Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale
Summary
À l’aide d’un dispositif conçu antérieurement pour appliquer une déformation mécanique aux cellules adhérentes, cet article décrit une géométrie de substrat redessinée et un appareil personnalisé pour l’imagerie à une seule cellule à haute résolution de cellules tendues avec un objectif d’immersion en huile de 100 x.
Abstract
La souche mécanique extracellulaire est connue pour susciter des réponses phénotypiques cellulaires et a une pertinence physiologique dans plusieurs systèmes tissulaires. Pour capter l’effet de la déformation extracellulaire appliquée sur les populations cellulaires in vitro via des dosages biochimiques, un dispositif a déjà été conçu qui peut être fabriqué simplement et est assez petit pour s’adapter à l’intérieur des incubateurs de culture tissulaire, ainsi que sur le dessus de étapes du microscope. Cependant, la conception antérieure du substrat de polydiméthylsiloxane n’autorisait pas l’imagerie subcellulaire à haute résolution par des objectifs d’immersion en huile. Ce travail décrit une géométrie redessinée du substrat de polydiméthylsiloxane et une configuration d’imagerie personnalisée qui, ensemble, peut faciliter l’imagerie sous-cellulaire à haute résolution des cellules vivantes pendant la déformation appliquée. Ce substrat peut être utilisé avec le même appareil conçu précédemment et, par conséquent, a les mêmes avantages que énumérés ci-dessus, en plus d’autoriser l’imagerie optique haute résolution. La conception du substrat de polydiméthylsiloxane peut être améliorée en incorporant une grille qui facilitera le suivi de la même cellule avant et après l’application de la souche. Les résultats représentatifs démontrent une imagerie en accéléré à haute résolution des noyaux marqués fluorescemment dans les cellules tendues capturées à l’aide de la méthode décrite ici. Ces données sur la dynamique nucléaire donnent un aperçu du mécanisme par lequel la souche de traction appliquée favorise la différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes.
Introduction
Les cellules et les tissus dans le corps sont soumis à divers indices mécaniques, y compris les souches de traction. Cependant, les effets de ces indices sur la biologie des cellules neuronales n’ont pas encore été étudiés de manière exhaustive et pleinement compris. Dans le système nerveux central, les sources de déformation mécanique comprennent la croissance du développement1,2,3,4, les processus physiologiques tels que la flexion de la moelle épinière, le sang et le liquide céphalo-rachidien pulsations, et pathologies telles que traumatisme, gonflement Axon, cicatrices gliales, ou croissance tumorale5,6,7,8. Il est intéressant d’étudier comment la déformation de la traction affecte la différenciation des oligodendrocytes et la myélination subséquente des axones, qui est un processus critique dans le système nerveux central des vertébrés. À l’aide d’un dispositif de déformation conçu sur mesure et de plaques multipuits en élastomère, les travaux antérieurs9,10 ont montré que la souche uniaxiale statique peut augmenter la différenciation des oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes 10. pour mieux comprendre les mécanismes de la mécanotransduction de la souche dans ces cellules, l’appareil expérimental précédent doit être redessiné comme décrit ici, pour permettre l’imagerie par fluorescence à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les conditions de vie cellules sous tension. Plus précisément, une plaque de polydiméthylsiloxane à un seul puits est développée et la configuration d’imagerie est redessinée pour permettre l’imagerie en accéléré des cellules vivantes sous contrainte à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x. Pour éliminer les effets optiques négatifs du polydiméthylsiloxane dans la voie de la lumière, les cellules sont imagées non pas par la plaque de polydiméthylsiloxane, mais dans la position inversée, à travers le verre de couverture couvrant le compartiment cellulaire. Grâce à cette nouvelle conception d’imagerie, des centaines de films en accéléré à haute résolution sont enregistrés, de noyaux cellulaires individuels dans des cellules adhérentes intactes, où la chromatine est étiquetée par le marquage de l’histone H2B à la protéine fluorescente verte. Ces films démontrent que la déformation par traction induit des changements dans la structure et la dynamique de la chromatine qui sont compatibles avec la progression de la différenciation des oligodendrocytes.
L’imagerie cellulaire en direct sous contrainte appliquée est techniquement difficile et nécessite une conception d’appareil compatible avec le système de microscope. La conception personnalisée décrite ici présente une alternative peu coûteuse aux solutions commerciales. Ses dimensions permettent son installation sur les stades du microscope et l’imagerie cellulaire en direct à haute résolution spatiale pendant la déformation appliquée. La configuration d’imagerie est conçue pour faciliter l’imagerie cellulaire en direct à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x avec la plus grande clarté, à travers le verre de couverture, pas par la couche de la plaque de polydiméthylsiloxane qui, autrement, diminue la qualité de l’image et est commune dans la plupart configurations d’imagerie sous tension. L’appareil, avec une plaque montée contenant des cellules, peut également être stocké facilement dans l’incubateur. Cet appareil est conçu pour appliquer une souche uniaxiale à des substrats qui facilitent la culture de cellules adhérentes et maintiennent une souche stable et uniforme sur plusieurs jours. La configuration décrite ici peut être utilisée pour l’imagerie haute résolution de divers types de cellules adhérentes sous contrainte, ce qui le rend applicable aux études de mécanotransduction dans de nombreux domaines de la mécanobiologie cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositif a déjà été conçu pour l’application de souches de traction extracellulaires sur les cellules adhérentes. La conception du substrat du polydiméthylsiloxane dans ce travail était suffisante pour les dosages biochimiques, ainsi que pour l’imagerie à basse résolution des cellules étirées. Dans ce travail, le substrat a été remanié, et une nouvelle configuration d’imagerie qui facilite l’imagerie cellulaire sous-cellulaire à haute résolution a été introduite. Le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tous les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de la Fondation nationale de la recherche de Singapour par l’entremise du groupe de recherche interdisciplinaire de l’Alliance pour la recherche et la technologie (SMART) BioSystems et micromécanique (BioSyM) de Singapour-MIT. Les auteurs Dr. Jagielska et van Vliet reconnaissent également avec gratitude le financement et le soutien de la Fondation Saks-Kavanrire. Les auteurs remercient William ONG et le Dr Sing Yian Chew de l’Université technologique de Nanyang, à Singapour, pour avoir fourni des cellules progénitrices d’oligodendrocytes de rat pour certaines expériences décrites dans ce travail, et les auteurs remercient le Dr G. V. Shivashankar de Institut de mécanobiologie, Université nationale de Singapour, Singapour, pour les discussions sur les fluctuations des zones nucléaires.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
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| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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