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Cancer Research

Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.

Abstract

Lungenkrebs (LC) ist die führende Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle weltweit. Ähnlich wie bei anderen Krebszellen, ist ein wesentliches Merkmal des LC Zellen unkontrollierte Proliferation und Zellteilung. Hemmung der Proliferation von Zellzyklus Fortschreiten zu stoppen hat gezeigt, ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Krebs, einschließlich LC.

MiRNA Therapeutika sind als wichtige posttranskriptionelle gen Regulatoren entstanden und werden zunehmend für den Einsatz in der Krebstherapie untersucht. In den letzten Arbeiten haben wir zwei MiRNAs, MiR-143 und MiR-506, zur Regulierung des Zellzyklus Progression verwendet. A549 nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebszellen wurden transfiziert gen Ausdruck Änderungen wurden analysiert und apoptotische Aktivität aufgrund der Behandlung war schließlich analysiert. Herabregulation von cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) erkannt wurden (d. h. CDK1, CDK4 und CDK6), und den Zellzyklus gestoppt an den Phasenübergängen G1/S und G2/M. Pathway Analyse zeigte mögliche Anti-angiogenetische Tätigkeitsbereich die Behandlung, die das Konzept mit vielfältigen Aktivitäten verleiht. Hier beschrieben, sind die Methoden zur Identifikation von MiRNA Tätigkeit betreffend Zellzyklus Hemmung, Induktion der Apoptose und Auswirkungen der Behandlung auf Endothelzellen durch Hemmung der Angiogenese. Es ist zu hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden Zukunftsforschung auf MiRNA Therapeutika und entsprechende Aktivität unterstützen und die repräsentativen Daten andere Forscher während experimentelle Analysen leiten werden.

Introduction

Der Zellzyklus ist eine Kombination aus mehreren regulatorischen Ereignisse, die Vervielfältigung der DNA und Zellproliferation durch den mitotischen Prozess1ermöglichen. Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) regulieren und fördern die Zellzyklus-2. Unter anderem haben die mitotische CDK (CDK1) und Interphase CDKs (CDK2, CDK4 und CDK6) eine zentrale Rolle im Zellzyklus Progression3. Retinoblastom-Protein (Rb) ist von der CDK4/CDK6 komplexe erlauben Zellzyklus Fortschreiten4phosphoryliert und CDK1 Aktivierung ist unerlässlich für erfolgreiche Zellteilung5. Zahlreiche CDK-Inhibitoren wurden entwickelt und bewertet in klinischen Studien in den letzten Jahrzehnten zeigt das Potenzial des Zielens CDKs in der Krebsbehandlung. In der Tat drei CDK-Inhibitoren zur Behandlung von Brustkrebs genehmigt worden vor kurzem6,7,8,9,10. So CDKs und insbesondere CDK1 und CDK4/6, sind von großem Interesse bei der Regulierung der Zelle Tumorprogression.

MiRNAs (MiRs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs und posttranskriptionelle Regulatoren der Genexpression, Regulierung von ca. 30 % aller menschlichen Gene11. Ihre Tätigkeit basiert auf translationale Repression oder zum Abbau von Messenger-RNAs (mRNAs)12. Beispielhaft für ihre biologische Bedeutung, mehr als 5.000 MiRNAs wurden identifiziert und ein einzelnes MiRNA-Molekül kann mehrere Gene11,13regulieren. Noch wichtiger ist, wurde MiRNA Ausdruck verschiedener Krankheiten und Zustände von Krankheit, einschließlich Krebs13zugeordnet. In der Tat MiRNAs haben so onkogenen gekennzeichnet worden oder Tumor-Suppressoren, fähig zu fördern oder zu unterdrücken Tumor Entwicklung und Progression14,15. Die relative Expression von MiRNAs in erkrankten Geweben kann Fortschreiten der Krankheit regulieren; so hat die exogene Lieferung von MiRNAs therapeutisches Potenzial.

Lungenkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle und mehr als 60 % aller malignen Erkrankungen Lunge nicht klein sind Zelle Lungenkrebs Krebs16,17, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 20 %18. Die Verwendung von MiR-143-3 p und MiR-506-3 p wurde vor kurzem für die Ausrichtung der Zelle Zyklen in der Lunge Krebs Zellen11bewertet. MiR-143 und MiR-506 Sequenzen, die Komplementarität CDK1 und CDK4/CDK6 sind, und die Auswirkungen dieser beiden MiRs auf A549 Zellen wurden analysiert. Die experimentelle Details werden vorgestellt und diskutiert in diesem Papier. Genexpression, Zellzyklus Progression und Apoptose wurden mit verschiedenen experimentellen Designs und Zeitpunkte nach Transfektion ausgewertet. Wir Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) Methoden zusammen mit Microarray-Analyse zur Messung der spezifischen Gen-Expression und RNA Sequenzierung der nächsten Generation wurde verwendet, um globale gen Dysregulation11bestimmen. Die letztere Methode identifiziert die relative Häufigkeit jedes Gen Abschrift mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit, während Tausende von Genen aus einer einzigen experimentellen Analyse analysiert werden können. Darüber hinaus Apoptotic Analyse aufgrund der MiRNA-Behandlung wurde durchgeführt und wird hier beschrieben. Bioinformatik ergänzt die Pfad-Analyse. Hier werden Protokolle zur Analyse der das therapeutische Potenzial der kombinatorischen MiR-143 und MiR-506 verwendet.

Der Hauptzweck dieses Protokolls ist es, die Auswirkungen von MiRNAs in Zellen, mit einem Fokus auf den Zellzyklus. Die Vielfalt der Techniken hier vorgestellten Spanne von gen Expressionsanalyse Vorübersetzung (mit qPCR) zu erarbeiten und neue Techniken für die Genanalyse auf Proteinebene, wie Microarray-Analyse. Es ist zu hoffen, dass dieser Bericht hilfreich für Forscher in Zusammenarbeit mit MiRNAs interessiert ist. Darüber hinaus präsentiert Methodik zur durchflusszytometrischen Analyse des Zellzyklus und Apoptose der Zellen.

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Protocol

1. MiR-143 und MiR-506 Transfektion

Achtung: Verwenden Sie Latexhandschuhe, schützende Brillen und einen Laborkittel während der Durchführung der beschriebenen Experimente. Bei Bedarf verwenden Sie das Biosafety-Gehäuse mit dem Gehäuse Lüfter, ohne die Atemwege blockieren oder stören die laminare Luftströmung. Immer die schützende Glasscheibe auf die passende Höhe eingestellt, wie vom Hersteller beschrieben.

  1. Samen NSCLC A549 Zellen in ein T25 cm2 Kolben/6/96 well-Platte in DMEM/F12K Medien mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (Kultur, Medien) in einer Gewebekultur Kapuze ergänzt und über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2 in einer Gewebekultur Inkubator inkubieren.
  2. MiR-143 und/oder MiR-506 Mimik auszusetzen oder zu klettern, SiRNA mit transfecting Mittel (2,4 µg von MiR waren gemischt mit 14 µL transfecting Agent; siehe Tabelle of Materials) in 500 µL Transfektion Medien und 1,5 mL Serum und antibiotikafreien DMEM/F12K Medien in einer endgültige MiRNA-Konzentration von 100 nM. MiRNA kann Optimierung auf verschiedene Zellen und Konzentration erfordern. Entsprechende Ansätze umfassen die Transfektion von Zellen mit steigenden Konzentrationen von MiRNA (d.h., 50-200 nM) und Bewertung der Ausdruck Herabregulation der Gene von Interesse.
  3. Nährmedien aus Kolben/Platte entfernen und einmal mit 1 X PBS waschen.
  4. Hinzufügen von MiRNA/Scramble-transfecting-Agent-komplexe und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 6 h (Kolben Größe definiert zusätzliche Inkubation).
  5. Ersetzen Sie die Medien mit 4 mL Nährmedien und inkubieren Sie Zellen für 24 h bzw. 48 h.
  6. Ernte transfizierten Zellen durch Trypsinization, durch Zugabe von 1 mL Trypsin-EDTA in jedem T25 cm2 Kolben, 5-10 min bei 37 ° C inkubieren, und 3 mL Kulturmedien, die Zellen zu ernten. Legen Sie den Inhalt jeder Flasche in eine separate, markierte 15 mL-Tube. Arbeiten Sie in einer Gewebekultur-Haube.
  7. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
    Hinweis: Vorsicht ist geboten beim überstand entfernen, da Agitation des Rohres Verlust von Zellen führen kann.
  8. Fügen Sie 2 mL 1 X PBS und Zentrifuge für 5 min am 751 X g.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 einmal alle Spuren von Medien und überstand entfernen.
    Hinweis: In diesem Stadium Probenröhrchen können bei-80 ° C gelagert werden oder können sofort verwendet werden.

2. RNA-Extraktion

  1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich durch Besprühen mit 70 % Isopropylalkohol und RNAse Dekontaminationslösung.
  2. RNA-Extraktion durchgeführt werden, mit einer entsprechenden RNA kit (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Entfernen Sie die Röhren von-80 ° C und lassen sie zu tauen. Fügen Sie 300 µL Puffer lyse und Pipette rauf und runter, die Zellmembran zu brechen.
  4. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 100 % ultra-reines Ethanol.
  5. Mischen Sie gut und in Spalte trennen.
  6. Zwischen 11 und 16 X g für 30 s und Entfernen der durchströmten zentrifugieren.
  7. Fügen Sie 400 µL Puffer und Zentrifuge zu entfernen, den Puffer zu waschen.
  8. Fügen Sie 5 µL der DNAse I mit 75 µL DNA Verdauung Puffer in jeder Probe und 15 min inkubieren.
  9. Waschen Sie die Probe mit 400 µL RNA Prep Puffer.
  10. Waschen Sie 2 X mit RNA Waschpuffer.
  11. Nuklease-freies Wasser die Spalte fügen Sie hinzu, Zentrifuge, dann sammeln die RNA.
  12. Messen Sie RNA-Gesamtkonzentration mit einem UV-Spektralphotometer.

(3) RT-qPCR

  1. Synthetisieren Sie vor RT-qPCR die cDNA. Im Anschluss an die RNA-Konzentration-Quantifizierung legen Sie 1 µg RNA in einem 20 µL Endvolumen von Reaktion, cDNA in einem PCR-Röhrchen vorzubereiten. Arbeiten Sie immer auf einen sauberen Werkbank.
  2. Alle anderen Zutaten sind in Tabelle 1enthalten.
Zutaten Menge (µL) / Probe (20 µL)
5 X cDNA Master mix 4
dNTPs 2
Zufällige hexamers 1
RT-enhancer 1
Verso Enzym-mix 1
DNase und RNase freies Wasser Erforderliche Menge nach dem Hinzufügen von RNA zu 20 µL

Tabelle 1: Materialien für die cDNA-Synthese von RNA-Proben. Erforderlichen Mengen der jeweiligen Zutaten vorzubereiten einen master-Mix für eine Probe für die cDNA-Synthese.

  1. Brüten in einem Thermocycler mit den folgenden Temperaturbedingungen: 42 ° C für 30 min; 95 ° C für 2 min; 4 ° C bis zur Abholung von Proben.
  2. Sofort in regulären PCR oder qPCR verwenden Sie oder speichern Sie cDNA bei-20 ° C.
  3. Bereiten Sie vorwärts und rückwärts Grundierung Lösungen mit DNase/RNase-freie Wasser in einer Konzentration von 10 µM aus Lager Primer Lösung.
  4. Bereiten Sie separate master Mischungen für jedes Gen erkannt werden, entsprechend der Anzahl der Proben. Für jede Probe cDNA (qPCR gut) ist die Messgröße Reaktion nach Tabelle 2bereit.
Zutaten Menge (µL) / Probe (20 µL)
SYBR-master-mix 10
Forward Primer - 10 μM 2
Rückwärts-Primer - 10 μM 2
DNase und RNase freies Wasser 3
cDNA-Probe 3

Tabelle 2: Werkstoffe für quantitative Real-Time PCR aus cDNA Proben. Erforderliche Menge der Zutaten, um ein master-Mix für eine Probe für qPCR vorzubereiten.

  1. Legen Sie jede Probe in den jeweiligen Brunnen.
  2. Das Probe-Layout für die 96 auch qPCR-Platte. Für jede Probe und analysierten Gens führen die Reaktion im Triplicates oder am wenigsten in Duplikate.
  3. Verschließen Sie die 96-well-Platte mit einem optisch klare selbstklebende Deckel.
  4. Quick-Spin die Platte, um das Reaktionsgemisch auf den unteren Rand jedes gut erreichen lassen.
  5. RT-qPCR nach folgenden Temperaturgefälle ausgeführt:
    (1) 50 ° C für 2 min
    (2) 95 ° C für 2 min
    (3) 95 ° C für 15 s
    (4) Meßwert
    (5) 60 ° C 1,5 min.
    (6) wiederholen Sie Schritt 3 für 39 Mal
  6. Führen Sie die folgende Temperaturgefälle in Fortsetzung der oben genannten schmelzenden Kurve zu bestimmen, welche Einzelprodukt Verstärkung zeigt.
    (7) 65 ° C für 0,31 min
    0,5 ° C/Zyklus
    (9) Platte lesen
    (10) wiederholen Sie Schritt 8 für 60 Mal bis zu 95 ° C
    (11) 72 ° C für 2 min

(4) Agarose-Gelelektrophorese, einzelne Gene Amplification zu bestätigen

  1. Bereiten Sie 1 % Agarose-Gel auf 1 X TBE-Puffer.
  2. Fügen Sie Interkalation Bromid (EtBr) in warmen (~ 50 ° C) Gel bis erreicht eine Endkonzentration von etwa 0,2-0,5 µg/mL. EtBR mit DNA bindet und erlaubt es, unter UV-Licht in ein Gel-Imager visualisiert werden.
  3. Gießen Sie warme Gel in einem Gel-Tablett mit ein Elektrophorese-Gel-Box geliefert. Befestigen Sie den mitgelieferten Kamm fest für einheitliche Brunnen.
  4. Ermöglichen Sie das Gel mit Rest und abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für ~ 30 min.
  5. Wenn das Gel verfestigt ist, legen Sie das Gel und Tablett im Feld Gel.
  6. Füllen Sie die Gel-Box mit 1 X TBE Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.
  7. Messen Sie die Konzentration der DNA von PCR-Amplifikation-Prozess mit einer UV-Spektrometer.
  8. Nehmen Sie ~ 15 ng DNA in ein PCR-Röhrchen, 5 µL Farbstoff hinzufügen und fügen Sie die erforderliche Menge an Nuklease-freies Wasser auf ein Volumen von insgesamt 15 µL zu erreichen.
  9. Laden Sie die DNA-Leiter und Proben in die Vertiefungen.
  10. Führen Sie das Gel bei 100 V, bis die Farbstoff-Linie etwa 75-80 % nach unten das Gel ist.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Gel von einem negativen zu positiven Ladung läuft.
  11. Entfernen Sie das Gel und legen Sie sie in der Gel-Imager, DNA zu visualisieren.

5. Zellzyklus-Analyse

  1. 5 x 105 Samenzellen für jede Probe in einem T25 cm2 Kolben und führen eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
  2. Nach 24 h und 48 h dann ernten Sie die Zellen durch Trypsinization.
  3. Übertragen der Zellsuspensionen auf 15 mL steriles Röhrchen und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
  4. Zentrifugieren Sie Proben bei 751 X g für 5 min und verwerfen Sie den überstand.
  5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
  6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS, passives Medium zu entfernen.
  7. Aufschwemmen Sie und brechen Sie das Pellet durch Zugabe von 200 µL des eiskalten 1 X PBS durch pipettieren.
  8. Zellen zu beheben, indem Sie sanft das Rohr beim Aufschütteln 2 mL 70 % eiskaltem Ethanol tropfenweise hinzufügen.
  9. Inkubieren Sie Rohre für 30 min bei RT und legen Sie die Rohre bei 4 ° C für 1 h.
  10. Rohre von 4 ° C und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min zu entfernen.
  11. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
  12. Hinzufügen von 500 µL 1 X PBS mit Propidium Jodid (50 µg/mL) und Ribonuklease ein (200 µg/mL)
  13. Inkubieren Sie für 30 min bei RT und die Proben vor Licht zu schützen.
  14. Erwerben Sie Daten auf Durchflusszytometer. Verwenden Sie vorwärts vs. Side Scatter (FSC vs. SSC) zu den wichtigsten Population von Zellen, ausgenommen Schutt in der unteren linken Ecke der FSC vs. SSC Dichte Handlung und Zelle Cluster wählen an der Spitze nach oben-rechts der FSC vs. SSC Dichte Handlung.
  15. Analysieren von Daten zur Identifizierung des Zell-Populationen pro Zellzyklus Etappe mit der entsprechenden Software.

(6) Apoptose-assay

  1. 5 x 105 Samenzellen für jede Probe in einem T25 cm2 Kolben und führen eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
  2. Nach 24 h und 48 h Ernte der Zellen durch Trypsinization.
  3. Übertragen der Zellsuspensionen auf 15 mL steriles Röhrchen und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
  4. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
  6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS, passives Medium zu entfernen.
  7. Verdünnen Sie 10 x Annexin V Bindung Puffer, 1 X mit eiskalten dH2O.
  8. Jede Probe Tube 1 mL 1 x Annexin V Bindung Puffer hinzu und Aufschwemmen Sie sanft.
  9. Platz 96 µL der Zellsuspension in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  10. Das Röhrchen mit der Zellsuspension fügen Sie 1 µL Annexin V-FITC-Konjugat und 12,5 µL Propidium Jodid (PI hinzu).
  11. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 10 min auf Eis im Dunkeln.
  12. Jede Probenröhrchen verdünnen fügen Sie 250 µL eiskalte 1 x Annexin V Bindung Puffer hinzu.
  13. Analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometer sofort.

(7) Proteinexpression durch Antikörper Zellzyklus microarray

  1. 5 x 105 Samenzellen für jede Probe in T25 cm2 Flaschen und führen Sie eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
  2. Ernten Sie nach 24 h und 48 h Zellen durch Trypsinization.
  3. Zellsuspensionen auf 15 mL Röhrchen übertragen und entsprechend beschriften.
  4. 751 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie 2 mL eiskaltes 1 X PBS, Wirbel und Zentrifuge bei 751 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
  6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit 1 X PBS.
  7. Fügen Sie 150 µL Lyse Puffer mit Protease-Inhibitoren ergänzt. Pipettieren oben und unten vorsichtig, die Zellmembranen zu stören.
  8. Zur Vermeidung von Interferenzen Lyse Puffer führen Sie ein Buffer Tausch den Lyse-Puffer mit Kennzeichnung Puffer, mit Lösemittel Austausch von Spalten des Herstellers zu ersetzen.
  9. Quantifizieren Sie die gesamte-Protein mit einem BCA-Assay.
  10. Nehmen Sie 70 µg Protein Probe und Kennzeichnung Puffer zu einem Endvolumen von 75 µL zu erreichen.
  11. 1 mg Biotin Reagenz (Biotin/DMF) 100 µL Dimethylformamid (DMF) hinzufügen.
  12. Jedes Protein Sample (biotinylierte Protein Beispiel) 3 µL Biotin/DMF hinzu und 2 h bei RT inkubieren
  13. Vortexen 35 µL Stop Reagenz und Mischung hinzufügen.
  14. Inkubieren Sie Proben bei RT 30 min.
  15. Nehmen Sie die Microarray-Dias aus dem Kühlschrank, so dass sie auf RT 1 h vor Gebrauch warm.
  16. Führen Sie blockieren für unspezifische Bindung durch Inkubation der Folien mit Trockenmilch 3 % Lösung (in blocking Reagenz vom Hersteller bereitgestellt) in einer Petrischale mit kontinuierlichen Schütteln für 45 min bei RT
  17. Der Objektträger mit DdH2O Wasser waschen (sofern nicht anders angegeben, Waschen erfolgt mit DdH2O).
  18. Wiederholen Sie die Waschschritt ~ 10 X um die blockierende Lösung von die Gleitflächen zu entfernen. Dies ist wichtig, einen einheitlichen und niedrigen Hintergrund zu erreichen.
  19. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Gleitflächen und mit dem nächsten Schritt fortfahren Sie, ohne die Folien trocknen zu lassen.
  20. Bereiten Sie Kupplung Lösung durch Auflösen von 3 % trockene Milch in ein Kupplung-Reagenz.
  21. 6 mL der Kupplung-Lösung und die gesamte Menge der vorbereiteten biotinylierte Protein Probe aus Schritt 7.12 hinzufügen.
  22. Statt einer Folie in einen Brunnen der Kupplung Kammer vom Hersteller bereitgestellten und ~ 6 mL Protein Mischung darauf Kupplung.
    Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Folie im Protein Mischung Lösung Kupplung vollständig eingetaucht sind.
  23. Decken Sie die Kupplung Kammer und 2 h bei RT mit kontinuierlichen Erregung in einem Orbitalschüttler inkubieren.
  24. Übertragen Sie die Folien auf einer Petrischale und 30 mL 1 x Waschpuffer. Legen Sie die Petrischale in Orbitalschüttler, schütteln für 10 min und die Lösung zu verwerfen.
  25. Wiederholen Sie Schritt 7,24 2 X.
  26. Spülen Sie die Folien mit DdH2O Wasser ausgiebig wie in den Schritten 7.17 und 7.18 beschrieben und fahren Sie mit nächsten Schritt sofort um Austrocknen zu vermeiden.
  27. Fügen Sie in 30 mL Detektionspuffer 30 µL Cy3-Streptavidin (0,5 mg/mL).
  28. Legen Sie die Folie in einer Petrischale und 30 mL Detektionspuffer mit Cy3-Streptavidin.
  29. Brüten Sie in einem Orbitalschüttler für 20 min mit kontinuierlichen schütteln vor Licht geschützt.
    Hinweis: Cy-3 ist ein fluoreszierender Farbstoff. Mit Aluminiumfolie abdecken oder arbeiten unter schlechten Lichtverhältnissen zu Fluoreszenzintensität zu erhalten.
  30. Führen Sie Schritte 7,24-7,26 und ermöglichen Sie die Folie trocken mit einem sanften Luftstrom oder Platzierung der Folie in ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 1300 X g für 5-10 min.
  31. Legen Sie die Folie in Diahalter und mit Alufolie bedecken.
  32. Scannen Sie die Folie in einem Microarray Scanner mit der entsprechenden Anregung und Emission Wellenlängen. Bei Cy3, steht Ihnen die Erregung Wellenlänge Peak ~ 550 nm und Emission Peak bei ~ 570 nm.
  33. Analysieren Sie die Daten (siehe Tabelle der Materialien) für Software verwendet).

(8) RNA-Sequenzierung

  1. 5 x 105 Samenzellen für jede Probe in T25 cm2 Flaschen und führen Sie eine Transfektion gemäß dem Protokoll beschrieben in Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5.
  2. Nach 24 h und 48 h Ernte der Zellen durch Trypsinization.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf 15 mL-Tuben und entsprechend beschriften.
  4. Extrahieren Sie RNA gemäß Abschnitt 2, Schritte 1 bis 6.
  5. RNS-Qualität sowie Konzentration mit einem Bioanalyzer kontrollieren. Eine RNA-Integrität (RIN) über acht Punkte und entsprechende Histogramme sind notwendig, um RNS-Qualität bestätigen.
  6. Verwenden Sie von der Gesamt-RNS ~ 2 µg der Probe für RNA Sequenzierung (Boten-RNA von Gesamt-RNS)
  7. Sequenz mit einer nächsten Generation Sequenzer-11.
  8. Führen Sie Qualität trimmen und Karte mit einem Referenz-Genom von FASTQ Dateien, die von der RNA Sequenzierung Maschine11generiert.
  9. Laden Sie FASTQ Dateien und raw lesen die Zähldaten, Genbank, folgen Sie die Anweisungen des der < Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Webseite.
    Hinweis: Siehe Zbl-Nummer SRP133420 für die bisherigen Ergebnisse.

9. Rohr Bildung assay

  1. Das angiogenen Potenzial der MiRNA-transfizierten menschlichen Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) 36 h nach Transfektion, zu beurteilen, wie im Abschnitt 1, Schritte 1 bis 5, HUVECS Zellen anstelle von A549 Zellen beschrieben.
  2. Verhungern Mediumwechsel mit M199 Hunger Medien für 4 h bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  3. Reduzierte Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix von-80 ° C und bei 4 ° C über Nacht, so dass allmählich Auftauen zur Vermeidung von Blasenbildung und Polymerisation zu entfernen.
  4. Beschichten Sie vorsichtig und langsam Brunnen von einer 96-well-Platte mit 0,04 mL reduzierter Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix, Vermeidung von Blasenbildung. Führen Sie das ganze Verfahren unter einem Laminar-Flow-Haube.
  5. Füllen Sie neben Brunnen von den 96-well-Platte mit 0,1 mL PBS, Luftfeuchtigkeit und Temperatur zu erhalten.
  6. Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten, so dass Polymerisation der Basalmembran Extrakt erreicht wird. Nicht mehr als 1 h inkubieren.
  7. Trypsinize transfizierten Mediumwechsel aus jeder Gruppe und Aufschwemmen im mittleren M199 in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL.
  8. Die Brunnen polymerisierten Basalmembran Matrix in der 96-well-Platte mit fügen Sie 0,1 mL jedes Zellsuspension hinzu.
  9. Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 , während der Vorbereitung von den Wachstumsfaktoren erfolgt. Vorbereitung von Wachstumsfaktoren erfolgt ebenfalls unter der Laminar-Flow-Haube.
  10. Rekonstruieren Sie Wachstumsfaktoren (VEGF) 2 x die gewünschte Endkonzentration (4 ng/mL Konzentration für 2 ng/mL Endkonzentration) und 0,1 mL Wachstumsfaktor-haltigen M199 Hunger Medium auf die 0,1 mL M199 Hunger Medium mit den Zellen. Fügen Sie für VEGF-unbehandelte Brunnen 0,1 mL M199 Hunger Medium auf die 0,1 mL M199 Hunger Medium mit den Zellen.
  11. Inkubieren Sie die 96-well-Platte für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  12. Am Ende der Inkubationszeit Bilder von jedem Bohrloch mit 4 X Vergrößerung, mit einem Hellfeld-Mikroskop, verbunden mit einer Digitalkamera zu erhalten.
  13. Verarbeiten von Bildern mit Software ausgestattet mit einem "Angiogenese-Analysator" Plug-in19. Verwenden Sie drei Parameter, die Anzahl der Knoten, die Anzahl der Kreuzungen und total sprießen Länge, um die Effekte der MiRNA-Behandlung auf die Angiogenese zu vergleichen.

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Representative Results

Ausdruck der Genanalyse mit RT-qPCR und Gel-Elektrophorese

Differentielle Ausdruck Genanalyse mit RT-qPCR zeigte signifikante Herabregulation der gezielt Gene CDK1, CDK4 und CDK6. Cdk1 und CDK4/6 erwiesen sich maßgeblich für die G2/M und G1/S Übergänge, beziehungsweise. Die durchgeführten Analysen erlaubt direkten Vergleich zwischen einzelnen MiRs und kombinatorische MiR Aktivität. Der Einsatz von SiRNA Gerangel mit dem transfecting Mittel zulässig, Bewertung von Störungen aus dem Verfahren auf erkannt gen Herabregulation der war minimal. Die Daten wurden statistisch analysiert mit einem zweiseitigen Student t-test, undp < 0,05 galt als statistisch signifikant (Abbildung 1). Vor qPCR, wurden die Primer-Sequenzen mit Primer-BLAST ausgewertet < Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> für einzelnes Gen-Amplifikation. Dies wurde auch bestätigt durch die Analyse der Amplifikationsprodukte durch Gelelektrophorese. Für jedes analysierte gen (Abbildung 1), einzelne Gene Amplification bestätigt wurde ein einzelnes Band DNA Produkte gefunden. CDK6, die einzigen Verstärkung wurde bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Figure 1
Abbildung 1 : Relative Expression CDK1, CDK4 und CDK6 Gene wie von qPCR und Gel-Elektrophorese-Analyse der DNA Verstärkung Produkte erkannt. MiR-143 und MiR-506 Transfektion von A549 Zellen induziert Herabregulation der CDK1 (A), CDK4 (B) und CDK6 (C) Downregulation bei 24 h und 48 h nach Transfektion. DNA-Amplifikationsprodukte wurden durch Gelelektrophorese (D), einzelne Gene Amplification bestätigen ausgewertet. GAPDH diente als Referenz-gen. Durchschnitt ± SEM * p < 0,05; ** p < 0,01, zwei-tailed t-test. Diese Zahl wurde von Hossian Et Al.11geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Zellzyklus-Verteilung über Durchflusszytometrie

Propidium Jodid Färbung des zellulären Nukleinsäuren ist eine Standardmethode um Zellpopulation in verschiedenen Phasen des Zellzyklus durch Quantifizierung der DNA-Gehalt zu visualisieren. Die kombinatorische Behandlung von MiR-143 und MiR-506 gestoppt den Zellzyklus an zwei Checkpoints, G0/G1 und G2/M, wie durch durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 2) angegeben.

Figure 2
Abbildung 2 : Zellzyklus Analyse A549 Zellen mit MiR-143 und MiR-506 bei 24 h und 48 h nach Transfektion transfiziert. Zelle Bevölkerungen Prozentsätze für jede Zelle Zyklus wurden durch Durchflusszytometrie und DNA-Bindung Propidium Jodid bestimmt. Durchschnittliche ± SEM. Diese Zahl ist mit Änderungen von Hossian Et Al.11abgedrucktKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Annexin V/PI Apoptose Assay durch Durchflusszytometrie

Nach Transfektion von A549 Zellen mit MiR-143 und MiR-506 erfolgte ein Apoptose-Assay, mittels Annexin V und PI-Färbung und Flow-Zytometrie. Es wurde festgestellt, dass die kombinatorische Behandlung an 24 h und 48 h Zeitpunkten signifikante Apoptose induziert. Im Vergleich zu den Negativkontrollen, wurde die Prozent-Änderung der Apoptotic Zellen ermittelt, festgestellt durch die Annexin V positive Zellen, durch die MiR Behandlung wie in Abbildung 3dargestellt.

Figure 3
Abbildung 3 : Anschauliche Analyse der Apoptotic Zellen. Durchtrennung mit MiR-143 und MiR-506 erhöht den Prozentsatz der Annexin V positive A549 Zellen. Durchschnitt ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, zwei-tailed t-test. Diese Zahl wurde von Hossian Et Al.11geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Zellzyklus Antikörper microarray

Mechanistische Reaktionen auf die Behandlung können durch Änderungen im Protein-Expression identifiziert werden. Differentielle Expression wurde an einen Proteingehalt von Genen verbunden mit den Zellzyklus Weg mit einer Weg-spezifischen Antikörper Microarray ausgewertet. Protein-Extrakte wurden für die Analyse von Zellen mit MiR-143/506 transfiziert verwendet. Die Microarray-Analyse erlaubt für semi-quantitative Analyse von ~ 60 Zellzyklus-assoziierte Proteine, mit sechs Wiederholungen für jede spezifische Antikörper. Der Ansatz ermöglicht eine breitere Perspektive der mechanistischen Verhalten innerhalb einer bestimmten Weg, Identifizierung von molekularen Zielstrukturen zur weiteren Auswertung und Analyse der post-translationalen Ebene durchführen. Semi-quantitativen prinzipbedingt der Methode keine Ergebnisse auf bestimmte Gene durch western Blot bestätigt werden müssen. In dieser Analyse wurde vorläufig, eine verminderte Expression von Proteinen assoziiert mit Zellzyklus Progression erkannt. Dies beinhaltete die gezielte CDK1 und CDK4 bei 24 h und 48 h nach Transfektion (Abb. 4A), wie von qPCR erkannt.

Figure 4
Abbildung 4 : Gen Dysregulation durch Microarray und RNA Sequenzierung Analyse erkannt. (A) Heatmap Zellzyklus Weg gen Ausdrücke wie von Microarray-Analyse an Proteinen erkannt Auszüge aus A549 Zellen transfected mit MiR-143 und MiR-506, bei 24 h und 48 h nach Transfektion. (B) Fold Änderung des Zellzyklus Weg gen Ausdrücke aus A549 Zellen transfiziert mit MiR-143 und MiR-506 an 24 h nach Transfektion durch RNA Sequenzierung festgestellt. (C) Weg Aktivität wie von Pfad-Analyse-Software von RNA Sequenzierung gewonnenen Daten analysiert. Diese Zahl wurde von Hossian Et Al. modifiziert 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

RNA-Sequenzierung und Pathway Analyse mit Pfad-Analyse-software

Next Generation Sequencing analysiert präzise Genexpression auf RNA-Ebene. Die Methode ermöglicht eine Identifizierung des Gens Mehrfachänderungen durch eine einzelne Analyse (in diesem Protokoll erkannt die Analyse den Ausdruck > 18.000 Gene). Aufgrund der großen Anzahl der gefundenen Gene nutzte Bioinformatik Analyse für effiziente Ermittlung des Weges Verhalten (Abbildung 4 b). Software wurde dann verwendet (siehe Tabelle der Materialien), vorherzusagen, G1/S und G2/M-Phase-Verhaftungen und die Herunterregulierung der S-phase Einleitung (Abbildung 4). Darüber hinaus können die RNA Sequenzierung Ergebnisse mit qPCR Daten verglichen werden. In dieser Studie die RNA-Sequenzierung bestätigte die Ergebnisse von der qPCR-Analyse, zeigt eine Herunterregulierung der CDK1 (48 %, p < 0,001, FDR < 0,001), CDK4 (68 %, p < 0,001, FDR < 0,001), und CDK6 (71 %, < 0,001, FDR < 0,001) aufgrund kombinatorische MiR-143 und MiR-506-Aktivität. Statistische Analyse erfolgte durch die EdgeR-Software für die Berechnung der relativen Genexpression, mit negativen Binomialverteilung20,21 p -Werte berechnen. Bioinformatik-Analyse kann für die Funktionsauswertung MiRNA Aktivität und Vorhersage der mögliche molekulare Targets durchgeführt werden, wie in Abbildung 5dargestellt.

Figure 5
Abbildung 5 : Illustrative Weg und mechanistischen Analyse als präsentiert von Pathway Analyse Aoftware. RNA Sequenzierungsdaten wurden von A549 Zellen transfiziert mit MiR-143 und MiR-506, 24 h Post-Transfection mit Pfad-Analyse-Software und identifizierten kanonische Wege mit der niedrigsten (A) oder höchsten (B) Aktivierung Partitur analysiert. Die Software lieferten auch vorhergesagten Funktionen (C) und potenzielle upstream Regler/Ziele (D). Diese Zahl ist aus Hossian Et Al. abgedruckt. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Endotheliale Rohr Bildung assay

Die Endothelzellen in-vitro-Rohr Bildung Assay ist weit verbreitet, Angiogenese zu studieren und zuverlässige, automatisierte und quantifizierbare22ist. Vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ist eine bekannte angiogenen Wachstumsfaktor23,24 und endotheliale Rohr Bildung Promoter. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die kombinatorische Behandlung von MiR-143 und MiR-506 VEGF-induzierte Angiogenese hebt. Indikative Bilder von Rohr-Bildung und die Auswirkungen der Behandlung werden in Abbildung 6dargestellt.

Figure 6
Abbildung 6 : Repräsentative Bilder von endothelialen Sprossen der VEGF-behandelten vs. unbehandelten Mediumwechsel mit Scramble MiRNA, MiRNA-143, MiRNA-506 oder eine Kombination davon transfiziert. Bilder wurden unter 4 X Vergrößerung unter dem Hellfeld-Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

MiRNAs können agieren als zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Krebs, erkennen die Dysregulation der Ausdruck Ebenen in erkrankten vs. normale Gewebe. Diese Studie soll MiRNAs zu bestimmen, die potenziell Zellzyklus Fortschreiten in mehreren Phasen zu stoppen. Es wurde festgestellt, dass MiR-143 und MiR-506 stoppen den Zellzyklus der Krebszellen und der vorgestellten Protokolle zielte darauf ab, die Aktivität dieser kombinatorischen MiRNA-Behandlung zu verstehen.

Die beschriebenen Methoden geben ein übergreifendes Verständnis über die Funktion der MiRNAs. Die Herausforderungen des Studiums MiRNAs sind mit ihrer Fähigkeit, mehrere Gene gezielt und beeinträchtigen somit mehrere Wege verbunden. Die beschriebenen qPCR-Analyse ermöglicht die Identifizierung der die Expression bestimmter Gene von Interesse, wenn konkrete Ziele vor der Behandlung festgestellt werden. Der Schwerpunkt hier war beispielsweise der Ausdruck CDK1 und CDK4/6 und den Zellzyklus.

Zellzyklus-Analyse mit Propidium Jodid und Flow Cytometry Protokoll deshalb einen zuverlässigen Ansatz, Veränderungen in der Zell-Populationen nach ihrer Bühne im Zellzyklus zu erkennen. Die Methode beruht auf der verhältnismäßig Anstieg der Fluoreszenzsignal von der PI, die DNA, die Stufe des Zellzyklus bindet. Kurz, synthetisieren Zellen in der S-Phase DNA, induzieren höhere Signale als Zellen in der G0/G1-Phase und Zellen in der G2-Phase ihrer DNA, produziert das intensivste Signal kopiert haben.

Beweise sammeln, zeigt die Verbindung von Schäden an den Zellzyklus und Auslösung von Apoptose25. Die Flow-Zytometrie-Methode mit Annexin VI/PI wurde konsequent für die Identifizierung der induzierte Apoptose in Zellen von Chemotherapie zur Behandlung eingesetzt. Vorläufig, war eine starke Apoptotic Antwort aufgrund der kombinatorischen MiRNA-Therapie, die stärker im Vergleich zu den einzelnen MiRNAs war identifiziert.

Die semi-quantitativen Protein Antikörper Microarray ist eine sensible und zuverlässige Methode um Protein Ausdruck Änderungen für bestimmte biologische Reaktionen26,27zu identifizieren. Dieses Protokoll verwendet ein Zellzyklus Weg-spezifischen Antikörper Microarray, die Ausdruck Änderungen in ~ 60 Genen zwischen behandelten und unbehandelten Zellen erkannt. Vorsicht ist geboten bei der Waschschritte um sicherzustellen, dass der Prozess gründlich durchgeführt wurde und das Hintergrundsignal zu minimieren. Darüber hinaus sollten die Folien bis zum Abschluss des Experiments nicht trocken werden.

Im Gegensatz dazu analysiert RNA Sequenzierung Quantitative gen Ausdrücke mehrere Gene, auf der Ebene der Transkription. Die deutlich große Zahl der untersuchten Gene (> 18.000 für RNA-Seq vs. 60 für Microarray) ermöglicht die simultane Analyse von mehreren Bahnen und molekulare Targets und mit höherer Genauigkeit. Diese umfassende Analyse ist wichtig, da eine einzelne MiRNA binden und verschiedene mRNAs gezielt kann. Im Gegensatz dazu ist die Pfad-Analyse einer großen Anzahl von gen Regulationsstörungen von Natur aus schwierig. Zum Beispiel obwohl die RNA-Sequenzierung unsere qPCR Daten bezüglich CDK1 und CDK4/6 Herabregulation aufgrund der MiRNA-Behandlung bestätigt, die Analyse auch Angaben auf Tausende von Genen, die auch unten waren- oder Up-geregelt. Um Kontext für diese zahlreichen gen Regulationsstörungen bereitzustellen, wurde Weg-Analyse-Software zur Gesamtwirkung der Behandlung auf verschiedene Weg und Zellfunktionen zu bestimmen. Vorläufig, sofern die Software Partituren Vertreter (positive Z-Score) Aktivierung oder Inaktivierung (negative Z-Score) von bestimmten Funktionen oder Wege sowie statistische Signifikanz der Analyse (Abbildung 5)28.

Zusammenfassend ist die Untersuchung der MiRNA-Aktivität eine anspruchsvolle Verfahren. Die inhärente Fähigkeit der MiRNAs, mehrere Gene beeinflussen erfordert die Nutzung von mehreren aufwendigen und komplizierten analytischen Methoden, mögliche Aktivitäten zu erkennen. Nicht überraschend, ist weitere Arbeiten erforderlich, um die Aktivitäten von MiR-143 und MiR-506 bei Lungenkrebs voll und ganz verstehen.

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Disclosures

Die Autoren möchte John Caskey an der Louisiana State University für seine Hilfe auf der Pfad-Analyse der RNA Sequenzierungsdaten und der University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott nächste Generation Sequenzierung Kern für anerkennen die RNA Sequenzierung und Daten Analyse durchzuführen. Diese Forschung wurde durch das College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe Anschubfinanzierung und der National Institute of Health (NIH) durch das nationale Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaft Zuschüsse 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 unterstützt.

Acknowledgments

Keine Interessenkonflikte werden erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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Tags

Cancer Research Ausgabe 145 Transfektion MiRNA Lungenkrebs Zellzyklus Apoptose Angiogenese RNA-Sequenzierung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese
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Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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