Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße
Summary
Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.
Abstract
Es ist bekannt, dass eine technische Belastung für zellphälenförmige Reaktionen eine physiologische Relevanz in mehreren Gewebesystemen hervorruft. Um die Wirkung der aufgetragenen extrazellulären Zugbelastung auf die Zellpopulationen in vitro durch biochemische Assays zu erfassen, wurde zuvor ein Gerät entwickelt, das einfach hergestellt werden kann und klein genug ist, um Inkubatoren der Gewebekultur zu integrieren, sowie darüber hinaus Mikroskop-Stufen. Die bisherige Gestaltung des Polydimethylsiloxan-Substratums erlaubte jedoch keine hochauflösende subzelluläre Bildgebung über Öl-Immersionsziele. Diese Arbeit beschreibt eine neu gestaltete Geometrie des polydimethylsiloxanen Substrats und eine maßgeschneiderte Bildgebung, die zusammen eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung lebender Zellen unter Auftragen der Last ermöglichen kann. Dieses Substrat kann mit dem gleichen, früher entworfenen Gerät verwendet werden und hat somit die gleichen Vorteile wie oben aufgelistet, zusätzlich zu einer hochauflösenden optischen Bildgebung. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substratums kann durch die Einbettung eines Gitters verbessert werden, das die Verfolgung der gleichen Zelle vor und nach der Anwendung der Belastung erleichtert. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine hochauflösende Zeitraffer-Abbildung von fluoreszierend beschrifteten Kernen in angespannten Zellen, die mit der hier beschriebenen Methode erfasst werden. Diese Daten der nuklearen Dynamik geben Einblicke in den Mechanismus, durch den die angewandte Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen fördert.
Introduction
Zellen und Gewebe im Körper werden verschiedenen mechanischen Ketten ausgesetzt, darunter auch Zugstämme. Die Auswirkungen dieser Hinweise auf die Biologie neuronaler Zellen sind jedoch noch nicht umfassend untersucht und vollständig verstanden worden. Im zentralen Nervensystem sind die Quellen der mechanischen Belastung das Entwicklungswachstumvon 1,2,3,4, physiologische Prozesse wie Rückenmarksbiegung, Blut und Hirnspinalflüssigkeit. Pulsierung und pathologische Zustände wie Trauma, Axonschwellung, Gliollennarbung oder Tumorwachstum5,6,7,8. Es lohnt sich zu untersuchen, wie sich Zugbelastung auf die Differenzierung von Oligodendrozyten und die anschließende Myelination von Axonen auswirkt, was ein kritischer Prozess im Wirbelsäulenmittelnervensystem ist. Mit Hilfe eines maßgeschneiderten Dehnungsgerätes und einer elastomeren Multiwell-Platte haben frühere Arbeiten9,10gezeigt , dass statische Einblutungsstrapazen die Oligodendrozytendifferenzierung durch globale Veränderungen der Genexpression erhöhen können. 10. Um ein weiteres Verständnis der Mechanismen der Dehnungsmechanotransduktion in diesen Zellen zu gewinnen, muss der bisherige Experimentalapparat so umgestaltet werden, wie er hier beschrieben wird, um eine hochauflösende Fluoreszenz-Abbildung der nuklearen Dynamik im Leben zu ermöglichen. Zellen unter Belastung. Konkret wird eine einfallsbringende Polydimethylsiloxan-Platte entwickelt, und die Bildkonfiguration wird neu gestaltet, um die Zeitraffer-Abbildung lebender Zellen unter Belastung durch eine 100x Öl-Tauchlinse zu ermöglichen. Um die negativen optischen Effekte von Polydimethylsiloxan im Lichtweg zu eliminieren, werden Zellen nicht durch die Polydimethylsiloxan-Platte, sondern in der umgekehrten Position durch das Deckglas abgebildet, das das Zellfach bedeckt. Mit diesem neuen bildgebenden Design werden hunderte von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen aufgenommen, von einzelnen Zellkernen innerhalb intakter, anhaftierter Zellen, in denen Chromatin durch die Markierung von Histon H2B auf grünes fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wird. Diese Filme zeigen, dass Zugstrapazen Veränderungen in der Chromatin-Struktur und-Dynamik induzieren, die mit dem Fortschreiten der Oligodendrozyten-Differenzierung im Einklang stehen.
Die Live-Zell-Bildgebung unter aufgesetzter Belastung ist technisch anspruchsvoll und erfordert ein mit dem Mikroskop-System kompatibles Gerätedesign. Das hier beschriebene individuelle Design stellt eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen dar. Seine Abmessungen ermöglichen den Einbau auf Mikroskop-Stufen und Live-Zell-Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung während der aufgetragenen Belastung. Das bildgebende Setup soll die Bildgebung von lebenden Zellen mit einer 100-fach-Öltauchlinse mit höchster Klarheit durch das Deckglas erleichtern, nicht durch die Schicht der Polydimethylsiloxan-Platte, die sonst die Bildqualität verringert und in den meisten Fällen üblich ist. Bildgebende Setups unter Belastung. Das Gerät, mit einer montierten Platte, die Zellen enthält, lässt sich auch einfach im Inkubator lagern. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es Substraten, die die anhaftende Zellkultur erleichtern und eine stabile und gleichmäßige Belastung über mehrere Tage hinweg erhalten, uniaxiale Belastung aufträgt. Das hier beschriebene Setup kann für die hochauflösende Abbildung verschiedener anhaftender Zelltypen unter Belastung genutzt werden, was es für Mechanotransduktionsstudien in vielen Bereichen der Zellmechanobiologie geeignet macht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Gerät wurde zuvor1 für den Einsatz von extrazellulärer Zugbelastung der anhaftenden Zellen entwickelt. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substrats, das für biochemische Untersuchungen geeignet war, sowie die niedrig auflösende Abbildung von gestreckten Zellen. In dieser Arbeit wurde das Substrat neu gestaltet und eine neuartige bildgebende Konfiguration eingeführt, die hochauflösende subzelluläre Live-Zell-Bildgebung ermöglicht. Die Vorteile dieses Systems sind vielfältig: Es kann i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle Autoren danken der Unterstützung durch die National Research Foundation of Singapore durch die interdisziplinäre Forschungsgruppe Singapure-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems und Mikromechanik (BioSyM). Die Autoren Dr. Jagielska und Dr. Van Vliet danken auch der Finanzierung und Unterstützung der Saks-Kavanaugh Stiftung. Die Autoren danken William Ong und Dr. Sing Yian Chew von der Nanyang Technological University, Singapur, für die Bereitstellung von Rattenoligodendrocyte-Vorläuferzellen für einige Experimente, die in diesem Werk beschrieben werden, und die Autoren danken Dr. G. V. Shivashankar von Mechanobiologie Institut, National University of Singapore, Singapur, für Diskussionen über nukleare Flächenschwankungen.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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