Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi
Summary
Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.
Abstract
Ekstrelüler mekanik gerinim hücre fenotipi tepkiler ele almak için bilinmektedir ve çeşitli doku sistemlerinde fizyolojik alaka vardır. Biyokimyasal bilgiler aracılığıyla hücre popülasyonlarında uygulanan ekstrellüler çekme gerilimin etkisini yakalamak için, bir cihaz daha önce sadece imal edilebilir ve doku kültürü inküförleri içine sığdırmak için yeterli küçük, yanı sıra üzerine tasarlanmıştır mikroskop aşamaları. Ancak, polidimetilsiloksan substratum önceki tasarımı yağ daldırma hedefleri ile yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntüleme izin vermedi. Bu çalışma, polydimetylsiloxane substratum ‘un yeniden tasarlanan geometrisini ve birlikte uygulanan gerinim altında canlı hücrelerin yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntülemeyi kolaylaştırabilecek özelleştirilmiş bir görüntüleme kurulumunu açıklar. Bu substratum aynı, daha önceki tasarlanmış cihaz ile kullanılabilir ve bu nedenle, yukarıda listelenen aynı avantajları vardır, ek olarak yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme izin. Polidimetilsiloksan substratum tasarımı önce ve gerinim uygulamadan sonra aynı hücreyi izlemeyi kolaylaştıracak bir ızgara ekleyerek iyileştirilebilir. Temsili sonuçlar burada açıklanan yöntemi kullanarak yakalanan gergin hücreler içinde floresan etiketli çekirdeklerin yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme gösterir. Bu nükleer dinamikler verileri, uygulanan çekme gerinim, oligodendrosit progenitör hücrelerinin farklılaşmasını teşvik eden mekanizmaya dair Öngörüler verir.
Introduction
Vücutta hücreler ve dokular, çekme suşları da dahil olmak üzere çeşitli mekanik ipuçlarına tabi tutulur. Ancak, bu ipuçların nöral hücrelerin biyolojisinde etkileri henüz kapsamlı bir şekilde incelenmedi ve tam olarak anlaşılmamıştır. Santral sinir sisteminde, mekanik gerinim kaynakları gelişimsel büyüme1,2,3,4, omurilik bükme, kan ve beyin omurilik sıvısı gibi fizyolojik süreçleri içerir Nabız ve travma, Akon şişmesi, glial skarlaşma veya tümör büyümesi gibi patolojik koşullar5,6,7,8. Bu çekme gerinim oligodendrositlerin farklılaşmasını ve omurga merkezi sinir sisteminde kritik bir süreçtir akonlar, sonraki miyelinasyon nasıl etkilediğini araştırmaya değer. Özel tasarımlı bir gerinim cihazı ve elastomerik multiwell plakaları kullanarak, önceki çalışmalar9,10 statik tek eksenli gerilimin gen ifadesinde küresel değişiklikler yoluyla oligodendrosit farklılaşmasını artırabilir göstermiştir 10. bu hücrelerde strain mechanotransdution mekanizmaları daha fazla anlayış elde etmek için, önceki deneysel cihaz burada açıklandığı gibi yeniden tasarlanmalıdır, yaşayan nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme sağlamak için hücreler gerilme altında. Özellikle, tek-iyi polydimetilsiloxane plaka geliştirilmiştir, ve görüntüleme yapılandırması bir 100x yağ daldırma lens kullanarak gerginlik altında canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme için izin vermek için yeniden tasarlandı. Işık yolu polidimetilsiloksan negatif optik etkilerini ortadan kaldırmak için, hücreler polydimetilsiloxane plaka aracılığıyla değil, ancak ters pozisyonda, hücre bölmesi kapsayan kapak cam aracılığıyla görüntülenmiş. Bu yeni görüntüleme tasarımını kullanarak yüzlerce yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı film, kromatinin histon H2B yeşil floresan proteini etiketleyerek etiketlendiği, bozulmamış yapışmaz hücrelerdeki bireysel hücre çekirdeğinden kaydedilir. Bu filmler, çekme gerinim, oligodendrosit farklılaşmasının ilerlemesi ile tutarlı olan kromatin yapısında ve dinamiklerdeki değişiklikleri ortaya koymasını göstermektedir.
Uygulamalı gerginlik altında canlı hücre görüntüleme Teknik olarak zordur ve mikroskop sistemi ile uyumlu bir cihaz tasarımı gerektirir. Burada açıklanan özel tasarım ticari çözümlere ucuz bir alternatif sunar. Boyutları, uygulanan gerginlik sırasında yüksek uzamsal çözünürlükte mikroskop aşamaları ve canlı hücre görüntüleme üzerine kurulumunu sağlar. Görüntüleme kurulumu, yüksek netlik ile 100 x yağ daldırma lens kullanarak canlı hücre görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, kapak cam aracılığıyla, aksi takdirde görüntü kalitesini azaltır ve en yaygın olan polidimetilsiloksan plaka tabakası ile değil görüntüleme kurulumları. Hücre içeren takılı bir plaka ile cihaz, ayrıca kuluçte kolayca depolanabilir. Bu cihaz, yapışan hücre kültürünü kolaylaştıran ve birden fazla gün boyunca istikrarlı ve Tekdüzen bir gerginlik sağlamak için kaybolduğu tek eksenli gerinim uygulamak için tasarlanmıştır. Burada açıklanan kurulum, hücre mechanobiology birçok alanda mechanotransdution çalışmalar için uygulanabilir hale, gerginlik altında çeşitli yapışkar hücre türlerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir cihaz daha önce1 ‘ i yapışkanı hücrelerde hücre içi çekme gerilme uygulaması için tasarlandı. Bu çalışmanın polydimetylsiloxane substratum tasarımı biyokimyasal çalışmalar için yeterli, hem de gergin hücrelerin düşük çözünürlüklü görüntüleme. Bu çalışmada, substratum yeniden tasarlandı ve yüksek çözünürlüklü alt hücresel canlı hücre görüntülemeyi kolaylaştıran yeni bir görüntüleme konfigürasyonu tanıtıldı. Bu sistemin avantajları ço…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm yazarlar minnetle Singapur-MıT Alliance araştırma ve teknoloji (SMART) BioSystems ve mikromekanik (BioSyM) disiplinlerarası araştırma grubu aracılığıyla Singapur Ulusal Araştırma Vakfı ‘ndan fon desteğini kabul eder. Yazarlar Dr. Jagielska ve Dr. Van Vliet de minnetle Saks-Kavanaugh Vakfı ‘ndan fon ve destek kabul. Yazarlar, bu çalışma açıklanan bazı deneyler için sıçan oligodendrosit progenitör hücreleri sağlamak için Nanyang teknolojik Üniversitesi, Singapur, William Ong ve Dr Sing Yian Chew teşekkür ve yazarlar Dr G. V. shivashankar teşekkür Mechanobiology Enstitüsü, Singapur Ulusal Üniversitesi, Singapur, nükleer alan dalgalanmaları hakkında tartışmalar için.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
