna ur kylskåpet så att de varma RT för 1 h före användning.
  16. Utföra blockering för icke-specifik bindning av ruvning bilderna med 3% torr mjölk lösning (i blockerande reagens tillhandahålls av tillverkaren) i en petriskål med ständig skakning för 45 min på RT.
  17. Tvätta i bilderna med ddH2O vatten (om inte annat anges, tvätt sker med ddH2O).
  18. Upprepa tvätt ~ 10 x att helt ta bort blockering lösningen från slide ytor. Detta är viktigt att uppnå en enhetlig och låg bakgrund.
  19. Ta bort överdriven vatten från slide ytor och fortsätta till nästa steg utan att låta bilderna torka.
  20. Förbered koppling lösning genom att lösa 3% torr mjölk i en koppling reagens.
  21. Tillsätt 6 mL koppling lösningen och att hela kvantiteten av tidigare beredda biotinylerade protein provet från steg 7.12.
  22. Plats en bild i en brunn på koppling avdelningen som tillhandahålls av leverantören och Lägg till ~ 6 mL protein koppling mix till den.
    Anmärkning: Se till att bilden är helt nedsänkt i protein koppling mix lösning.
  23. Täcka koppling kammaren och inkubera i 2 h på RT med kontinuerlig agitation i orbitalskak.
  24. Överföra bilder till en petriskål och tillsätt 30 mL 1 x tvätt buffert. Placera petriskål i orbital shaker, skaka i ca 10 min och kassera lösningen.
  25. Upprepa steg 7.24 2 x.
  26. Skölj glasen med ddH2O vatten i stor utsträckning enligt beskrivningen i steg 7.17 och 7.18 och gå vidare till nästa steg omedelbart för att undvika uttorkning.
  27. Tillsätt 30 µL av Cy3-streptividin (0,5 mg/mL) i 30 mL upptäckt buffert.
  28. Placera bilden i en petriskål och tillsätt 30 mL upptäckt buffert innehållande Cy3-streptividin.
  29. Inkubera i orbitalskak i 20 min under ständig skakning skyddat från ljus.
    Obs: Cy-3 är ett fluorescerande färgämne. Täck med aluminiumfolie eller verka under mörka förhållanden att upprätthålla fluorescensintensiteten.
  30. Utför steg 7.24-7,26 och låta bilden att torka med en svag luftström eller placera bilden i en 50 mL konisk rör och centrifugera vid 1300 x g under 5-10 minuter.
  31. Placera bilden i diapositivhållaren och täck med aluminiumfolie.
  32. Skanna bilden i en microarray scanner med lämpliga excitation och utsläpp våglängder. När det gäller Cy3, excitation våglängd toppen är vid ~ 550 nm och utsläpp peak med ~ 570 nm.
  33. Analysera data (se Tabell för material) för programvara som används).

8. RNA-sekvensering

  1. Utsäde 5 x 105 celler för varje prov i T25 cm2 kolvar och utföra en transfection enligt protokollet beskrivs i avsnitt 1, steg 1-5.
  2. Efter 24 och 48 h, skörda cellerna genom trypsinization.
  3. Överföra cellsuspensioner till 15 mL rör och märka dem med detta.
  4. Extrahera RNA enligt avsnitt 2, steg 1-6.
  5. Kontrollera RNA kvalitet samt koncentration med en bioanalyzer. En RNA integritet poäng (RIN) ovan åtta och lämpligt histogram är nödvändiga för att bekräfta RNA kvalitet.
  6. Från den total-RNA, använda ~ 2 µg av provet för RNA-sekvensering (messenger RNA från total-RNA)
  7. Sekvens med en nästa generations sequencer11.
  8. Kör kvalitet trimning och karta med en referens arvsmassa från FASTQ filer som genereras från RNA sekvensering maskin11.
  9. Ladda upp FASTQ filer och raw Läs räkna data till Genebank, följa instruktionerna för den < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> hemsida.
    Obs: Se anslutningen nummer SRP133420 för tidigare resultat.

9. rör bildandet assay

  1. Bedöma angiogena potential miRNA-transfekterade mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) 36 h efter transfection, som beskrivs i avsnitt 1, steg 1-5, med HUVEC celler i stället för A549 celler.
  2. Svälta HUVECs med M199 svält media för 4 h vid 37 ° C med 5% CO2.
  3. Ta bort reducerad tillväxtfaktor basalmembranet matris från-80 ° C och förvaras vid 4 ° C över natten, så att gradvis upptining att undvika bubbla bildandet och polymerisation.
  4. Försiktigt och långsamt coat brunnar 96 väl platta med 0,04 mL reducerad tillväxtfaktor basalmembranet matris, undvika bubbla bildandet. Utföra hela proceduren under en LAF.
  5. Fylla angränsande brunnar i 96 väl plattan med 0,1 mL PBS att bevara fuktighet och ta temperaturen.
  6. Inkubera 96 väl plattan vid 37 ° C i minst 20 min så att polymerisation av basalmembranet extrakt uppnås. Inte Inkubera i mer än 1 h.
  7. Trypsinize transfekterade HUVECs från varje grupp och återsuspendera i medelstora M199 vid en koncentration på 1 x 105 celler/mL.
  8. Lägg 0,1 mL av varje cellsuspension till brunnarna som innehåller polymeriserat basalmembranet matrix i 96 väl plattan.
  9. Inkubera 96 väl plattan vid 37 ° C med 5% CO2 medan beredning av tillväxtfaktorer sker. Beredning av tillväxtfaktorer sker också under laminärt flöde huven.
  10. Rekonstituera tillväxtfaktor (VEGF) 2 x den slutliga önskad koncentrationen (4 ng/mL koncentration för 2 ng/mL koncentration) och tillsätt 0,1 mL av tillväxtfaktor-innehållande M199 svält medium ovanpå den 0,1 mL M199 svält medium med celler. För icke-VEGF-behandlade brunnar, tillsätt 0,1 mL M199 svält medium ovanpå den 0,1 mL M199 svält medium med celler.
  11. Inkubera 96 väl plattan för 6 h vid 37 ° C med 5% CO2.
  12. I slutet av inkubationstiden, få bilder av varje brunn med 4 x förstoring, med brightfield Mikroskop ansluten med en digitalkamera.
  13. Bearbeta bilder med programvara utrustad med en ”angiogenes analyzer” plug-in19. Använda tre parametrar, antalet noder, antal korsningar och totala sprout längd, för att jämföra effekterna av miRNA behandling på angiogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gen uttryck analys med RT-qPCR och gel elektrofores

Differentiell gen uttryck analys med RT-qPCR visat betydande nedreglering av riktade generna CDK1, CDK4 och CDK6. CDK1 och CDK4/6 visade sig vara avgörande för G2/M och G1/S övergångar, respektive. Utförs analysen får direkt jämförelse mellan enskilda miRs och kombinatoriska miR aktivitet. Användning av scramble siRNA med transfecting agenten tillåten utvärdering av eventuella störningar från förfarandet på upptäckt genen nedreglering, vilket var minimal. Data analyserades statistiskt med hjälp av en tvåsidiga Students t-test, ochp < 0.05 ansågs statistiskt signifikant (figur 1). Innan qPCR, primer sekvenser med skärsorten primer-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> för enstaka gen förstärkning. Detta bekräftades också genom att analysera de förstärkning produkterna genom gelelektrofores. Ett enda band med DNA produkter upptäcktes för varje analyserad gen (figur 1 d), bekräftar enda gen förstärkning. CDK6 enda förstärkning var bekräftade (inga data anges).

Figure 1
Figur 1 : Relativa uttryck för CDK1, CDK4 och CDK6 gener som upptäcks av qPCR, och gelelektrofores analys av produkterna för amplifiering av DNA. miR-143 och miR-506 transfection av A549 celler inducerad nedreglering av CDK1 (A), CDK4 (B) och CDK6 C nedreglering på 24 h och 48 h efter transfection. DNA förstärkning produkter utvärderades med gelelektrofores (D) för att bekräfta enda gen förstärkning. GAPDH användes som referensgenen. Medelvärde ± SEM, * p < 0,05; ** p < 0,01, tvåsidiga t-test. Denna siffra har ändrats från Hossian et al.11vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Cellcykeln distribution via flödescytometri

Propidium jodid färgning av cellular nucleic syror är en standardmetod att visualisera cell befolkningen i olika faser av cellcykeln av kvantitering av DNA-innehåll. Kombinatoriska behandling av miR-143 och miR-506 stoppas cellcykeln på två kontrollpunkter, G0/G1 och G2/M, som anges genom flödet flödescytometrisk analys (figur 2).

Figure 2
Figur 2 : Cellcykeln analys av A549 celler transfekterade med miR-143 och miR-506 på 24 h och 48 h efter transfection. Cell populationer procentsatser för varje cell cykel bestämdes av flödescytometri och DNA-bindande propidium jodid. Genomsnittliga ± SEM. Denna siffra är omtryckt med ändringar från Hossian et al.11vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Annexin V/PI apoptos analys av flödescytometri

Efter transfection av A549 celler med miR-143 och miR-506, en apoptos analysen utfördes med hjälp av Annexin V och PI färgning och flöde flödescytometri. Det identifierades att kombinatorisk behandling inducerad betydande apoptos vid 24 och 48 h tidpunkter. Jämfört med de negativa kontrollerna, fastställdes procent-ändringen av apoptotiska celler som upptäckts av Annexin V positiva celler, på grund av miR behandling som presenteras i figur 3.

Figure 3
Figur 3 : Belysande analys av apoptotiska celler. Transection med miR-143 och miR-506 ökade procent av Annexin V positiva A549 celler. Medelvärde ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, tvåsidiga t-test. Denna siffra har ändrats från Hossian et al.11vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Cellcykeln antikropp microarray

Mekanistisk svar på behandling kan identifieras genom förändringar i proteinuttryck. Differentiell uttryck utvärderades på en proteinnivå av gener associerade med cellcykeln vägen med en väg-specifika antikroppar microarray. Protein extrakt användes för analys från celler transfekterade med miR-143/506. Microarray analys tillåtet för halvkvantitativ analys av ~ 60 cellcykeln-associerade proteiner, med sex replikat för varje specifik antikropp. Metoden tillåter ett bredare perspektiv av mekanistiska beteende inom en specifik väg, identifiering av molekylära mål för ytterligare utvärdering och utför analys på posttranslationella nivå. På grund av semikvantitativt principen om metoden måste några resultat på specifika gener bekräftas genom western blotting. Preliminärt, upptäcktes ett minskat uttryck av proteiner associerade med cellcykelns förlopp i denna analys. Detta inkluderade riktade CDK1 och CDK4 på både 24 h och 48 h efter transfection (figur 4A), som upptäckts av qPCR.

Figure 4
Figur 4 : Gen Dysreglering som upptäcks av microarray och RNA-sekvensering analys. (A) Heatmap av cellcykeln väg genuttryck som upptäcks av microarray analys i protein extrakt från A549 celler transfekterade med miR-143 och miR-506, på 24 h och 48 h efter transfection. (B) faldig förändring av cellcykeln väg genuttryck från A549 celler transfekterade med miR-143 och miR-506 på 24 h efter transfection som upptäcks av RNA-sekvensering. (C) väg aktivitet som analyseras av väg analys programvara från data som erhållits från RNA-sekvensering. Denna siffra har ändrats från Hossian et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

RNA-sekvensering och väg analys med väg analysprogram

Nästa generations sekvensering analyserar noggrant genuttryck på RNA-nivå. Metoden möjliggör identifiering av flera Genförändringar genom en enda analys (i detta protokoll analys upptäcks uttrycket av > 18.000 gener). På grund av det stora antalet upptäckta gener användes bioinformatik analys för effektiv bestämning av väg beteende (figur 4B). Programvara användes sedan (se Tabell för material) för att förutsäga G1/S och G2/M fas arresteringar och en nedreglering av S fas inledande (figur 4 c). Dessutom kan RNA-sekvensering resultaten jämföras med qPCR data. I denna studie RNA-sekvensering bekräftade resultaten från den qPCR-analys, som anger en nedreglering av CDK1 (48%, p < 0,001, FDR < 0.001), CDK4 (68%, p < 0,001, FDR < 0.001), och CDK6 (71%, < 0,001, FDR < 0,001) beror på kombinatoriska miR-143 och miR-506 aktivitet. Statistisk analys utfördes av den kantverk programvara som används för beräkning av den relativa genuttryck, beräkning av p -värden använder negativ Binomial20,21. Bioinformatik analys kan utföras för funktionell utvärdering av miRNA aktivitet och Prediktion av potentiella molekylära mål, som illustreras i figur 5.

Figure 5
Figur 5 : Belysande väg och mekanistiska analys som presenteras av väg analys aoftware. RNA-sekvensering data analyserades från A549 celler transfekterade med miR-143 och miR-506, 24 h efter transfection, med väg analysprogram och identifierade kanoniska vägar med den lägsta (A) eller högsta (B) aktiveringen poängen. Programvaran tillhandahålls också förutspådde funktioner (C) och potentiella uppströms regulatorer/mål (D). Denna siffra är omtryckt från Hossian et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Endothelial tube bildandet assay

In vitro-endothelial tube bildandet analysen används ofta för att studera angiogenes och är tillförlitlig, automatiserad och kvantifierbara22. Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) är en välkänd angiogena tillväxtfaktor23,24 och endotel tube bildandet arrangören. I denna studie identifierades att kombinatorisk behandling av miR-143 och miR-506 upphäver VEGF-inducerad angiogenes. Vägledande bilder av tube bildandet och effekterna av behandling presenteras i figur 6.

Figure 6
Figur 6 : Representativa bilder av endothelial groddar av VEGF-behandlade kontra icke-behandlade HUVECs transfekterade med rusning miRNA, miRNA-143, miRNA-506 eller en kombination därav. Bilder erhölls i brightfield Mikroskop utrustat med en digital kamera under 4 x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

microRNA kan fungera som riktade terapier för behandling av cancer, erkänner Dysreglering av uttrycksnivåerna i sjuka vs normal vävnad. Denna studie syftade till att fastställa microRNA som potentiellt stoppa cellcykelns förlopp under flera etapper. Det identifierades att miR-143 och miR-506 stoppa cellcykeln av cancerceller, och protokollen presenteras syftar till att förstå aktiviteten av denna kombinatoriska miRNA behandling.

De beskrivna metoderna ger en övergripande förståelse på funktionen av microRNA. Utmaningarna som studerar microRNA är associerade med deras förmåga att rikta flera gener och därmed påverka flera vägar. Den beskrivna qPCR-analysen tillåter identifiering av uttrycket av specifika gener av intresse, om specifika mål identifieras före behandling. Till exempel var huvudfokus här uttryck för CDK1 och CDK4/6 och cellcykeln.

Cellcykeln analys använder protokollet för propidium jodid och flöde flödescytometri är alltså en tillförlitlig metod för att upptäcka förändringar i cellpopulationer enligt deras fas i cellcykeln. Metoden bygger på proportionell ökning av fluorescens signal av PI, som binder till DNA, motsvarar scenen av cellcykeln. Kort, celler i S-fas syntetisera DNA, inducera högre signaler än i den G0/G1-fasen, och celler i den G2-fasen har duplicerat deras DNA, producerar den mest intensiva signalen.

Ackumulerande bevis indikerar anslutning av skador på cellen cyklar och utlöser apoptos25. Metoden flöde flödescytometri med hjälp av Annexin VI/PI har konsekvent använts för identifiering av inducerad apoptos i celler från cytostatikabehandling. Preliminärt, identifierades en stark apoptotiska svar på grund av kombinatoriska miRNA terapin, som var mer potent jämfört med de enskilda microRNA.

Den semikvantitativt protein antikropp microarray är en känslig och pålitlig metod att identifiera protein uttryck förändringar relaterade till specifika biologiska svar26,27. Detta protokoll används en cellcykeln pathway-specifika antikroppar microarray, som upptäckt uttryck förändringar i ~ 60 gener mellan behandlade och obehandlade celler. Försiktighet krävs under tvätt stegen att säkerställa att processen har utförts noggrant och minimera den bakgrund signalen. Dessutom bör bilderna inte bli torrt fram till slutförandet av experimentet.

Däremot innehåller RNA-sekvensering kvantitativ gen uttryck analys av flera gener, på nivån efter transkription. Avsevärt stora antalet analyserade gener (> 18.000 för RNA-seq vs. 60 för microarray) möjliggör samtidig analys av flera spridningsvägar och molekylära mål och med ökad precision. Sådan bred analys är viktigt, eftersom en enda miRNA kan binda till och rikta olika mRNA. Däremot är väg analys av stora mängder gen dysregulations inneboende utmanande. Till exempel, även om den RNA-sekvenseringen bekräftas våra qPCR data angående CDK1 och CDK4/6 nedreglering på grund av miRNA behandling, analysen också tillhandahöll data om tusentals gener att var också nere- eller upp-reglerade. För att ge sammanhang att sådana talrika gene-dysregulations, användes Väg analysprogram för att fastställa övergripande effekter av behandlingen på olika väg och cellulära funktioner. Preliminärt, tillhandahålls programvaran noter representant att aktivering (positiva z poäng) eller inaktivering (negativ z poäng) av specifika funktioner eller vägar, samt statistisk signifikans analys (figur 5)28.

Sammanfattningsvis är studiet av miRNA aktivitet ett utmanande förfarande. MicroRNA inneboende förmåga att påverka flera gener kräver användning av flera avancerade och komplicerade analytiska metoder för att identifiera potentiella aktivitet. Inte överraskande, krävs ytterligare arbete för att fullt förstå verksamhet miR-143 och miR-506 i lungcancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna vill erkänna John Caskey vid Louisiana State University för hans hjälp på väg analys av RNA-sekvensering data och University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center nästa generations sekvensering kärna för utför den RNA-sekvensering och dataanalys. Denna forskning stöddes av College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe startfinansiering och National Institutes of Health (NIH) genom det nationella institutet för allmän medicinsk vetenskap bidrag 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

Cancerforskning fråga 145 transfection miRNA lungcancer cellcykeln apoptos angiogenes RNA-sekvensering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analys av kombinatoriska miRNA behandlingar för att reglera cellcykeln och angiogenes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter