ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח
Summary
באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.
Abstract
זן מכני מכניים ידוע לעורר תגובות פנוטיות תאים והוא בעל רלוונטיות פיזיולוגית במספר מערכות רקמה. כדי ללכוד את ההשפעה של מאמץ מתיחה שימושית הלחץ על אוכלוסיות תאים בתוך מבחנה באמצעות ביוכימיים הביוכימי, המכשיר תוכנן בעבר אשר יכול להיות מפוברק פשוט הוא קטן מספיק כדי להתאים בתוך מחממות התרבות רקמות, כמו גם על גבי שלבי המיקרוסקופ. עם זאת, העיצוב הקודם של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane לא אפשרו הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות טבילה בשמן. עבודה זו מתארת את הגיאומטריה המחודש של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ואת הגדרת הדמיה מותאמת אישית כי ביחד יכול להקל על הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה של תאים חיים בעוד תחת לחץ מוחל. ניתן להשתמש ברובד משנה זה עם אותו התקן מעוצב מוקדם יותר, ומכאן, יש יתרונות זהים לאלה המפורטים לעיל, בנוסף להתרת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ניתן לשפר על ידי שילוב של רשת אשר להקל על מעקב אחר אותו תא לפני ואחרי היישום של זן. תוצאות הנציג להפגין ברזולוציה גבוהה לפקיעה זמן הדמיה של גרעיני בעלי תווית בתוך תאים מתוחים שנתפסו באמצעות השיטה המתוארת כאן. נתונים אלה הדינמיקה הגרעינית לתת תובנות לתוך המנגנון שבו לחץ מתיחה להחיל מקדם הבידול של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון.
Introduction
תאים ורקמות בגוף חשופים רמזים מכניים שונים, כולל זנים מתיחה. עם זאת, ההשפעות של רמזים אלה על ביולוגיה של תאים עצביים עדיין לא נחקרו בהרחבה והבינו באופן מלא. במערכת העצבים המרכזית, מקורות זן מכני כוללים צמיחה התפתחותית1,2,3,4, תהליכים פיזיולוגיים כגון כיפוף חוט השדרה, דם ונוזל שדרתי ומצבים פתולוגיים כגון טראומה, הנפיחות אקסון, הצטלקות גליה, או צמיחה הגידול5,6,7,8. כדאי לחקור כיצד זן מתיחה משפיע על הבידול של oligodendrocytes הפוך ואת מיאלואידית הבאים של אקסונים, שהוא תהליך קריטי במערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות. באמצעות מותאם אישית מעוצב המכשיר מאמץ ולוחיות אלסטומרים multiwell, העבודות הקודמות9,10 הראו כי זן סטטי של היחידה יכול להגדיל בידול באמצעות שינויים גלובליים ביטוי גנטי 10. כדי להשיג הבנה נוספת של המנגנונים של מנגנון הלחץ בתאים אלה, המנגנון הנסיוני הקודם חייב להיות מחדש כמתואר כאן, כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של קרינה פלואורסצנטית של דינמיקה גרעינית בחיים תאים תחת לחץ. באופן ספציפי, צלחת בודדת polydiמתיל siloxane מפותחת, ואת התצורה הדמיה מחדש כדי לאפשר את הדמיה בזמן לפקיעה של תאים חיים תחת זן באמצעות עדשת השמן 100x טבילה. כדי לחסל את ההשפעות האופטיות השליליות של polydiמתיל siloxane במסלול האור, התאים הם התמונה לא דרך הצלחת polydiמתיל siloxane, אבל בתנוחה הפוכה, דרך הזכוכית לכסות כיסוי תא התא. באמצעות עיצוב זה הדמיה חדשה, מאות ברזולוציה גבוהה הזמן לפקיעה סרטים נרשמות, של גרעיני תא בודדים בתוך תאים חסיד שלמים, שם כרומטין מתויג על ידי תיוג היסטון H2B לחלבון פלורסנט ירוק. סרטים אלה מדגימים כי זן מתיחה גורם שינויים מבנה כרומטין ודינמיקה כי הם עקביים עם ההתקדמות של אוליגודנדרוציטים בידול.
הדמיה של תאים חיים תחת זן שימושית היא מאתגרת טכנית ודורש עיצוב המכשיר תואם את מערכת המיקרוסקופ. העיצוב המותאם אישית המתואר כאן מציג חלופה זולה לפתרונות מסחריים. מימדים שלה לאפשר ההתקנה שלה על שלבי מיקרוסקופ לחיות הדמיה של התא ברזולוציה מרחבית גבוהה במהלך מאמץ להחיל. ההתקנה הדמיה נועד להקל על הדמיית תאים חיים באמצעות עדשת השמן 100x טבילה עם הבהירות הגבוהה ביותר, דרך זכוכית העטיפה, לא דרך השכבה של צלחת polydiמתיל siloxane אשר אחרת מקטין את איכות התמונה נפוצה ביותר כיוונוני הדמיה תחת לחץ. המכשיר, עם צלחת רכוב המכיל תאים, ניתן גם לאחסן בקלות בחממה. התקן זה נועד להחיל זן uniaxial כדי שכבות להקל על תרבות התא מחסיד ולשמור על מאמץ יציב ואחיד על פני ימים מרובים. ההתקנה המתוארת כאן יכולה לשמש עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של סוגי תאים שונים החסיד מתחת ללחץ, מה שהופך אותו לרלוונטי ללימודי מכניזציה בתחומים רבים של תא מכניאוביולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המכשיר בעבר1 תוכנן עבור היישום של מתיחה לחילוץ מאמץ על תאים חסיד. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane בעבודה הזאת היה מספיק עבור ביוכימיים, כמו גם הדמיה ברזולוציה נמוכה של תאים נמתח. בעבודה זו, עוצב מחדש שכבת המשנה, ותצורה של הדמיה מקורית המסייעת להדמיית תאים משנית ברזולוציה גבו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל המחברים בהכרת תודה מימון תמיכה מתוך קרן המחקר הלאומי של סינגפור דרך הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה (SMART) BioSystems ו Micromechanics (BioSyM) קבוצת מחקר רב-תחומי. המחברים ד ר ג’יאלאסקה וד ר ואן ולליט גם מממנים בהכרת תודה ותמיכה מקרן סאקס-קאבוונוב. המחברים מודים לוויליאם אונג וד ר סינג יאנאן ללעוס מהאוניברסיטה הטכנולוגית של נניאנג, סינגפור, למתן תאים אוליגודנדרוציטים בחולדות לניסויים מסוימים המתוארים בעבודה זו, והמחברים מודים לד ר ג. ושואשאני מ מכון מכונאי, האוניברסיטה הלאומית של סינגפור, סינגפור, לדיונים על תנודות באזור הגרעיני.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
