Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale
Summary
Utilizzando un dispositivo progettato in precedenza per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti, questo documento descrive una geometria del substrato ridisegnata e un apparato personalizzato per l’imaging a cella singola ad alta risoluzione delle cellule tese con un obiettivo di immersione in olio 100x.
Abstract
Ceppo meccanico extracellulare è noto per suscitare risposte fenotipiche cellulari e ha rilevanza fisiologica in diversi sistemi tissutali. Per catturare l’effetto dello sforzo di trazione extracellulare applicato sulle popolazioni cellulari in vitro attraverso saggi biochimici, un dispositivo è stato precedentemente progettato che può essere fabbricato semplicemente ed è abbastanza piccolo da adattarsi all’interno di incubatori di coltura tissutale, così come sopra fasi del microscopio. Tuttavia, il precedente disegno del substrato di polidimetilsilossano non ha consentito l’imaging subcellulare ad alta risoluzione attraverso obiettivi di immersione in olio. Questo lavoro descrive una geometria ridisegnata del substrato di polidimetilsilossano e una configurazione di imaging personalizzata che insieme può facilitare l’imaging subcellulare ad alta risoluzione delle cellule vive mentre è sotto sforzo applicato. Questo substrato può essere utilizzato con lo stesso dispositivo progettato in precedenza e, quindi, ha gli stessi vantaggi di cui sopra, oltre a consentire l’imaging ottico ad alta risoluzione. Il design del substrato di polidimetilsilossano può essere migliorato incorporando una griglia che faciliterà il tracciamento della stessa cellula prima e dopo l’applicazione della deformazione. I risultati rappresentativi dimostrano l’imaging time-lapse ad alta risoluzione di nuclei con etichetta fluorescente all’interno di cellule tese catturate utilizzando il metodo descritto qui. Questi dati di dinamica nucleare forniscono approfondimenti sul meccanismo mediante il quale la deformazione a trazione applicata favorisce la differenziazione delle cellule progenitrici dell’oligodendrocyte.
Introduction
Cellule e tessuti nel corpo sono sottoposti a vari spunti meccanici, compresi i ceppi di trazione. Tuttavia, gli effetti di questi spunti sulla biologia delle cellule neurali non sono ancora stati studiati ampiamente e compresi completamente. Nel sistema nervoso centrale, le fonti di ceppo meccanico includono la crescita dello sviluppo1,2,3,4, processi fisiologici come piegatura del midollo spinale, sangue e liquido cerebrospinale pulsazioni e condizioni patologiche come trauma, gonfiore assone, cicatrici gliali o crescita tumorale5,6,7,8. Vale la pena di indagare su come la tensione di trazione influisce sulla differenziazione degli oligodendrociti e sulla successiva mielinazione degli assoni, che è un processo critico nel sistema nervoso centrale dei vertebrati. Utilizzando un dispositivo di deformazione personalizzato e piastre multipozzetto elastomeriche, i lavori precedenti9,10 hanno dimostrato che la deformazione uniassiale statica può aumentare la differenziazione dell’oligodendrocyte attraverso cambiamenti globali nell’espressione genica 10. per ottenere un’ulteriore comprensione dei meccanismi di meccanotrasduzione della deformazione in queste cellule, il precedente apparato sperimentale deve essere ridisegnato come descritto qui, per consentire l’imaging a fluorescenza ad alta risoluzione delle dinamiche nucleari in vita cellule sotto sforzo. In particolare, viene sviluppata una piastra di polidimetilsilossano monopozzetto e la configurazione di imaging è ridisegnata per consentire l’imaging time-lapse di cellule vive sotto sforzo utilizzando una lente di immersione a olio 100x. Per eliminare gli effetti ottici negativi del polidimetilsilossano nel percorso della luce, le cellule vengono immagine non attraverso la piastra di polidimetilsilossano, ma nella posizione invertita, attraverso il vetro di copertura che copre il compartimento cellulare. Utilizzando questo nuovo design di imaging, vengono registrate centinaia di filmati time-lapse ad alta risoluzione, di singoli nuclei di cellule all’interno di cellule aderenti integre, dove la cromatina è etichettata mediante l’etichettatura dell’istone H2B in proteine fluorescenti verdi. Questi film dimostrano che la tensione di trazione induce cambiamenti nella struttura della cromatina e nelle dinamiche che sono coerenti con la progressione della differenziazione dell’oligodendrocyte.
L’imaging a cellule vive sotto sforzo applicato è tecnicamente impegnativo e richiede un design del dispositivo compatibile con il sistema del microscopio. Il design personalizzato qui descritto presenta un’alternativa economica alle soluzioni commerciali. Le sue dimensioni consentono l’installazione su stadi del microscopio e l’imaging delle cellule vive ad alta risoluzione spaziale durante la deformazione applicata. La configurazione dell’imaging è progettata per facilitare l’imaging delle cellule in tempo reale utilizzando una lente di immersione a olio 100x con la massima chiarezza, attraverso il vetro di copertura, non attraverso lo strato di piastra in polidimetilsilossano che altrimenti diminuisce la qualità dell’immagine ed è comune nella maggior parte configurazioni di imaging sotto sforzo. Il dispositivo, con una piastra montata contenente celle, può anche essere conservato facilmente nell’incubatrice. Questo dispositivo è progettato per applicare la deformazione uniassiale a substrati che facilitano la coltura delle cellule aderenti e mantengono una deformazione stabile e uniforme in più giorni. La configurazione descritta qui può essere utilizzata per l’imaging ad alta risoluzione di vari tipi di cellule aderenti sotto sforzo, rendendolo applicabile agli studi di meccanotrasduzione in molti campi della meccanobiologia cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo ha precedentemente1 stato progettato per l’applicazione di sforzo di trazione extracellulare su cellule aderenti. Il disegno del substrato di polidimetilsilossano in quel lavoro era sufficiente per i saggi biochimici, così come l’imaging a bassa risoluzione delle cellule allungate. In questo lavoro, il substrato è stato ridisegnato e è stata introdotta una nuova configurazione di imaging che facilita l’imaging cellulare subcellulare ad alta risoluzione. I vantaggi di questo siste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tutti gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno al finanziamento della National Research Foundation di Singapore attraverso il gruppo di ricerca interdisciplinare di Singapore-MIT Alliance for Research e Technology (SMART) BioSystems e Micromechanics (BioSyM). Gli autori Dr. Jagielska e Dr. van Vliet riconoscono con gratitudine anche il finanziamento e il sostegno della Fondazione Saks-Kavanaugh. Gli autori ringraziano William ONG e Dr. Sing Yian Chew della Nanyang Technological University, Singapore, per aver fornito cellule progenitrici del ratto oligodendrocyte per alcuni esperimenti descritti in questo lavoro, e gli autori ringraziano il dottor G. V. Shivashankar da Istituto di meccanobiologia, Università nazionale di Singapore, Singapore, per le discussioni sulle fluttuazioni dell’area nucleare.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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