一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング
Summary
このペーパーでは、以前に設計したデバイスを使用して接着細胞に機械的ひずみを適用し、再設計された基層ジオメトリと、100x オイル浸漬の目的で歪んだセルを高解像度の単一細胞イメージング用にカスタマイズした装置について説明します。
Abstract
細胞外機械的株は、セルの表現型応答を惹起することが知られており、いくつかの組織系において生理学的関連性を有する。生化学的アッセイによって細胞集団に適用された細胞外引張株の効果を捕捉するために、デバイスは、単に作製することができ、組織培養インキュベーター内だけでなく、内部に収まるほど小さいものであることがあらかじめ設計されている顕微鏡の段階。しかし、ポリジメチルシロキサン基層の以前の設計では、油浸目的で高分解能の細胞内イメージングを行うことはできませんでした。本研究では、ポリジメチルシロキサン基層の再設計された幾何学的形状と、適用した菌株下での生細胞の高解像度の細胞内イメージングを容易にするカスタマイズ画像設定について説明する。この基層は、同じ、以前に設計されたデバイスで使用することができ、したがって、高解像度の光学イメージングを可能にすることに加えて、上記と同じ利点を有します。ポリジメチルシロキサン基層の設計は、ひずみの適用の前後に同じセルを追跡することを容易にするグリッドを組み込むことによって改善することができます。代表的な結果は、ここで説明した方法を用いて捕捉された、歪んだ細胞内での蛍光標識核の高解像度タイムラプス撮影を示している。これらの核力学データは、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進する引張ひずみを適用するメカニズムについての洞察を与えます。
Introduction
体内の細胞および組織は、引張株を含む様々な機械的手がかりを受ける。しかしながら、これらの手掛かりが神経細胞の生物学に及ぼす影響は、未だ広範囲に研究されておらず、十分に理解できていない。中枢神経系において、機械的ひずみの発生源には1、2、3、4の発達的成長、脊髄の屈曲、血液、脳脊髄液などの生理的過程が含まれます。脈動、および外傷などの病的状態、軸索腫脹、グリア瘢痕、または腫瘍増殖5、6、7、8。引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化にどのように影響するかを調査する価値があり、脊椎動物の中枢神経系における重要なプロセスである軸索のその後の髄鞘形成です。カスタム設計されたひずみ装置およびエラストマーマルチウェルの版を使用して、前の作品9、10は、静的な一軸株が遺伝子発現の世界的な変化によってオリゴデンドロサイトの分化を増加できることを示した10.これらの細胞における菌株 mechanotransduction のメカニズムのさらなる理解を得るためには、前の実験装置をここで説明するように再設計しなければならず、生活における核ダイナミクスの高分解能蛍光画像化を可能にする菌株の下の細胞。具体的には、1ウェルポリジメチルシロキサンプレートが開発され、100x オイル浸漬レンズを使用した生細胞の経時的なイメージングを可能にするために、撮像構成が再設計されています。光経路にポリジメチルシロキサンの負の光学的効果を排除するために、細胞は、ポリジメチルシロキサン板を通っていないが、反転位置に、細胞コンパートメントを覆うカバーガラスを介して画像化される。この新しい撮像設計を使用して、何百もの高解像度のタイムラプス動画が、無傷の付着細胞内の個々の細胞核の記録され、ここでクロマチンはヒストン H2B を緑色蛍光タンパク質にタグ付けすることによって標識される。これらの映画は、引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化の進行と一致するクロマチン構造およびダイナミクスの変化を誘導することを実証しています。
適用された緊張の下の生きている細胞のイメージ投射は技術的に挑戦的で、顕微鏡システムと互換性がある装置設計を要求する。ここに記載されているカスタム設計は、商用ソリューションに代わる安価な方法を提供します。その次元は適用された緊張の間に高い空間分解能で顕微鏡の段階および生きている細胞のイメージ投射で取付けを可能にする。イメージングセットアップは、画像品質を低下させ、ほとんどの場合に一般的なポリジメチルシロキサンプレートの層を通してではなく、カバーガラスを通して、最高の透明度を持つ100x オイル浸漬レンズを使用して、生細胞イメージングを容易にするように設計されています。歪みの下でイメージングのセットアップ。この装置は、細胞を含む取り付けられたプレートを用いて、インキュベーター内に容易に貯蔵することもできる。この装置は付着細胞の文化を促進し、複数の日に安定した、均一な緊張を維持する substrata に一軸の緊張を適用するように設計されている。ここに記載されたセットアップは、菌株下の様々な付着細胞型の高解像度画像化に使用することができ、それを細胞メカノバイオロジーの多くの分野での mechanotransduction 研究に適用可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
装置は、接着細胞上の細胞外引張株の適用のために、以前に1が設計されている。その作業におけるポリジメチルシロキサン基層の設計は、生化学的アッセイだけでなく、延伸細胞の低解像度イメージングにも十分であった。本研究では、基層を再設計し、高分解能細胞内細胞イメージングを容易にする新規イメージング構成を導入した。このシステムの利点は多数あります…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての著者は、シンガポール・ MIT 研究技術連合 (SMART) バイオテクノロジー (スマート) バイオ・マイクロメカニックス (BioSyM) 学際研究グループを通じて、シンガポール国立研究財団からの資金援助を感謝しています。著者の Jagielska 博士とヴァン・フリート博士も、Saks ・ Kavanaugh 財団の資金と支援を感謝しています。著者たちは、この作品に記載されたいくつかの実験のためにラットオリゴデンドロサイト前駆細胞を提供するために、シンガポールの南洋理工大学でウィリアム・ Yian 氏と Dr. シンシンに感謝し、著者らは Shivashankar 博士に感謝した。シンガポール国立大学メカノバイオロジー研究所は、核地域の変動について議論しています。
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
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| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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