Summary
Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.
Abstract
A estirpe mecânica extracellular é sabida para provocar respostas fenotípicas da pilha e tem a relevância physiological em diversos sistemas do tecido. Para capturar o efeito da tensão de tração extracelular aplicada em populações da pilha in vitro através dos ensaios bioquímicos, um dispositivo foi projetado previamente que pode ser fabricado simplesmente e é pequeno bastante caber dentro das incubadoras da cultura do tecido, assim como na parte superior de estágios do microscópio. Entretanto, o projeto precedente do substrato do polidimetilsiloxano não permitiu a imagem latente subcellular de alta resolução através dos objetivos da óleo-imersão. Este trabalho descreve uma geometria redesenhada do substrato do polidimetilsiloxano e uma configuração de imagem personalizada que, em conjunto, pode facilitar a imagem subcelular de alta resolução de células ao vivo, enquanto estirpe aplicada. Este substrato pode ser usado com o mesmo, dispositivo projetado anteriormente e, portanto, tem as mesmas vantagens como listado acima, além de permitir a imagem óptica de alta resolução. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano pode ser melhorado incorporando uma grade que facilite o seguimento da mesma pilha antes e depois da aplicação da tensão. Os resultados representativos demonstram a imagem latente de alta resolução do tempo-lapso de núcleos cDNAs etiquetados dentro das pilhas tensas capturadas usando o método descrito aqui. Estes dados da dinâmica nuclear dão introspecções no mecanismo por que a tensão elástica aplicada promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte.
Introduction
Células e tecidos no corpo são submetidos a várias pistas mecânicas, incluindo tensões de tração. No entanto, os efeitos dessas pistas sobre a biologia das células neurais ainda não foram estudados extensivamente e compreendidos plenamente. No sistema nervoso central, as fontes de deformação mecânica incluem o crescimento do desenvolvimento1,2,3,4, processos fisiológicos, como flexão da medula espinhal, sangue e líquido cefalorraquidiano pulsação, e condições patológicas tais como o traumatismo, o inchamento do AXON, scarring glial, ou o crescimento do tumor5,6,7,8. Vale a pena investigar como a tensão elástica afeta a diferenciação de oligodendrócitos e a subsequente mielinação de axônios, que é um processo crítico no sistema nervoso central de vertebrados. Usando um dispositivo de deformação personalizado e placas de multipoços elastoméricos, trabalhos anteriores9,10 mostraram que a cepa uniaxial estática pode aumentar a diferenciação de oligodendrocyte através de mudanças globais na expressão gênica 10. para obter uma maior compreensão dos mecanismos de mecanotransdução de estirpe nestas células, o aparelho experimental anterior deve ser redesenhado como descrito aqui, para permitir a imagem latente de fluorescência de alta resolução da dinâmica nuclear na vida células tensão. Especificamente, uma placa polidimetilsiloxano do único-poço é desenvolvida, e a configuração da imagem latente é redesenhada para permitir a imagem latente do tempo-lapso de pilhas ao vivo a tensão usando uma lente da imersão do óleo 100x. Para eliminar os efeitos ópticos negativos do polidimetilsiloxano na via de luz, as células são imaged não através da placa de polidimetilsiloxano, mas na posição invertida, através do vidro de cobertura cobrindo o compartimento da célula. Usando este projeto novo da imagem latente, as centenas de filmes high-resolution do tempo-lapso são gravadas, de núcleos individuais da pilha dentro das pilhas aderentes intactas, onde a cromatina é etiquetada etiquetando o histona H2B à proteína fluorescente verde. Estes filmes demonstram que a tensão elástica induz mudanças na estrutura e na dinâmica da cromatina que são consistentes com a progressão da diferenciação do oligodendrocyte.
A imagem latente viva da pilha a tensão aplicada é tecnicamente desafiante e exige um projeto do dispositivo que seja compatível com o sistema do microscópio. O design personalizado descrito aqui apresenta uma alternativa barata para soluções comerciais. Suas dimensões permitem sua instalação nos estágios do microscópio e na imagem latente viva da pilha na definição espacial elevada durante a tensão aplicada. O setup da imagem latente é projetado facilitar a imagem latente viva da pilha usando uma lente da imersão do óleo 100x com a claridade a mais elevada, através do vidro da tampa, não através da camada da placa do polidimetilsiloxano que diminui de outra maneira a qualidade de imagem e é comum em a maioria configurações de imagem tensão. O dispositivo, com uma placa montada que contem pilhas, pode igualmente ser armazenado facilmente na incubadora. Este dispositivo é projetado aplicar a tensão uniaxial aos substratos que facilitam a cultura de pilha aderente e mantêm uma tensão estável e uniforme sobre dias múltiplos. A instalação descrita aqui pode ser usada para a imagem latente de alta resolução de vários tipos aderentes da pilha a tensão, fazendo a aplicável aos estudos do mechanotransdução em muitos campos da mecanobiologia da pilha.
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Protocol
1. projeto do molde do polidimetilsiloxano do único-poço para a imagem latente de alta resolução
Nota: o molde para a fabricação de placas de polidimetilsiloxano é projetado com as seguintes características para permitir a imagem com uma lente de imersão de óleo 100x e um ajuste correto no dispositivo de deformação Custom-Build (Figura 1a, B).
- Mantenha as dimensões gerais da chapa de tal forma que se encaixe nas braçadeiras do dispositivo de deformação.
Nota: aqui, são 60 mm x 73 mm. - Faça um compartimento da pilha ou bem que seja significativamente menor do que as dimensões laterais da placa inteira, para evitar os efeitos de arco (fora--plano de dobra) que acontecem nas bordas apalpe da placa do polidimetilsiloxano durante a tensão aplicada.
Nota: aqui, o compartimento foi concebido como um quadrado de 23 mm x 23 mm. - Mantenha a profundidade do compartimento de células o mínimo possível (não mais de 80 μm), para permitir o foco com a lente de imersão de óleo 100x através do vidro de cobertura colocado em cima do compartimento, mas torná-lo suficiente para conter mídia e para evitar entrar em contato ou apertando as células.
- Levante o compartimento de pilha em um quadrado com uma altura de 3 milímetros, para trazer as pilhas mais perto da lente na instalação invertida do microscópio para permitir a focalização fácil.
Nota: os moldes com as características acima podem ser manufacturados por muitas técnicas que incluem, por exemplo, alumínio moado. Alternativamente, os moldes mestres podem igualmente ser montados usando as folhas acrílicas cortadas com um cortador do laser, o vidro da tampa #0 para o compartimento de pilha, e a colagem super. Este molde mestre é usado para fazer uma impressão do polidimetilsiloxano, que seja usada então para fazer moldes de trabalho usando uma resina da carcaça.
2. fabricação de simples-bem polidimetilsiloxano placas e compartimentos quadrados
- Misture a base do polidimetilsiloxano e o agente de cura em uma relação de 20:1 (pelo peso) em um copo descartável. Pesar um total de 20 g de polidimetilsiloxano por molde (para fazer uma placa de polidimetilsiloxano) e 150 g de polidimetilsiloxano por 150 mm-em-diâmetro do prato de plástico (para fazer um lote de compartimentos quadrados).
- Deixe a mistura de polidimetilsiloxano em um degasser a vácuo na barra-0,8 por 30 min (ou até que todas as bolhas sejam removidas).
- Despeje a mistura de polidimetilsiloxano nos moldes (para chapas) ou em pratos plásticos de 150 mm (para compartimentos quadrados).
- Remover quaisquer bolhas adicionais nesta fase, quer por sopro de ar (por via oral) ou desgaseificação do polidimetilsiloxano-preenchido moldes/pratos novamente at-0,8 bar vácuo por 30 min.
- Deixe os moldes/pratos em um forno de 80 ° c em uma tabela nivelando para 2 h.
- Retire cuidadosamente os moldes/pratos do forno e deixe-os arrefecer até à temperatura ambiente. Retire suavemente o polidimetilsiloxano curado após cortar cuidadosamente as bordas com uma lâmina (Figura 1C).
- No polidimetilsiloxano de 150 mm de diâmetro, desenhe uma grelha de 2 cm x 2 cm com um marcador. Dentro de cada quadrado, desenhe um quadrado de 1 cm x 1 cm, deixando uma margem de 0,5 cm em todos os lados. Usando uma lâmina, corte cuidadosamente ao longo das linhas para obter compartimentos quadrados (Figura 2a).
- Limpe as placas de polidimetilsiloxano/compartimentos quadrados incubando-os em 100% de acetona por 4 h, seguido de 100% de etanol por 4 h, seguido de água autoclavada por 4 h.
- Coloc as placas/compartimentos quadrados no papel do revestimento protetor da película de parafina (não a película de parafina mas o papel) dentro de um prato plástico do diâmetro de 150 milímetros (Figura 2C).
- Deixe a placa de polidimetilsiloxano no forno a 80 ° c para secar durante 4 h.
- Sele os 150 pratos do milímetro-diâmetro que contêm placas do polidimetilsiloxano e os quadrados do recipiente com película de parafina, e armazená-los em uma sala fria até o uso mais adicional.
3. functionalization de placas do polidimetilsiloxano
- Retire a película de parafina, retire a tampa do prato de plástico, e coloque as placas de polidimetilsiloxano e compartimentos quadrados luz ultravioleta por 30 min.
- Plasma-trate (em 150 W por 5 minutos) as placas do polidimetilsiloxano (com o compartimento de pilha que enfrenta acima) sem os compartimentos quadrados, para fazer a superfície da cultura hidrófilo.
- Coloque imediatamente os compartimentos quadrados na superfície tratada com plasma (Figura 2b) e pressione manualmente para colocar os dois em conjunto temporariamente.
Nota: não plasma-trate os compartimentos quadrados, ou então eles vão ficar fortemente para a placa de polidimetilsiloxano e não vai sair facilmente quando eles devem ser descascados durante a imagem. - Adicionar 200 μL de 100 mM (3-aminopropilo) trietoxilsilano ao poço durante 2 h para introduzir – NH2 grupos para a superfície polidimetilsiloxana. Para fazer uma solução de 100 mM, dissolva 234 μL de trietoxilsilano puro (3-aminopropílico) em 10 mL de água. Após uma incubação de 2 h, lave os poços 3x com água desionizada.
- Pesar 2 MGS do chapéu cabeado molecular bissulfosuccinimidyl suberate e dissolvê-lo em 700 μL de 1 M (4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfônico Acid buffer (pH 8,0) e 2,8 ml de água.
Nota: isso dará uma solução de 1 mm de bissulfosuccinimidyl suberate em 200 mm (4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfônico Acid buffer. Observe que um buffer de concentração de 50 mM também funciona bem.- Adicionar 135 μL desta solução e 15 μL de 1 mg/mL de fibronectina ao poço em cada placa de polidimetilsiloxano durante 4 h à temperatura ambiente.
- Lave 3x com solução salina tamponada com fosfato. Adicionar 500 μL de solução salina tamponada com fosfato ao poço. Cubra o prato de 150 mm de diâmetro contendo o polidimetilsiloxano com película de parafina e guarde-o em uma sala fria, até o uso posterior.
4. functionalization de pratos plásticos e frascos
- Incubar pratos e frascos plásticos com uma solução de 5 μg/mL de poli-D-lisina (PDL, em água estéril) durante 1 h. Adicione 1,5 mL desta solução (ligand) por prato de 35 mm de diâmetro, 3 mL por prato de 60 mm de diâmetro e 10 mL por balão de cultura de 75 cm2 .
- Lave os pratos e frascos 2x com água estéril.
- Deixe-os secar no armário de biossegurança por 1 h (ou até secar) e guarde-os na sala fria a 4 ° c até o uso posterior.
5. meio de proliferação e diferenciação para células progenitoras de Oligodendrócito murino
- Prepare 50 mL de soluções 100x do meio de proliferação e diferenciação, faça alíquotas de 2,5 mL e armazene-as em-80 ° c.
Nota: a composição do meio de proliferação é 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-transferrina, 5 ng/mL de Selenito de sódio, 1x penicilina-estreptomicina, 10 ng/mL de crescimento derivado e fator de crescimento de 10 ng/mL de fibroblastos no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicose e piruvato. Enquanto a albumina sérica bovina, progesterona, putrescina e Selenito de sódio pode ser constituída e armazenada em 100x, insulina, holo-transferrina, e penicilina-estreptomicina deve ser adicionado fresco ao preparar a solução 1x. Os fatores de crescimento devem ser constituídos a 10 μg/mL e devem ser adicionados frescos às células todos os dias (1 μL/mL de meio). A composição do meio de diferenciação é 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-transferrina, 5 ng/mL Selenito de sódio, 1x penicilina-estreptomicina, 400 ng/mL triiodotironina 400, L-tiroxina, e 0,5% soro fetal bovino em DMEM com alta glicose e piruvato. A triiodotironina e a L-tiroxina podem ser constituídas com outros reagentes e armazenadas a 100x. Insulina, holo-transferrina e penicilina-estreptomicina devem ser adicionadas frescas durante a preparação da solução 1x. - Para a preparação de 50 mL de meio de proliferação de 100x, dissolva 510 mg de albumina sérica bovina em 17 mL de meio de Dulbecco, 310 μg de progesterona em 31 μL de etanol, 80 mg de putrescina em 500 μL de meio de Dulbecco, 25 μg de Selenito de sódio em 10 μL de meio de Dulbecco , e DMEM completo até 50 mL
- Para preparar 50 mL de solução de 100x de meio de diferenciação, adicionalmente dissolver 2 mg de triiodotironina em 40 μL de hidróxido de sódio e 2 mg de L-tiroxina em 40 μL de hidróxido de sódio, em seguida, encher a solução para 50 mL com o meio de Dulbecco. Filtre a solução através de uma unidade de filtro descartável estéril, alíquota, e armazene as alíquotas em-80 ° c.
- Para a preparação de 250 mL de meio de proliferação/diferenciação 1x, misture 2,5 mL de solução 100x de meio de proliferação/diferenciação com 12,5 mg de holo-transferrina, 125 μL de insulina 10 mg/mL e 2,5 mL de 100x de penicilina-estreptomicina. Encha acima a solução a 250 mL com o meio de Dulbecco e filtre-o através de uma unidade descartável estéril do filtro.
Nota: os fatores de crescimento devem ser adicionados frescos e diretamente à cultura celular, não a todo o lote de meio reconstituído.
6. cultura celular
- Comece com células progenitoras oligodendrócyte suspensas em meio de proliferação. Semeie estas células a uma densidade de 35.000 células/cm2 para superfícies plásticas revestidas com PDL (pratos ou frascos, ver secção 4). Ajuste o volume do meio de proliferação para 3 mL por 10 cm2 da área de superfície do substrato plástico; um volume mais baixo do meio pode conduzir à aglomeração da pilha que levanta-se das forças de tensão de superfície, quando um volume mais elevado de meio nos pratos pode causar o derramamento.
- Adicione fatores de crescimento (fator de crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de fibronectina) todos os dias, mantendo sua concentração em 10 ng/mL e mude metade do meio de proliferação em dias alternados.
- No terceiro dia, retire as células da superfície plástica usando uma solução de descolamento de células suaves (por exemplo, accutase): Retire o meio, lave 1x com solução salina tamponada com fosfato, adicione 1 mL de solução de descolamento por área de 20 cm2 , deixe o prato/balão em uma incubadora em 37 ° c por 10 minutos, e bata-a delicadamente até que todas as pilhas se separem (Olhe um microscópio).
- Pipetar usando uma ponta de 200 μL para quebrar aglomerados em células individuais, transferi-los para um tubo de 50 mL, dilui-los em meio de proliferação, girar a 0,2 x g por 10 min, descartar o sobrenadante e ressuscitar o pellet em meio de proliferação para fazer um volume total de 1 ml. Conte as células usando um citometro.
- Lave as placas de polidimetilsiloxano fibronectina-functionalized 2x, 15 min por lavagem, com meio de proliferação.
- Sementes 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano em 700 μL de meio de proliferação.
- Adicione uma construção do plasmídeo de H2B-GFP para etiquetar o histona H2B com a proteína fluorescente verde.
Nota: aqui, 1,4 μL de CellLight H2B-GFP BacMam2 transfection Mix foi adicionado a cada placa (2 μL por 50.000 células). - Após 24 h, monte as amostras de polidimetilsiloxano com células a serem esticadas no dispositivo de deformação uniaxial (como mostrado na Figura 2D). Mude o meio em todas as amostras para o meio de diferenciação.
- Para esticar as amostras, medir o comprimento do compartimento de células sem tensão (Figura 3a) e girar o parafuso do micrômetro de estágio para aumentar o comprimento do compartimento da célula pela quantidade desejada (por exemplo, 10%, ver Figura 3B). Deixe as amostras de polidimetilsiloxano estendidas e não esticadas na incubadora a 37 ° c até a imagem.
7. imagem latente
- Ligue o microscópio. Ajuste a temperatura da incubadora do microscópio a 37 ° c.
- Traga o objetivo a ser usado (100x imersão a óleo) para a posição central como a torre objetiva não será acessível mais tarde. Desaperte o objetivo e aparafuse-o com um anel objetivo (figura 4a) para que o objetivo possa ser trazido mais perto das células. Se um objetivo de petróleo está sendo usado aqui, adicione uma gota de óleo nesta etapa.
- Sintetizar de antemão (através de impressão 3D ou usinagem) um suporte de plástico ou metal que tem duas características importantes — uma janela angular e uma etapa (Figura 4B).
Nota: a janela suporta uma espessura #0 lamínula de vidro que irá segurar o meio enquanto o dispositivo de deformação está em um estado invertido. O corte angular nas bordas da janela (Figura 4D) permite que o objetivo chegue mais perto da lamínula de vidro. A etapa no suporte permite-nos de trazer o polidimetilsiloxano esticado mais para baixo, mais perto do objetivo. - Coloque uma lamínula de vidro (espessura #0, com dimensões de 25 mm x 25 mm ou 35 mm de diâmetro) na superfície superior do suporte, espalhando graxa de vácuo na periferia da janela (Figura 4C), e tape a janela plástica no estágio do microscópio ( Figura 4D e Figura 5a).
- Aparafuse um estágio de tradução zno estágio do microscópio e mova-o para a posição zsuperior (Figura 5a).
- Remova 500 μL do meio da placa de polidimetilsiloxano esticada a ser imaged e adicione este meio na lamínula de vidro na janela plástica branca.
- Retire cuidadosamente o compartimento quadrado da placa de polidimetilsiloxano com pinças estéreis.
- Segure o dispositivo de deformação em uma posição vertical (células voltadas para cima) acima da janela de plástico branco e inverta cuidadosamente o dispositivo de deformação de modo a deixar qualquer meio extra cair diretamente no meio da lamínula de vidro (Figura 5b) (células voltadas para baixo).
- Coloque a parte inferior do dispositivo de deformação no estágio de tradução zcom a fita dupla face (Figura 5C, D).
- Ao olhar através da ocular o brightfield, lentamente traga o dispositivo da tensão para baixo (Figura 5E) (abaixando o estágio da z-tradução) e mova o objetivo até o foco nas pilhas.
- Execute esta etapa extremamente lentamente, passo a passo. Se o dispositivo da tensão pressiona demasiado na lamínula, as pilhas podem começ comprimidas (fazendo com que morra) e se o objetivo pressiona demasiado na lamínula, o lamela pode quebrar (causando o meio para vazar e derramar no objetivo).
- Escaneie a placa do polidimetilsiloxano em x-e em y-sentidos para encontrar uma pilha que tenha um núcleo fluorescente (sob o epifluorescência com 488 nanômetro da excitação do comprimento de onda) e a morfologia apropriada da pilha (sob o brightfield).
- Se o deslocamento lateral do estágio do microscópio não afeta a focagem vertical muito, selecione várias regiões de interesses usando um recurso multiponto no software. Às vezes, o foco é muito sensível a qualquer deslocamento lateral do palco. Em tais casos, a imagem de uma célula de cada vez. Marque as posições x, ye zpara cada célula de interesse.
- Grave imagens de campo largo (ou de furo aberto) do núcleo com 488 nm de excitação de comprimento de onda e da célula com excitação de campo brightfield em intervalos de 30 s por quadro para uma duração total de pelo menos 30 min.
8. análise de dados
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Flutuações nucleares
- Abra a sequência de imagens do núcleo (Figura 6a) em um software de análise de imagem e limite as imagens de lapso de tempo do núcleo (por exemplo, use o comando Threshold no ImageJ ou o comando GRAYTHRESH no software MATLAB).
- Obtenha a área do núcleo (em pixels) em função do tempo, plote-a em um software de plotagem de dados (Figura 6B) e ajuste um polinômio de terceira ordem aos dados (Figura 6C) (por exemplo, use a análise | Fitting | Comando Polynomial Fit no Origin ou no comando polyfit no software MATLAB).
- Subtrair o valor do polinômio ajustado da área real (em pixels) para cada ponto de tempo. Esta área corrigida é conhecida como a área residual.
Nota: este processo remove qualquer tendência crescente ou decrescente nos dados provenientes de erros instrumentais e é chamado detrending.- Calcule a percentagem de área residual dividindo a área residual em cada ponto de tempo com o valor do polinômio ajustado nesse ponto de tempo (Figura 6D).
- Calcule o desvio padrão da série temporal da área residual. Este desvio padrão denota a amplitude das flutuações nucleares.
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Plotagem de dados e análise estatística
- Calcule a amplitude das flutuações nucleares como uma média de pelo menos 20 núcleos por condição.
- Realizar um teste estatístico de análise de variância unidirecional com correção de Bonferroni para determinar se há uma diferença significativa na amplitude das flutuações em função das condições de interesse (por exemplo, com e sem cepa aplicada).
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Representative Results
Os trabalhos recentes que visam investigar o efeito da tensão elástica em oligodendrócitos10 mostraram que uma tensão elástica uniaxial de 10% promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte por mudanças globais na expressão de Gene. O mecanismo por trás dessas alterações na expressão gênica pode ser sondados por meio da imagem de parâmetros subcelulares, como a estrutura do citoesqueleto, localização do fator de transcrição, dinâmica nuclear e organização da cromatina. Entretanto, a geometria precedente do substrato do polidimetilsiloxano não permitiu a imagem latente de alta resolução da único-pilha. Como descrito neste trabalho, a geometria redesenhada do substrato polidimetilsiloxano e a configuração de imagem minimizou a distância entre as células e o objetivo. Isso permite capturar imagens de lapso de tempo de núcleos de células fluorescentamente rotulados usando um objetivo de imersão de óleo de 100x (Figura 6a).
Flutuações na área projetada nuclear dependem do estado de diferenciação das células11,12. A comparação das flutuações nucleares das células progenitoras oligodendrocitais e dos oligodendrócitos terminalmente diferenciados mostrou que estas últimas têm flutuações significativamente menores (Figura 6E). Em seguida, foram comparadas as flutuações nucleares das células progenitoras do oligodendrocyte a 1 h, 24 h e 48 h de indução pós-química de diferenciação com e sem estirpe de tração de 10%. Com a indução química isolada, a amplitude das flutuações nucleares mostrou uma diminuição significativa a 48 h, mas não a 24 h (Figura 6F). Por outro lado, a indução química em conjunto com uma cepa de tração a 10% mostrou uma diminuição significativa a 24 h, que permaneceu constante, sem maior redução a 48 h (Figura 6G).
A geometria do substrato e a configuração de imagem descrita neste artigo permitiram a gravação de filmes de alta resolução de células tensas. A análise subseqüente destes filmes demonstrou que a tensão acelera o umedecimento de flutuações nucleares, que é um marcador da diferenciação. Estes resultados dão a introspecção no mecanismo por que a tensão promove a diferenciação do oligodendrocyte. Outras discussões sobre a interpretação desses resultados e futuras experiências são descritas em Makhija et al.13.
Figura 1: Design e geometria do polidimetilsiloxano molde. (A) esboço do molde que mostra todas as dimensões em milímetros (este esboço foi gerado por whits Technologies, Singapore). (B) visão tridimensional do molde (adaptado de Makhija et al.11). O Inset mostra uma foto do molde. (C) visão tridimensional da placa de polidimetilsiloxano fabricada utilizando o molde (adaptado de Makhija et al.11). O Inset mostra uma foto da placa de polidimetilsiloxano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da amostra. (A) foto de uma placa do polidimetilsiloxano e de um compartimento quadrado. (B) o compartimento quadrado é colocado sobre o quadrado levantado na placa de polidimetilsiloxano. Sua finalidade é conter o meio para as pilhas. (C) as placas do polidimetilsiloxano são armazenadas em 150 pratos plásticos do milímetro-diâmetro usando o papel parafilm para impedir que o polidimetilsiloxano degola no plástico. (D) ao montar a placa no dispositivo da tensão, apoie-a da parte inferior usando dois dedos para impedir toda a flacidez da placa. Se a chapa ainda estiver um pouco após a montagem, aumente a distância entre os braços do dispositivo de deformação girando o estágio de tradução. Nesta etapa, a tradução do estágio não deve induzir a deformação na placa de polidimetilsiloxano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: alongamento celular. (A) medir o comprimento inicial da placa entre as braçadeiras, usando uma régua. (B) esticar a placa girando o parafuso na fase de tradução para aumentar o comprimento da placa inicial pela percentagem desejada. X% de aumento de comprimento corresponde a X% de tensão. Note-se que, para gerar a estirpe desejada (X%) no compartimento de cultura de células levantadas, a placa principal deve ser esticada por uma quantidade maior (aproximadamente 2X%) devido à diferença na sua espessura na geometria da chapa descrita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Preparação para imagens. (A) traga o objetivo 100x à posição central na torre, desaparafuse o objetivo, e parafuse-o para trás junto com o anel objetivo. (B) esboço do suporte mostrando todas as dimensões em milímetros. (C) espalhe a graxa do vácuo na periferia da janela no suporte, usando uma ponta da pipeta, e coloc uma lamínula de vidro na parte superior. Use um vidro da tampa com espessura #0 ou #1, para permitir o foco com a lente da imersão do óleo 100x. (D) Coloque o suporte (1) na fase do microscópio (2). Coloque o óleo (6) objetivo (3) mais próximo da lamínula (5) que está preso ao suporte, utilizando graxa de vácuo (4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: configuração de imagem no microscópio. (A) montar o estágio de tradução z(seta amarela) e o suporte (seta vermelha) no estágio do microscópio. (B) incline o dispositivo da tensão no estágio do microscópio para deixar toda a gota média na lamínula de vidro do suporte. Stick uma fita dupla face (seta azul) no dispositivo de deformação que vai ficar no estágio de tradução z. (C) Coloque o dispositivo de deformação numa posição invertida, apoiando-o na fase de tradução z. As células devem estar alinhadas com a lamínula de vidro do suporte de plástico. (D) a geometria invertida do dispositivo de deformação minimiza a distância entre as células e o objetivo, facilitando assim a imagem de alta resolução (adaptada de Makhija et al.11). (E) vista lateral antes de colocar o dispositivo de tensão para baixo (1); Vista lateral depois de colocar o dispositivo de tensão para baixo (2); vista superior depois de colocar o dispositivo de tensão para baixo (3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens representativas e dados de flutuações de área do núcleo. Este número é adaptado de Makhija et al.11. (A) a imagem típica de um núcleo etiquetado com histona H2B etiquetou à proteína fluorescente verde, e a uma pilha diferenciando do progenitor do oligodendrocyte. O núcleo está em foco, enquanto os processos celulares estão fora de foco. (B) séries temporais típicas de uma área nuclear (em pixels). C) polinômio de terceira ordem montados nos dados. (D) percentagem da série temporal de flutuação da área residual. (E) flutuações da aresta nuclear das células progenitoras de Oligodendrócito proliferating e oligodendrócitos terminalmente diferenciados. (F) flutuações da aresta nuclear a 1 h, 24 h e 48 h pós-indução de diferenciação química sem esforço. (G) flutuações da área nuclear em 1 h, 24 h, e 48 h pós-indução de diferenciação química com 10% de tensão de tração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um dispositivo foi projetado previamente1 para a aplicação da tensão de tração extracelular em pilhas aderentes. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano em que o trabalho era suficiente para ensaios bioquímicos, assim como a imagem latente de baixa resolução de pilhas esticadas. Neste trabalho, o substrato foi redesenhado, e uma nova configuração de imagem que facilita a imagem de célula viva subcelular de alta resolução foi introduzida. As vantagens deste sistema são numerosas: pode ser construído no laboratório usando componentes simples, é barato comparado aos dispositivos comerciais da tensão (500 USD por o dispositivo da tensão da pilha), e é pequeno bastante caber dentro das incubadoras da cultura do tecido, assim como no Microscópios. Além disso, embora o sistema da imagem latente seja descrito aqui com a instalação invertida do microscópio, pode prontamente ser ajustado para a configuração ereta do microscópio.
Há algumas etapas críticas envolvidas na preparação e na imagem latente da amostra. Em primeiro lugar, as placas de polidimetilsiloxano e compartimentos quadrados têm de ser cuidadosamente limpos antes da semeadura celular (protocolo passo 2,8) para garantir a sobrevivência celular (como polidimetilsiloxano não curado é tóxico para as células). Em segundo, desde que o volume do meio fluido que pode caber dentro do compartimento quadrado é menos de 1 mL, pode evasorar se a amostra está na incubadora por alguns dias. Assim, o meio deve ser verificado todos os dias e reabastecido quando necessário. Adicionalmente, a área levantada na placa do polidimetilsiloxano pode ser coberta com um prato plástico invertido do milímetro-diâmetro de 60 para minimizar a evaporação. Em terceiro lugar, o cuidado extremo deve ser exercido ao mover o dispositivo da tensão no microscópio para baixo através do estágio da z-tradução para trazer as pilhas mais perto do COVERSLIP de vidro. Comprimir as células (mesmo por um momento) entre o substrato polidimetilsiloxano e a lamínula de vidro pode causar a morte celular. Em quarto lugar, as células mortas e restos de células podem permanecer presos à lamínula de vidro após a amostra de polidimetilsiloxano ter sido removida. Daqui, após a imagem latente, o lamela de vidro deve ser puxado fora da graxa do vácuo e um lamela fresco deve ser Unido antes de montar uma amostra nova.
As limitações do dispositivo da tensão são que a aplicação do deslocamento lateral do estágio não pode ser programada para executar a tensão cíclica ou ramped e que pode somente aplicar a tensão uniaxial. A limitação do substrato polidimetilsiloxano na geometria descrita é que uma cepa superior a 25% pode causar uma fratura do polidimetilsiloxano.
Uma modificação futura para melhorar o projeto do substrato do polidimetilsiloxano poderia ser a incorporação de uma grade na superfície da cultura da pilha. Isso permitiria rastrear a mesma célula antes e após a aplicação de tensão de tração.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Todos os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento da Fundação Nacional de pesquisa de Singapura através do grupo de pesquisa interdisciplinar da Aliança para a pesquisa e tecnologia (SMART) biosistemas e Micromecânicos (BioSyM) de Singapura-MIT. Os autores Dr. Jagielska e Dr. Van Vliet também reconhecem com gratidão o financiamento e o apoio da Fundação Saks-Kavanaugh. Os autores agradecem a William ONG e o Dr. Sing Yian Chew da Universidade Tecnológica de Nanyang, Singapura, por fornecer células progenitoras oligodendrocyte de ratos para alguns experimentos descritos neste trabalho, e os autores agradecem ao Dr. G. V. Shivashguei de Instituto de mechanobiology, Universidade Nacional de Singapore, Singapore, para discussões sobre flutuações da área nuclear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
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