Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial
Summary
Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.
Abstract
A estirpe mecânica extracellular é sabida para provocar respostas fenotípicas da pilha e tem a relevância physiological em diversos sistemas do tecido. Para capturar o efeito da tensão de tração extracelular aplicada em populações da pilha in vitro através dos ensaios bioquímicos, um dispositivo foi projetado previamente que pode ser fabricado simplesmente e é pequeno bastante caber dentro das incubadoras da cultura do tecido, assim como na parte superior de estágios do microscópio. Entretanto, o projeto precedente do substrato do polidimetilsiloxano não permitiu a imagem latente subcellular de alta resolução através dos objetivos da óleo-imersão. Este trabalho descreve uma geometria redesenhada do substrato do polidimetilsiloxano e uma configuração de imagem personalizada que, em conjunto, pode facilitar a imagem subcelular de alta resolução de células ao vivo, enquanto estirpe aplicada. Este substrato pode ser usado com o mesmo, dispositivo projetado anteriormente e, portanto, tem as mesmas vantagens como listado acima, além de permitir a imagem óptica de alta resolução. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano pode ser melhorado incorporando uma grade que facilite o seguimento da mesma pilha antes e depois da aplicação da tensão. Os resultados representativos demonstram a imagem latente de alta resolução do tempo-lapso de núcleos cDNAs etiquetados dentro das pilhas tensas capturadas usando o método descrito aqui. Estes dados da dinâmica nuclear dão introspecções no mecanismo por que a tensão elástica aplicada promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte.
Introduction
Células e tecidos no corpo são submetidos a várias pistas mecânicas, incluindo tensões de tração. No entanto, os efeitos dessas pistas sobre a biologia das células neurais ainda não foram estudados extensivamente e compreendidos plenamente. No sistema nervoso central, as fontes de deformação mecânica incluem o crescimento do desenvolvimento1,2,3,4, processos fisiológicos, como flexão da medula espinhal, sangue e líquido cefalorraquidiano pulsação, e condições patológicas tais como o traumatismo, o inchamento do AXON, scarring glial, ou o crescimento do tumor5,6,7,8. Vale a pena investigar como a tensão elástica afeta a diferenciação de oligodendrócitos e a subsequente mielinação de axônios, que é um processo crítico no sistema nervoso central de vertebrados. Usando um dispositivo de deformação personalizado e placas de multipoços elastoméricos, trabalhos anteriores9,10 mostraram que a cepa uniaxial estática pode aumentar a diferenciação de oligodendrocyte através de mudanças globais na expressão gênica 10. para obter uma maior compreensão dos mecanismos de mecanotransdução de estirpe nestas células, o aparelho experimental anterior deve ser redesenhado como descrito aqui, para permitir a imagem latente de fluorescência de alta resolução da dinâmica nuclear na vida células tensão. Especificamente, uma placa polidimetilsiloxano do único-poço é desenvolvida, e a configuração da imagem latente é redesenhada para permitir a imagem latente do tempo-lapso de pilhas ao vivo a tensão usando uma lente da imersão do óleo 100x. Para eliminar os efeitos ópticos negativos do polidimetilsiloxano na via de luz, as células são imaged não através da placa de polidimetilsiloxano, mas na posição invertida, através do vidro de cobertura cobrindo o compartimento da célula. Usando este projeto novo da imagem latente, as centenas de filmes high-resolution do tempo-lapso são gravadas, de núcleos individuais da pilha dentro das pilhas aderentes intactas, onde a cromatina é etiquetada etiquetando o histona H2B à proteína fluorescente verde. Estes filmes demonstram que a tensão elástica induz mudanças na estrutura e na dinâmica da cromatina que são consistentes com a progressão da diferenciação do oligodendrocyte.
A imagem latente viva da pilha a tensão aplicada é tecnicamente desafiante e exige um projeto do dispositivo que seja compatível com o sistema do microscópio. O design personalizado descrito aqui apresenta uma alternativa barata para soluções comerciais. Suas dimensões permitem sua instalação nos estágios do microscópio e na imagem latente viva da pilha na definição espacial elevada durante a tensão aplicada. O setup da imagem latente é projetado facilitar a imagem latente viva da pilha usando uma lente da imersão do óleo 100x com a claridade a mais elevada, através do vidro da tampa, não através da camada da placa do polidimetilsiloxano que diminui de outra maneira a qualidade de imagem e é comum em a maioria configurações de imagem tensão. O dispositivo, com uma placa montada que contem pilhas, pode igualmente ser armazenado facilmente na incubadora. Este dispositivo é projetado aplicar a tensão uniaxial aos substratos que facilitam a cultura de pilha aderente e mantêm uma tensão estável e uniforme sobre dias múltiplos. A instalação descrita aqui pode ser usada para a imagem latente de alta resolução de vários tipos aderentes da pilha a tensão, fazendo a aplicável aos estudos do mechanotransdução em muitos campos da mecanobiologia da pilha.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dispositivo foi projetado previamente1 para a aplicação da tensão de tração extracelular em pilhas aderentes. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano em que o trabalho era suficiente para ensaios bioquímicos, assim como a imagem latente de baixa resolução de pilhas esticadas. Neste trabalho, o substrato foi redesenhado, e uma nova configuração de imagem que facilita a imagem de célula viva subcelular de alta resolução foi introduzida. As vantagens deste sistema são numerosas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Todos os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento da Fundação Nacional de pesquisa de Singapura através do grupo de pesquisa interdisciplinar da Aliança para a pesquisa e tecnologia (SMART) biosistemas e Micromecânicos (BioSyM) de Singapura-MIT. Os autores Dr. Jagielska e Dr. Van Vliet também reconhecem com gratidão o financiamento e o apoio da Fundação Saks-Kavanaugh. Os autores agradecem a William ONG e o Dr. Sing Yian Chew da Universidade Tecnológica de Nanyang, Singapura, por fornecer células progenitoras oligodendrocyte de ratos para alguns experimentos descritos neste trabalho, e os autores agradecem ao Dr. G. V. Shivashguei de Instituto de mechanobiology, Universidade Nacional de Singapore, Singapore, para discussões sobre flutuações da área nuclear.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
