Summary
이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.
Abstract
세포 외 기계적 변형은 세포 표현 형 반응을 유도 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 조직 시스템에서 생리 적 관련성을 갖는다. 생 화 확 적인 분석을 통해 시험관 내 세포 집단에 적용 된 세포 외 인장 균 주의 효과를 포착 하기 위해, 장치는 이전에 간단 하 게 제작 될 수 있고 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 정도로 작아 설계 되었으며, 뿐만 아니라 상단에 현미경 단계. 그러나, 실록 하 층의 이전 디자인은 기름 침수 목표를 통해 고 분해능 세포 화상 진 찰을 허용 하지 않았습니다. 이 작업은 실록 하위 계층의 재설계 된 형상과 함께 적용 된 스트레인 하에서 라이브 셀의 고해상도 세포 이미징을 용이 하 게 할 수 있는 사용자 정의 이미징 설정을 설명 합니다. 이 하위 계층은 동일한 이전에 설계 된 장치와 함께 사용할 수 있으며, 따라서 고해상도 광학 이미징을 허용 하는 것 외에도 위에 나열 된 것과 동일한 이점이 있습니다. 실록 하 층의 설계는 스트레인의 적용 전후에 동일한 셀을 추적 하는 것을 용이 하 게 하는 그리드를 통합 함으로써 개선 될 수 있다. 대표적인 결과는 여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 포착 된 변형 된 세포 내에서 형광 표지 된 핵의 고해상도 타임 랩 스 이미징을 보여줍니다. 이러한 핵 역학 데이터는 적용 된 인장 변형이 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 하는 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
Introduction
바디에 있는 세포 그리고 조직은 장력 긴장을 포함 하 여 각종 기계적인 단서를 복종 됩니다. 그러나, 신경 세포의 생물학에 대 한 이러한 단서의 효과 아직 광범위 하 게 공부 하 고 완전히 이해 하지. 중추 신 경계에서 기계적 변형의 원인으로는발달 성장1,2,3,4, 척수 벤딩, 혈액 및 뇌 척 수액과 같은 생리 학적 과정이 포함 됩니다. 맥 동 및 외상, 축 삭 부 종, 신경 교 흉터 또는 종양 성장5,6,8과 같은 병리학 적 상태. 인장 변형이 oligodendrocytes의 분화와 축 삭의 후속 초 화에 영향을 미치는 방법을 조사 하는 것이 가치가 있다,이는 척추 동물 중추 신 경계에서 중요 한 과정 이다. 사용자 정의 설계 된 스트레인 디바이스와 엘라 스토 머 멀티 웰 플레이트를 사용 하 여, 이전 작품9,10 은 정적 일축 변형이 유전자 발현 의 글로벌 변화를 통해 oligodendrocyte 분화를 증가 시킬 수 있음을 보여주었다 10.이 세포에서 스트레인 기계 전달의 메커니즘에 대 한 이해를 돕기 위해, 이전 실험 장치는 여기에 기술 된 바와 같이 재설계 되어야 하며, 생활에서의 핵 역학의 고해상도 형광 이미징을 가능 하 게 합니다. 셀을 변형 합니다. 구체적으로는 단일 웰 실록 플레이트가 개발 되 고 이미징 구성이 재설계 되어 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 균 주 하에서 라이브 셀의 타임 랩 스 이미징이 가능 하도록 설계 되었습니다. 빛 통로에서 실록의 부정적인 광학적 효과를 없애기 위해, 세포는 실록 판을 거치지 않고, 거꾸로 위치 하 고, 커버 글래스를 통해 세포 구획을 덮는 것을 이미지화 한다. 이 새로운 이미징 디자인을 사용 하 여, 수백 개의 고해상도 타임 랩 스 영화가 기록 됩니다, 여기서 염색 질은 녹색 형광 단백질에 히스톤 H2B 태그에 의해 표시 되는, 온전한 부착 세포 내에서 개별 세포 핵. 이러한 영화는 인장 변형이 oligodendrocyte 분화의 진행과 일치 하는 크로마 틴 구조 및 역학의 변화를 유도 한다는 것을 증명 한다.
적용 된 스트레인 하에서의 살아있는 세포 화상 진 찰은 기술적으로 도전적이 고 현미경 시스템과 호환이 되는 장치 디자인이 필요 합니다. 여기에 설명 된 사용자 정의 디자인은 상업용 솔루션에 대 한 저렴 한 대안을 제시 합니다. 그것의 차원은 적용 한 긴장 도중 높은 공간 해결책에 있는 현미경 단계 및 살아있는 세포 화상 진 찰에 그것의 설치를 가능 하 게 합니다. 이미징 설정은 이미지 품질을 저하 시키는 실록 plate의 레이어를 거치지 않고 커버 글래스를 통해 가장 높은 선명도를 가진 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 라이브 셀 이미징이 가능 하도록 설계 되었으며 대부분의 경우 이미징 설정을 변형 합니다. 장치는 세포를 포함 하는 거치 된 격판덮개로, 또한 인큐베이터에서 쉽게 저장 될 수 있습니다. 이 장치는 부착 세포 배양을 용이 하 게 하 고 여러 날에 걸쳐 안정적이 고 균일 한 변형을 유지 하는 서브 지층에 일축 변형을 적용 하도록 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 설정은 균 주 하에서 다양 한 부착 세포 유형의 고해상도 이미징에 사용 될 수 있다, 그것은 세포 기계 생물학의 많은 분야에서 기계 전달 연구에 적용.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 고해상도 이미징을 위한 단일 웰 실록 금형 설계
참고: 실록 플레이트 제조용 몰드는 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 이미징을 가능 하 게 하 고 맞춤 제작 변형 장치 (그림 1a, B)에 정확 하 게 맞도록 다음과 같은 기능으로 설계 되었습니다.
- 스트레인 장치의 클램프에 맞도록 전체 플레이트 치수를 유지 합니다.
참고: 여기에는 60 mm x 73 mm입니다. - 적용 된 스트레인 동안 실록 plate의 고정 되지 않은 모서리에서 발생 하는 아크 (평면 외 굽 힘) 효과를 방지 하기 위해 전체 판의 측면 치수 보다 훨씬 작은 셀 컴파트먼트를 만드십시오.
참고: 여기에서 컴파트먼트는 23mm x 23mm 정사각형으로 설계 되었습니다. - 칸의 상단에 배치 된 커버 글래스를 통해 100 배 오일 침 지 렌즈에 초점을 맞추기 위해, 가능한 한 최소한 (80 µm)의 세포 구획의 깊이를 유지 하 되, 매체를 포함 하 고 접촉을 피하기 위해 충분히 충분 하 게 세포를 압박.
- 쉽게 초점을 가능 하 게 하기 위해 거꾸로 현미경 설정에서 렌즈에 가까이 세포를가지고, 3mm의 높이로 사각형에 셀 컴파트먼트를 올립니다.
주: 위의 기능을 가진 금형은 예를 들어, 밀링 알루미늄을 포함 하 여 많은 기술에 의해 제조 될 수 있다. 양자 택일로, 마스터 몰드는 또한 레이저 절단기로 절단 아크릴 시트를 사용 하 여 조립 될 수 있다, 셀 구획에 대 한 커버 유리 #0, 슈퍼 접착제. 이 마스터 몰드는 주조 수 지를 사용 하 여 작업 금형을 만드는 데 사용 되는 실록 인쇄물을 만드는 데 사용 됩니다.
2. 싱글 웰 실록 플레이트 및 스퀘어 컴파트먼트 제작
- 실록 베이스와 경화제를 일회용 컵에 20:1의 비율로 섞어 줍니다. 실록 플레이트 1 개를 만들기 위해 몰드 당 실록의 총 20g을 계량 하 고 150 mm 직경 플라스틱 접시 당 실록의 150 g (정사각형 수납칸 1 개를 만들기 위한).
- 30 분 (또는 모든 기포가 제거 될 때까지)에 0.8 bar의 진공 탈 기에서 실록 믹스를 남겨 주세요.
- 실록 믹스를 몰드 (플레이트 용) 또는 150 mm 플라스틱 접시에 붓 습니다 (정사각형 격실 용).
- 이 단계에서 추가 기포를 제거 하거나 (입으로) 공기를 불어 실록-0.8 바 진공에서 30 분 동안 다시 충전 된 몰드/접시를 탈 기 합니다.
- 2 시간 동안 레벨 링 테이블에 80 ° c 오븐에 금형/요리를 남겨 주세요.
- 조심 스럽게 오븐에서 몰드/접시를 제거 하 고 그들을 실 온으로 냉각 하자. 조심 스럽게 칼 날 (그림 1c)으로 가장자리를 절단 한 후 경화 된 실록를 벗 겨 냅니다.
- 150 mm 직경 실록에는 마커로 2cm x 2cm 그리드를 그립니다. 각 사각형 안에 1cm x 1cm의 정사각형을 그려 모든 면에 0.5의 여백을 남겨 둡니다. 블레이드를 사용 하 여 조심 스럽게 라인을 따라 절단 하 여 정사각형 구획을 얻습니다 (그림 2a).
- 4 시간 동안 아세톤 100%, 4 시간 동안 100% 에탄올을 배양 하 여 실록 플레이트/사각 구획을 청소 하 고 4 시간 동안 물에 멸 균을가 하였다.
- 150 mm 직경 플라스틱 접시 안에 파라핀 필름 백 페이퍼 (파라핀 필름을 제외한 종이)에 플레이트/스퀘어 컴파트먼트를 놓습니다 (그림 2c).
- 실록 플레이트를 80 ° c 오븐에 두고 4 시간 동안 건조 시킵니다.
- 실록 접시와 컨테이너 사각형을 포함 하는 150 mm 직경의 접시를 파라핀 필름과 밀봉 하 고, 추후 사용할 때까지 냉장 실에 보관 하십시오.
3. 실록 플레이트의 기능화
- 파라핀 필름을 제거 하 고, 플라스틱 접시의 커버를 제거 하 고, 실록 플레이트와 사각 구획을 자외선 아래에 30 분간 두십시오.
- 플라즈마 처리 (150에서 5 분 동안) 실록 플레이트 (셀 함이 위를 향하게 함)를 정사각형 구획이 없이 하 여 배양 표면을 친수성으로 만듭니다.
- 즉시 플라즈마 처리 된 표면 (그림 2b)에 사각형 구획을 배치 하 고 일시적으로 둘을 함께 막대기를 눌러.
참고: 플라즈마-사각형 구획을 처리 하지 마십시오, 또는 그렇지 않으면 그들은 실록 접시에 강하게 충실 하 고 이미징 하는 동안 벗 겨 해야 할 때 쉽게 떨어져 오지 않을 것 이다. - 200 µ L의 100 Mm(3 아미노 프로필) triethoxysilane을 첨가 하 여 실록 표면에 2 그룹을 소개 합니다 . 100 mM 용액을 만들려면 µ triethoxysilane의 순수한 (3 아미노 프로필)의 물 10ml를 녹여 서 234. 2 시간 배양 후, 우물 3 배를 탈 이온 수로 씻으십시오.
- 분자 가교 링커 bissulfosuccinimidyl의 2mg을 분 비 하 고 1M(4에틸) µ 술 폰 산 완충 액 (pH 8.0) 및 2.8 mL의 물 700에 용 해 시킨다.
참고: 200 (에틸) 4-1 piperazineethane 술 폰 산 완충 액에 1mm bissulfosuccinimidyl suberate 용액을 제공 합니다. 50 mM 농도 버퍼도 잘 작동 합니다.- 이 용액의 135 µ L을 추가 하 고 실 온에서 4 시간 동안 각각의 실록 플레이트에 fibronectin의 15µ L을 첨가 한다.
- 인산 완충 식 염 액으로 3 배 씻으십시오. 잘에 인산 완충 식 염 수 용액 500 µ L을 추가 합니다. 실록가 포함 된 150 mm 직경의 접시를 파라핀 필름과 함께 사용 하 여 냉장 실에 보관 하십시오.
4. 플라스틱 접시와 플라스 크의 기능화
- 폴 리 D-라이 신 (PDL, 멸 균 물)의 5 µ 용액으로 플라스틱 접시와 플라스 크를 1 시간 동안 배양 합니다. 35 mm 지름 접시 당 3ml(60 mm 지름 접시 당 3 mL, 75 cm 1 개당 10ml 당 1.5의이 용액 (리간드)을 첨가 합니다.
- 접시와 플라스 크 2 배를 멸 균 수로 씻으십시오.
- 그들을 1 시간 동안 (또는 건조 될 때까지) 생물학적 안전 캐비닛에서 건조 하 고 더 사용할 때까지 4 ° c에서 냉장 실에 보관 하십시오.
5. 뮤 린 oligodendrocyte 전구 세포에 대 한 증식 및 분화 배지
- 증식 및 분화 매체의 50 mL의 100 배 용액을 준비 하 고 2.5 mL의 분 취를 만들고-80 ° c에서 보관 하십시오.
참고: 증식 배지의 조성은 0.1 소 혈 청 알 부 민, 62 ng/mL 프로 게 스 테 론, µ µ/ml의 인슐린, 50 µ g/ml 홀로 트랜스 페 린, 5ng/m l-streptomycin, 10ng/ml의 혈소판 유래 성장 인자, 그리고 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 Dulbecco의 수정 된 독수리의 중간 (DMEM) 높은 포도 당과 피 루브 산은. 소 혈 청 알 부 민, 프로 게 스 테 론, 푸 트 레 시 네 및 나트륨 셀 렌 라이트는 구성 되 고 100 배, 인슐린, 홀로 트랜스 페 린 및 streptomycin에서 저장 될 수 있지만, 1x 용액을 준비 하면서 신선 하 게 첨가 되어야 한다. 성장 인자는 10 µ g/mL로 구성 되어야 하며 매일 세포에 신선 하 게 첨가 해야 합니다 (1 µ의 배지). 상기 분화 배지의 조성은 0.1 소 혈 청 알 부 민, 62 ng/mL의 프로 게 스 테 론, µ 50 µ µ, 5nml/ml 홀로 페 린, 5ng/ml의 셀 렌 티 오 나이트, 1 개 페니실린 streptomycin, 400 ng/ml 트리 요오드 티로 네, 400 ng/ml L-티 록 신 및 0.5%의 태아 소 혈 청 DMEM 높은 글루코스 및 피 루브 산은. 트리 요오드 티로 닌과 L-티 록 신을 다른 시 약과 함께 구성 하 고 100 배까지 보관할 수 있습니다. 1x 솔루션을 준비 하는 동안 인슐린, 홀로 트랜스 페 린 및 페니실린 streptomycin을 새로 추가 해야 합니다. - 100 배 증식 배지 50 mL를 제조 하기 위해, dulbecco의 배지 17ml에 소 혈 청 알 부 민과 310 µ g의 프로 게 스 테 론 510 mg을 µ의 배지, 500 µ L의 Dulbecco의 µ에 있는 퓌 레 시 네의 80 mg, 10µ L의 Dulbecco의 배지 , 전체 DMEM 최대 50 mL
- 분화 배지의 100 배 용액 50 mL를 준비 하는 경우, 수산화 나트륨의 40 µ의 트리 요오드 티로 닌 2 mg을 추가로 용 해 하 고, 수산화 나트륨의 40 µ l의 L-티 록 신 2 mg을 사용 하 여이 용액을 Dulbecco의 배지를 가진 50 mL에 채워 준다. 멸 균 일회용 필터 유닛을 통해 용액을 걸러 내 고, 분 취 액을-80 ° c에 저장 한다.
- 1 배 증식/분화 배지의 250 ml를 준비 하는 경우, 홀로 트랜스 페 125 린의 12.5 mg을 가진 증식/분화 배지의 100 배 용액, µ의 10mg/ml 인슐린 및 100 배 페니실린 streptomycin의 2.5 ml를 2.5 섞어 줍니다. Dulbecco의 매체와 250 mL에 용액을 채우고 멸 균 일회용 필터 유닛을 통해 필터링 합니다.
참고: 성장 인자는 재구성 된 배지의 전체 배치가 아닌 신선 하 고 직접 세포 배양에 추가 되어야 합니다.
6. 세포 배양
- Oligodendrocyte 전구 세포가 증식 배지에 부유 하는 것으로 시작 한다. PDL이 코팅 된 플라스틱 표면 (접시 또는 플라스 크)에 35000 셀/cm2 의 밀도로이 셀을 시드하십시오 (섹션 4 참조). 플라스틱 층의 표면적의 10cm 당 3 mL에 증식 매체의 부피를 조절; 매체의 낮은 양은 표면 장력에서 생기는 세포 덩어리를 초래할 수 있고, 접시에 있는 매체의 높은 양은 액체 유출을 일으키는 원인이 될 수 있습니다.
- 성장 인자 (혈소판 유래 성장 인자 및 fibronectin 성장 인자)를 추가 하 여 매일 10 ng/mL에서 농도를 유지 하 고 대체 일에 증식 배지의 반을 변경 합니다.
- 셋째 날에는 부드러운 세포 분리 용액 (예: accutase)을 사용 하 여 플라스틱 표면에서 세포를 분리 합니다. 배지를 제거 하 고 인산 완충 식 염 액으로 1x를 씻고, 20cm2 영역 당 분리 용액 1 mL를 넣고 접시/플라스 크를 남겨 주세요. 10 분 동안 37 ° c에서 인큐베이터에서, 모든 세포가 분리 될 때까지 부드럽게 누릅니다 (현미경을 보면).
- 피 펫은 200 µ L 팁을 사용 하 여 덩어리를 단일 세포로 분해 하 고,이를 50 mL 튜브에 전달 하 고,이를 10 분 동안 0.2 x g 로 희석 하 고, 상층 액을 버리고, 1 mL의 총 부피를 만들기 위해 증식 배지에서의 펠 렛을 소생 시킨다. 세포 측정기를 사용 하 여 셀 수를 셉니다.
- Fibronectin-기능화 실록 플레이트를 세척 하 고, 세척 당 15 분간, 증식 배지를 사용 합니다.
- 실록 플레이트 당 종자 35000 세포를 700 µ L의 증식 배지.
- 그린 형광 단백질을 이용한 히스톤 H2B 라벨링을 위한 H2B-GFP의 플라스 미드 구조를 추가 합니다.
참고: 여기에서, 1.4 µ L의 셀 라이트 H2B-GFP BacMam2 형질 주입 믹스는 각 플레이트 (5만 세포 당 2 µ L)에 첨가 되었다. - 24 시간 후에는 실록 샘플을 일축 변형 장치 ( 그림 2d와 같이)에 늘일 수 있는 셀로 마운트합니다. 모든 샘플의 배지를 분화 배지로 변경 합니다.
- 샘플을 변형 하 여 스트레인이 없는 셀 구획 길이 (그림 3a)를 측정 하 고 스테이지 마이크로미터 나사를 돌려서 셀 구획 길이를 원하는 양 (예: 10%)으로 늘립니다 ( 그림 3b참조). 이미징 할 때까지 37 ° c에서 인큐베이터의 연신 및 미 뻗어 실록 샘플을 남겨 주세요.
7. 이미징
- 현미경을 켜십시오. 현미경 인큐베이터 온도를 37 ° c로 설정 합니다.
- 목표 포 탑이 나중에 접근 할 수 없기 때문에 사용 되는 목표 (100 배 기름 침수)를 중앙 위치에 가져온다. 목표를 풀고 목표 링 (그림 4a)과 함께 다시 나사로 고정 하 여 목표를 셀에 더 가깝게 만들 수 있습니다. 여기에서 오일 목표를 사용 하는 경우이 단계에서 오일 방울을 추가 하십시오.
- 3D 프린팅 이나 기계 가공을 통해 미리 합성 하 여 두 가지 중요 한 기능을 가진 플라스틱 또는 금속 홀더-각 진 창과 단계 (그림 4b).
주:이 창은 변형 장치가 반전 상태인 동안 매체를 보관할 두께 #0 유리 커버 슬립을 지원 합니다. 창 모서리 (그림 4d)의 각 진 컷은 목표를 유리 커버 슬립에 더 가깝게 할 수 있습니다. 홀더의 단계는 우리가 목표에 가까운 더 아래로 뻗어 실록을 가져올 수 있습니다. - 창 주변부에 진공 그리스를 분배 하 여 홀더 상단 표면에 유리 커버 슬립 (두께 #0, 25mm x 25mm 또는 직경 35)을 놓고 현미경 단계에 플라스틱 창을 테이프로 부착 합니다. ( 도 4D 및 도 5a)를 참조 한다.
- Z-평행 이동 스테이지를 현미경 스테이지에 돌려서 맨 위 z위치로 옮깁니다 (그림 5a).
- 이미지를 촬영 하 고 흰색 플라스틱 창에 유리 커버 슬립에이 매체를 추가 하는 뻗어 실록 플레이트에서 매체의 500 µ L을 제거 합니다.
- 조심 스럽게 실록 플레이트에서 사각 구획을 멸 균 핀셋으로 분리 하십시오.
- 스트레인 장치를 흰색 플라스틱 창 위쪽에 있는 수직 위치 (위로 향하게 하는 셀)에 잡고 유리 커버 슬립 (그림 5b)의 중간에 직접 여분의 매체가 떨어질 수 있도록 스트레인 장치를 조심 스럽게 뒤집습니다.
- 스트레인 디바이스의 하단 부분을 양면 테이프로 z평행 이동 스테이지에 배치 합니다 (그림 5c, D).
- 명시 야 아래에 접 안 렌즈를 통해 보면서, 천천히 (그림 5e) ( z-번역 단계를 낮춤 으로써) 스트레인 장치를가지고 셀에 초점을 목표를 이동 합니다.
- 이 단계를 단계적으로 매우 느리게 수행 합니다. 스트레인 장치가 커버 슬립에 너무 많이 누르면 셀이 압축 되어 (죽을 수 있음) 목표는 커버 슬립에 너무 많이 누르면 커버 슬립이 파손 되어 (매체가 누출 되 고 목표에 유출 될 수 있음).
- 실록 플레이트를 x및 y방향으로 스캔 하 여 형광 핵 (파장 여기에 488 nm의 형광 아래)과 적절 한 세포 형태학을 가진 세포를 찾으십시오 (명시 야에서).
- 현미경 단계의 횡 방향 변위가 너무 많은 수직 초점에 영향을 미치지 않으면 소프트웨어의 다중 포인트 기능을 사용 하 여 여러 관심 영역을 선택 합니다. 때로는 초점이 스테이지의 횡 변위에 매우 민감합니다. 이러한 경우 한 번에 하나의 셀을 이미지 합니다. 관심 있는 각 셀의 x, y및 z위치를 표시 합니다.
- 488 nm의 파장 여기를 가진 핵의 와이드 필드 (또는 오픈 핀 홀) 이미지를 기록 하 고 프레임 당 30 초 간격으로 명시 야가 있는 셀을 사용 하 여 전체 지속 시간을 30 분 이상으로 기록할 수도 있습니다.
8. 데이터 분석
-
핵 변동
- 이미지 분석 소프트웨어에서 핵 이미지의 시퀀스를 열고 (그림 6a) 핵 시간 경과 이미지를 임계 값 (예를 들어, Imagej에서 임계 명령을 사용 하거나 소프트웨어 MATLAB에서 그레이 트로 쉬 명령).
- 시간 함수로 서 핵 영역 (픽셀)을 가져와 서 데이터 플로팅 소프트웨어 (그림 6b)에 플로팅하 고 3 차 다항식을 데이터에 피팅 합니다 (예를 들어, 분석 사용 하기 | 피팅 | 원점에 있는 다항식 맞춤 명령 또는 소프트웨어 MATLAB의 polyfit 명령).
- 각 시점에 대 한 실제 영역 (픽셀)에서 피팅 된 다항식의 값을 뺍니다. 이 수정 된 영역을 잔여 영역 이라고 합니다.
참고:이 프로세스는 악기 오류에서 오는 데이터의 증가 또는 감소 추세를 제거 하 고 디 추세 라고 합니다.- 각 시간 지점의 잔여 영역을 해당 시점에서 피팅 된 다항식의 값으로 나누어 잔여 면적의 백분율을 계산 합니다 (그림 6d).
- 잔여 면적 시계열의 표준 편차를 계산 합니다. 이 표준 편차는 핵 변동의 진폭을 나타냅니다.
-
데이터 플로팅 및 통계 분석
- 조건 당 최소 20 개의 핵의 평균으로 핵 변동의 진폭을 계산 합니다.
- Bonferroni 니 수정으로 단방향 분석 분산 통계 테스트를 수행 하 여 변동의 진폭에 중요 한 차이가 있는지 여부 (예: 스트레인이 적용 되는 경우와 포함 되지 않음)를 결정 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
최근의 작업은 oligodendrocytes에서 인장 변형의 영향을 조사 하기 위한 것으로, 10% 일축 인장 변형이 유전자 발현의 전 세계적 변화에 의해 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 한다는 것을 보여주었다. 유전자 발현에서 이러한 변화 뒤에 메커니즘은 세포 골격 구조, 전사 인자 국 소화, 핵 역학 및 염색 질 조직과 같은 세포 성 파라미터의 이미징을 통해 프로브 할 수 있습니다. 그러나 실록 하위 계층의 이전 형상은 고해상도 단일 셀 이미징을 허용 하지 않았습니다. 이 작품에서 설명한 바와 같이, 실록 하 층의 재설계 된 형상과 이미징 셋업이 셀과 대물 렌즈 사이의 거리를 최소화 했습니다. 이를 통해 100 배 오일 침 지 목적을 사용 하 여 형광 표지 된 세포 핵의 타임 랩 스 이미지를 캡처할 수 있습니다 (그림 6a).
핵 투영 영역의 변동은 세포의 분화 상태에 따라11,12. Oligodendrocyte 전구 세포의 핵 변동과 말기 분화 된 oligodendrocytes의 비교는 후자는 상당히 낮은 변동을 보였다 (그림 6E). 다음으로, oligodendrocyte 전구 세포의 핵 동요는 1 시간, 24 시간 및 48 시간에 10% 인장 변형 률을 가지 지 않고 분화 된 후 화학적 인 유도를 비교 하였다. 화학 유도 단독으로, 핵 변동의 진폭은 48 h에서 상당한 감소를 보였다 하지만 24 시간 (그림 6f). 한편, 10% 인장 스트레인과 함께 화학적 유도는 24 시간에 상당한 감소를 보였고,이는 48 h에서 더 이상 감소 하지 않고 일정 하 게 유지 되었다 (그림 6g).
이 문서에 설명 된 하 층 기하학과 이미징 구성은 변형 된 셀의 고해상도 동영상을 기록 하는 것을 가능 하 게 했습니다. 이러한 영화의 후속 분석은 변형이 분화의 표식 인 핵 변동의 완충을 서둘러 한다는 것을 입증 했습니다. 이러한 결과는 변형이 oligodendrocyte 분화를 촉진 하는 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 이러한 결과 및 향후 실험의 해석에 대 한 추가 논의는 Makhija 외13에 설명 되어 있다.
그림 1: 디자인 및 기하학 실록 몰드. (A) 모든 치수를 밀리미터 단위로 표시 하는 금형의 스케치 (이 스케치는 Whits 기술, 싱가포르에 의해 생성 된). (B) 몰드의 입체 뷰 (마크 히 자 외11) 삽입은 몰드의 사진을 보여줍니다. (C) 상기 몰드를 이용 하 여 제작 된 실록 판의 입체 뷰 (마 히 자 외11). 삽입은 실록 판의 사진을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 샘플 준비. (A) 실록 판과 사각 칸의 사진. (B) 사각 칸은 실록 판의 올려진 정사각형 위에 놓입니다. 그 목적은 세포에 대 한 매체를 포함 하는 것입니다. (C) 실록 플레이트는 실록가 플라스틱에 붙지 않도록 파라 필름 용지를 사용 하 여 150 mm 직경 플라스틱 접시에 저장 됩니다. (D) 플레이트를 스트레인 장치에 장착 하는 동안 플레이트의 처지를 방지 하기 위해 두 손가락을 사용 하 여 바닥에서 지지 하십시오. 장착 후에도 플레이트가 약간 약간 강하 하면, 변환 단계를 돌려 스트레인 디바이스 암 사이의 거리를 늘립니다. 이 단계에서, 스테이지의 번역은 실록 판에 스트레인을 유도 해서는 안 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세포 스트레칭. (A) 눈금자를 사용 하 여 클램프 사이의 플레이트의 초기 길이를 측정 합니다. (B) 번역 단계에서 스크류를 돌려서 플레이트를 늘려 원하는 비율로 초기 플레이트 길이를 늘립니다. X% 길이의 증가는 변형의 X%에 해당 합니다. 원하는 변형을 생성 하려면 (X%) 올려진 세포 배양 실에서, 주 판은 더 높은 양으로 긴장 되어야 합니다 (약 2 배%) 설명 된 판 형상에서 두께의 차이로 인해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 이미징 준비. (A) 터렛의 중앙 위치에 100 배 목표를 가져오고 목표를 풀고 목표 링과 함께 다시 조입니다. (B) 모든 치수를 밀리미터 단위로 표시 하는 홀더의 스케치. (C) 피 펫 팁을 사용 하 여 창의 주변부에 진공 그리스를 확산 하 고 상단에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 100 배 오일 침 지 렌즈에 초점을 맞추기 위해 두께 #0 또는 #1 있는 커버 글래스를 사용 하십시오. (D) 상기 홀더 (1)를 현미경 단계 (2)에 배치 한다. 오일 (6)을가지고 홀더에 붙어 있는 커버 슬립 (5)에 가깝게 진공 그리스를 사용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 현미경의 이미징 설정 (A) z평행 이동 단계 (노란색 화살표)와 홀더 (빨간색 화살표)를 현미경 단계에 어셈블합니다. (B) 스트레인 장치를 현미경 단계에 기울여 홀더의 유리 커버 슬립에 임의의 매체가 떨어 트리 게 합니다. Z-평행 이동 스테이지에 부착 되는 스트레인 장치에 양면 테이프 (파란색 화살표)를 붙입니다. (C) 스트레인 장치를 z-평행 이동 단계에서 지 원하는 반전 된 위치에 놓습니다. 셀은 플라스틱 홀더의 유리 커버 슬립과 정렬 되어야 합니다. (D) 스트레인 장치의 역 기하학은 세포와 대물 렌즈 사이의 거리를 최소화 하 여 고해상도 이미징 (Makhija 외11)을 촉진 시킨다. (E) 스트레인 장치를 아래로 가져 오기 전에 사이드 뷰 (1); 스트레인 장치를 아래로 가져와 서 측면 보기 (2); 스트레인 장치를 아래로 가져와 서 위로 보기 (3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 핵의 대표 이미지 및 영역 변동 데이터. 이 수치는 막 히 자 외11에서 적응 한다. (A) 녹색 형광 단백질에 태그 된 히스톤 H2B로 표지 된 핵의 전형적인 심상, 및 분화 oligodendrocyte 전구 세포. 핵은 초점이 있고, 세포 프로세스는 초점이 맞지 않습니다. (B) 핵 영역의 전형적인 시계열 (픽셀 단위). (C) 3 차 다항식이 데이터에 피팅 됩니다. (D) 잔여 면적 변동 시계열의 퍼센트. (E) oligodendrocyte 전구 세포의 증식과 말기 분화 oligodendrocytes의 핵에 지 변동. (F) 1 시간, 24 시간 및 48에서의 핵에 지 변동은 스트레인 없이 화학적으로 분화 됩니다. (G) 1 시간, 24 시간 및 48의 원자력 지역 변동은 10% 인장 변형 률로 화학 분화를 촉진 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
장치는 이전에 부착 세포에 세포 외 인장 긴장의 응용 프로그램을 위해 설계 되었습니다. 그 일에 있는 실록 하 층의 디자인은 생화학 분석을 위해 충분 했습니다, 기지개 한 세포의 저해상도 화상 진 찰 뿐 아니라. 이 작품에서, 하 층은 재설계 되었고, 고해상도의 세포 성 살아있는 세포 이미징을 용이 하 게 하는 새로운 이미징 구성이 도입 되었다. 이 시스템의 장점은 여러 가지가 있습니다: 간단한 구성 요소를 사용 하 여 실험실에 내장 할 수 있으며 상업용 변형 장치 (셀 변형 장치 당 500 USD)에 비해 저렴 하며 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 만큼 작습니다. 현미경. 더욱이, 상기 이미징 시스템은 도립 현미경 설정으로 여기에 설명 되었지만, 직 립 현미경 구성을 위해 용이 하 게 조절 될 수 있다.
샘플 준비 및 이미징에 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째로, 실록 격판덮개와 사각 격실은 세포 생존을 지키기 위하여 세포 시 딩 (프로토콜 단계 2.8) 전에 철저히 청소 되어야 합니다 (비 경화 실록 세포에 유독 함). 둘째, 사각 칸 내부에 들어갈 수 있는 유체 매체의 부피가 1 mL 미만이 기 때문에, 시료가 며칠 동안 인큐베이터에 있으면 증발 될 수 있다. 따라서, 매체는 매일 검사 하 고 필요할 때 보충 해야 합니다. 추가적으로, 실록 격판덮개에 올려진 지역은 증발을 극소화 하기 위하여 반전 된 60 mm 직경 플라스틱 접시로 엄호 될 수 있습니다. 셋째, 현미경의 스트레인 장치를 z-평행 이동 단계를 통해 아래로 움직여 셀을 유리 커버 슬립에 더 가깝게 하는 동안 극도의 주의를 기울여야 합니다. 실록 하 층과 유리 커버 슬립 사이의 세포 (모멘트에도)를 압축 하면 세포 사 멸이 발생할 수 있습니다. 넷째, 죽은 세포와 세포 파편은 실록 샘플이 제거 된 후에 유리 커버 슬립에 붙어 남아 있을 수 있습니다. 따라서 이미징 후에는 유리 커버 슬립을 진공 그리스에서 뽑아 내 고 새 샘플을 장착 하기 전에 새로운 커버 슬립을 부착 해야 합니다.
스트레인 디바이스의 한계는 스테이지 측면 변위의 적용이 주기적인 또는 램프 형 스트레인을 수행 하도록 프로그램 될 수 없고 일축 변형만을 적용할 수 있다는 것입니다. 설명 된 기하학에서 실록 하 층의 제한은 균 주가 25% 보다 높게 되어 실록의 골절을 유발할 수 있다는 것 이다.
실록 하 층의 설계를 개선 하기 위한 미래 변형은 세포 배양 표면에 격자를 혼 입 시킬 수 있었다. 이를 통해 인장 변형의 적용 전후에 동일한 셀을 추적할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
모든 저자는 연구 및 기술 (스마트) 바이오 시스템 및 마이크로 역학 연구 그룹에 대 한 싱가포르-MIT 얼라이언스를 통해 싱가포르 국립 연구 재단의 자금 지원을 기꺼이 인정 합니다. 저자, 야기 엘 스 카 박사와 반 블 릿 박사는 또한 Saks-카바 나 프 재단의 기금과 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 저자는이 작품에 설명 된 몇 가지 실험에 대 한 쥐 oligodendrocyte 전구 세포를 제공 하기 위해, 싱가포르 난 양 기술 대학교에서 윌리엄 Ong 박사 노래 Yian 씹는 감사 합니다, 저자는 박사 g. v. Shivashankar 감사 원자력 지역 변동에 대 한 논의에 대 한 싱가포르, 싱가포르의 국립 대학, 기계 생물학 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
