Summary
Med hjälp av en tidigare utformad enhet för att tillämpa mekanisk påfrestning på anhängare celler, beskriver detta papper en omdesignad underlaget geometri och en anpassad apparat för hög upplöst Single-cell Imaging av ansträngda celler med en 100x olja nedsänkning mål.
Abstract
Extracellulär mekanisk stam är känd för att framkalla cell fenotypisk respons och har fysiologisk relevans i flera vävnads system. För att fånga effekten av tillämpad extracellulär drag belastning på cell populationer in vitro via biokemiska analyser, har en enhet tidigare utformats som kan tillverkas enkelt och är tillräckligt liten för att passa inuti vävnad kultur inkubatorer, samt ovanpå och Mikroskop stadier. Emellertid, den tidigare utformningen av Polydimetylsiloxan underlaget tillät inte hög upplöst subcellulär avbildning via oljeimmersion mål. Detta arbete beskriver en omdesignad geometri av Polydimetylsiloxan underlaget och en anpassad avbildning inställning som tillsammans kan under lätta hög upplöst subcellulär avbildning av levande celler under tillämpad stam. Denna underlaget kan användas med samma, tidigare konstruerade enheten och därmed har samma fördelar som anges ovan, förutom att tillåta hög upplöst optisk avbildning. Utformningen av Polydimetylsiloxan underlaget kan förbättras genom att införliva ett rutnät som kommer att under lätta spårning av samma cell före och efter applicering av stam. Representativa resultat visar hög upplöst time-lapse Imaging av fluorescensmarkerade märkta kärnor inom ansträngda celler fångas med hjälp av den metod som beskrivs här. Dessa nukleära dynamik data ger insikter i mekanismen genom vilken tillämpade drag hållfasthet främjar differentiering av oligodendrocyte stamceller.
Introduction
Celler och vävnader i kroppen utsätts för olika mekaniska LED trådar, inklusive drag stammar. Emellertid, effekterna av dessa signaler på biologi neurala celler har ännu inte studerats utförligt och förstås fullt ut. I centrala nerv systemet, källor av mekanisk stam inkluderar utvecklings tillväxt1,2,3,4, fysiologiska processer såsom ryggmärgs böjning, blod och cerebrospinalvätska Pulsation, och patologiska tillstånd såsom trauma, Axon svullnad, gliaceller ärr bildning, eller tumör tillväxt5,6,7,8. Det är värt att undersöka hur drag hållfasthet påverkar differentieringen av oligodendrocyter och den efterföljande myelinisering av axoner, vilket är en kritisk process i ryggradsdjur centrala nerv systemet. Med hjälp av en specialdesignad stam enhet och elastomer multispot-plattor har tidigare arbeten9,10 visat att statisk enaxial stam kan öka oligodendrocytdifferentiering genom globala förändringar i gen uttryck 10. för att ytterligare förstå mekanismerna för stammechanotransduktion i dessa celler, måste den tidigare experimentella apparaten omformas enligt beskrivningen här, för att möjliggöra hög upplöst fluorescensavbildning av nukleär dynamik i levande celler under stam. Specifikt, en enda brunn Polydimetylsiloxan plattan är utvecklad, och Imaging konfigurationen är omgjorda för att möjliggöra tid-lapse Imaging av levande celler under stam med hjälp av en 100x olja nedsänkning lins. För att eliminera de negativa optiska effekterna av Polydimetylsiloxan i ljuset vägen, celler avbildas inte genom Polydimetylsiloxan plattan, men i omvänd position, genom täckglaset som täcker cell utrymmet. Med hjälp av denna nya Imaging design, hundratals högupplösta time-lapse filmer spelas in, av enskilda cell kärnor inom intakt anhängare celler, där kromatin är märkt med märkning Histon H2B till grönt fluorescerande protein. Dessa filmer visar att drag hållfasthet inducerar förändringar i kromatin struktur och dynamik som är förenliga med utvecklingen av oligodendrocyte differentiering.
Live cell Imaging under tillämpad stam är tekniskt utmanande och kräver en anordning design som är kompatibel med Mikroskop systemet. Den anpassade designen som beskrivs här utgör ett billigt alternativ till kommersiella lösningar. Dess dimensioner möjliggör dess installation på Mikroskop stadier och levande cell avbildning vid hög rumslig upplösning under tillämpad stam. Den Imaging setup är utformad för att under lätta levande cell Imaging med en 100x olja nedsänkning lins med högsta klarhet, genom täckglaset, inte genom skiktet av Polydimetylsiloxan plattan som annars minskar bild kvaliteten och är vanligt i de flesta bild uppställningar under belastning. Enheten, med en monterad platta som innehåller celler, kan också enkelt förvaras i inkubator. Denna enhet är utformad för att tillämpa enaxiell stam till substrat som underlättar vid häftande cell kultur och bibehålla en stabil och enhetlig belastning under flera dagar. Den inställning som beskrivs här kan användas för hög upplöst avbildning av olika anhängare cell typer under stam, vilket gör den tillämplig på mechanotransduction studier inom många områden av cellmechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av enkel-och Polydimetylsiloxan mögel för hög upplöst avbildning
Anmärkning: formen för tillverkning av Polydimetylsiloxan plattor är utformad med följande funktioner för att möjliggöra avbildning med en 100x olja nedsänkning objektiv och en korrekt pass form i den anpassade bygga stam enhet (figur 1a, B).
- Håll den totala plattan dimensioner så att den passar i klämmorna på stammen anordningen.
Obs: här är de 60 mm x 73 mm. - Gör ett cell utrymme eller brunn som är betydligt mindre än hela plattans laterala dimensioner, för att undvika överarning (out-of-plan böjning) effekter som sker vid de ofastspända kanterna av Polydimetylsiloxan plattan under tillämpad stam.
Obs: här har kupén utformats som en 23 mm x 23 mm fyrkant. - Håll cell utrymmets djup så minimal som möjligt (inte mer än 80 μm), för att möjliggöra fokusering med 100x oljenedsänkning objektivet genom locket glaset placeras ovanpå facket, men gör det tillräckligt tillräckligt för att innehålla media och för att undvika att kontakta eller att pressa cellerna.
- Höj cell utrymmet på en kvadrat med en höjd av 3 mm, för att få cellerna närmare linsen i inverterade Mikroskop inställningar för att möjliggöra enkel fokusering.
Obs: formar med ovanstående funktioner kan tillverkas av många tekniker, inklusive, till exempel, frästa aluminium. Alternativt kan Master formar också monteras med hjälp av akryl ark skära med en laser Cutter, täck glas #0 för cell utrymmet, och super lim. Denna Master mögel används för att göra en Polydimetylsiloxan avtryck, som sedan används för att göra arbetet formar med hjälp av en gjutning harts.
2. tillverkning av enkel-och polydimetylsiloxanplattor och kvadratiska fack
- Blanda Polydimetylsiloxan bas och härdare i ett förhållande av 20:1 (vikt) i en disponibel kopp. Väga totalt 20 g Polydimetylsiloxan per mögel (för att göra en Polydimetylsiloxan platta) och 150 g Polydimetylsiloxan per 150 mm i diameter plast skålen (för att göra en sats av kvadratiska fack).
- Lämna Polydimetylsiloxan blandningen i en vakuum avgasaren at-0,8 bar för 30 min (eller tills alla bubblor tas bort).
- Häll Polydimetylsiloxan blandningen i formar (för tallrikar) eller i 150 mm plast rätter (för kvadratiska fack).
- Ta bort eventuella ytterligare bubblor i detta skede, antingen genom att blåsa luft (genom munnen) eller avgasning den Polydimetylsiloxan-fyllda formar/rätter igen på-0,8 bar vakuum för 30 min.
- Lämna forsar/rätter i en 80 ° c ugn på en Utjämnings tabell för 2 h.
- Ta försiktigt bort mögel/rätter från ugnen och låt dem svalna till rums temperatur. Dra försiktigt ut den härdade Polydimetylsiloxan efter noggrann kapning av kanterna med ett blad (figur 1c).
- På 150 mm-diameter Polydimetylsiloxan, rita en 2 cm x 2 cm rutnät med en markör. Inom varje ruta, dra en 1 cm x 1 cm kvadrat, lämnar en marginal på 0,5 cm på alla sidor. Använd ett blad och skär försiktigt längs linjerna för att få kvadratiska fack (figur 2A).
- Rengör polydimetylsiloxanplattorna/kvadratiska fack genom att ruinera dem i 100% aceton för 4 h, följt av 100% etanol för 4 h, följt av autoklaverad vatten för 4 h.
- Placera plattorna/kvadratiska fack på paraffin film bak sidan papper (inte paraffin filmen men papperet) inuti en 150 mm diameter plast skålen (figur 2C).
- Låt polydimetylsiloxanplattan vara i 80 ° c ugnen för att torka i 4 h.
- Försegla den 150 mm-diameter rätter som innehåller Polydimetylsiloxan plattor och behållare rutor med paraffin film, och förvara dem i ett kallt rum tills vidare användning.
3. funktionalisering av polydimetylsiloxanplattor
- Ta bort paraffin filmen, ta bort locket på plast skålen, och placera Polydimetylsiloxan plattor och kvadratiska fack under ultraviolett ljus för 30 min.
- Plasma-Treat (vid 150 W i 5 min) Polydimetylsiloxan plattorna (med cell utrymmet uppåt) utan kvadratiska fack, för att göra kulturen yta hydrophilic.
- Placera omedelbart de fyrkantiga facken på den plasmabehandlade ytan (figur 2b) och tryck manuellt för att tillfälligt hålla ihop de två.
Obs: plasmabehandla inte kvadratiska fack, annars kommer de att hålla fast vid Polydimetylsiloxan plattan och kommer inte att lossas lätt när de måste skalas av under avbildning. - Tillsätt 200 μL av 100 mM (3-aminopropyl) triethoxysilane till brunnen för 2 h att införa-NH2 grupper till Polydimetylsiloxan ytan. För att göra en 100 mM lösning, lös 234 μL ren (3-aminopropyl) triethoxysilane i 10 mL vatten. Efter en 2 h inkubation, Tvätta brunnarna 3x med avjoniserat vatten.
- Väg upp 2 mg av den molekyl ära crosslinkeren bissulfosuccinimidyl och lös upp den i 700 μL 1 M (4-(2-hydroxyeyl) -1-piperazineetan-sulfonsyrabuffert (pH 8,0) och 2,8 mL vatten.
Anmärkning: detta kommer att ge en 1 mM bissulfosuccinimidyl-lösning i 200 mM (4-(2-hydroxyeyl) -1-piperazineetan-sulfonsyrabuffert. Observera att en 50 mM koncentrations buffert också fungerar bra.- Tillsätt 135 μl av denna lösning och 15 μl 1 mg/ml Fibronektin i brunnen i varje polydimetylsiloxanplatta i 4 timmar vid rums temperatur.
- Tvätta 3x med fosfatbuffrad saltlösning. Tillsätt 500 μL fosfatbuffrad saltlösning i brunnen. Täck den 150 mm-diameter skålen som innehåller Polydimetylsiloxan med paraffin film och förvara den i ett kallt rum, tills vidare användning.
4. funktionalisering av plastfat och-kannor
- Inkubera plastfat och kolvar med en 5 μg/mL lösning av poly-D-lysin (PDL, i sterilt vatten) för 1 h. Tillsätt 1,5 mL av denna lösning (ligand) per 35 mm-diameter skålen, 3 mL av den per 60 mm-diameter skålen, och 10 mL per 75 cm2 kulturkolv.
- Tvätta disken och kolvar 2x med sterilt vatten.
- Låt dem torka i biosäkerhets skåpet i 1 h (eller tills de är torra) och förvara dem i kyl rummet vid 4 ° c tills de används.
5. spridnings-och differentierings medium för murina oligodendrocyte progenitorceller
- Bered 50 mL 100x lösningar av spridnings-och differentierings mediet, gör Ali kvoter av 2,5 mL och förvara dem vid-80 ° c.
Anmärkning: sammansättningen av spridnings mediet är 0,1 mg/mL bovint serumalbumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natriumselenit, 1x penicillin-streptomycin, 10 ng/mL trombocyt-derived tillväxt faktor, och 10 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) med hög glukos och Pyruvat. Medan nötkreatur serumalbumin, progesteron, putrescine, och natriumselenit kan utgöras och lagras på 100x, insulin, Holo-transferrin, och penicillin-streptomycin måste tillsättas färskt när du förbereder 1x lösningen. Tillväxtfaktorerna skall utgöras av 10 μg/mL och skall tillsättas varje dag i friska celler (1 μL/mL medium). Sammansättningen av differentierings mediet är 0,1 mg/mL bovint serumalbumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natriumselenit, 1x penicillin-streptomycin, 400 ng/ml triiodothyronine, 400 ng L-tyroxin, och 0,5% Foster nötkreatur serum i DMEM med hög glukos och Pyruvat. Trijodthyronine och L-tyroxin kan utgöras av andra reagenser och förvaras vid 100x. Insulin, Holo-transferrin och penicillin-streptomycin måste tillsättas under beredning av 1x-lösningen. - För beredning av 50 mL 100x spridnings medium, lös upp 510 mg bovint serumalbumin i 17 mL Dulbecco ' s medium, 310 μg progesteron i 31 μL etanol, 80 mg putrescine i 500 μL Dulbecco medium, 25 μg natriumselenit i 10 μL Dulbecco medium och fullständig DMEM upp till 50 mL
- För beredning av 50 mL 100x lösning av differentierings medium, dessutom lös 2 mg trijodtyonin i 40 μL natriumhydroxid och 2 mg L-tyroxin i 40 μL av natriumhydroxid, Fyll sedan upp lösningen till 50 mL med Dulbecco medium. Filtrera lösningen genom en steril engångsfilterenhet, alikvot, och förvara Ali quoterna vid-80 ° c.
- För beredning av 250 mL 1x proliferation/differentiering medium, blanda 2,5 mL 100x lösning av proliferation/differentiering medium med 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL 10 mg/mL insulin och 2,5 mL 100x penicillin-streptomycin. Fyll upp lösningen till 250 mL med Dulbecco medium och filtrera den genom en steril disponibel filter enhet.
Anmärkning: tillväxtfaktorerna måste tillsättas färska och direkt till cell kulturen, inte till hela partiet av rekonstituerat medium.
6. cell kultur
- Börja med oligodendrocyte stamceller suspenderade i spridnings medium. Frö dessa celler med en densitet av 35 000 celler/cm2 på PDL-belagda plast ytor (fat eller kolvar, se avsnitt 4). Justera volymen av spridnings mediet till 3 mL per 10 cm2 av ytan av plast substrat; en lägre volym av mediet kan leda till cell klumpar följd av ytspännings styrkor, medan en högre volym av medium i rätterna kan orsaka spill.
- Tillsätt tillväxtfaktorer (trombocytderived tillväxtfaktor och Fibronektin tillväxtfaktor) varje dag, bibehålla sin koncentration på 10 ng/ml och ändra hälften av spridnings mediet på varannan dag.
- På den tredje dagen, lossa cellerna från plast ytan med hjälp av en mild cell avlossning lösning (t. ex., accutase): ta bort mediet, tvätta 1x med fosfatbuffrad saltlösning, tillsätt 1 mL avlossning lösning per 20 cm2 område, lämna skålen/kolven i en inkubator vid 37 ° c i 10 min, och Knacka försiktigt tills alla celler har lossnat (titta under ett Mikroskop).
- Pipettera med hjälp av en 200 μL spets för att bryta klumpar i enstaka celler, överföra dem till en 50 mL tub, späda dem i spridnings medium, snurra på 0,2 x g i 10 min, Kassera supernatanten och omsuspendera pelleten i spridnings medium för att göra en total volym på 1 ml. Räkna cellerna med en cytometer.
- Tvätta fibronectin-functionalized Polydimetylsiloxan plattor 2x, 15 min per tvätt, med spridnings medium.
- Seed 35 000-celler per Polydimetylsiloxan-platta i 700 μL spridnings medium.
- Lägg till en Plasmid konstruktion av H2B-GFP för märkning Histon H2B med grönt fluorescerande protein.
Obs: här lades 1,4 μL CellLight H2B-GFP BacMam2 transfection mix till varje platta (2 μL per 50 000 celler). - Efter 24 timmar, montera polydimetylsiloxanproverna med celler som ska sträckas på den enaxiella stammen (som visas i figur 2D). Ändra mediet i alla prover till differentierings mediet.
- För att spänna proverna, Mät den oansträngda cell utrymmets längd (figur 3a) och vrid fasens mikrometerskruv för att öka cell utrymmets längd med önskad mängd (t. ex. 10%, se figur 3b). Lämna de utsträckta och osträckta polydimetylsiloxanproverna i inkubator vid 37 ° c till bild tagning.
7. avbildning
- Slå på mikroskopet. Ställ in Mikroskop inkubator temperaturen till 37 ° c.
- Ta det mål som ska användas (100x oljeimmersion) till den centrala positionen som mål tornet kommer inte att vara tillgänglig senare. Skruva loss målet och skruva tillbaka det tillsammans med en objektiv ring (figur 4a) så att målet kan föras närmare cellerna. Om ett olje mål används här, tillsätt en droppe olja i detta steg.
- Syntetisera i förväg (via 3D-utskrifter eller bearbetning) en plast eller metall hållare som har två viktiga egenskaper-ett vinklat fönster och ett steg (figur 4b).
Obs: fönstret stöder en tjocklek #0 glas täckglasen som kommer att hålla mediet medan stammen enheten är i ett inverterat tillstånd. Det vinklade snittet vid fönster kanterna (figur 4D) gör det möjligt att komma närmare glas täckglasen. Steget i hållaren tillåter oss att föra den utsträckta Polydimetylsiloxan längre ner, närmare målet. - Placera en glastäckslip (tjocklek #0, med måtten 25 mm x 25 mm eller 35 mm i diameter) på hållarens ovansida genom att sprida ut vakuum fettet i fönstrets periferi (figur 4c) och tejpa plast fönstret på Mikroskop stadiet ( Figur 4D och figur 5a).
- Skruva ett z-Translation-steg på Mikroskop stadiet och flytta det till den översta z-positionen (figur 5a).
- Avlägsna 500 μL av mediet från den sträckta polydimetylsiloxanplattan som ska avbildas och tillsätt detta medium på glas täckglasen i det vita plast fönstret.
- Ta försiktigt loss det fyrkantiga facket från polydimetylsiloxanplattan med sterila pincetter.
- Håll töjnings anordningen i upprätt läge (cellerna uppåt) ovanför det vita plast fönstret och vänd försiktigt på stammen så att eventuella extra medel tappar direkt i mitten av glas täckglasen (Figur 5b) (cellerna nedåt).
- Placera den nedre delen av stammen på z-Translation-scenen med dubbel häftande tejp (figur 5c, D).
- Medan du tittar genom okularet under brightfield, sakta föra stammen enheten ner (figur 5e) (genom att sänka z-Translation skede) och flytta målet upp för att fokusera på cellerna.
- Utför detta steg extremt långsamt, steg för steg. Om stammen enheten pressar för mycket på täckglasen, kan cellerna komprimeras (vilket får dem att dö) och om målet pressar för mycket på täckglasen, kan täckglasen bryta (orsakar medium för att läcka och spill på målet).
- Skanna Polydimetylsiloxan plattan i x-och y-riktningar för att hitta en cell som har en fluorescerande kärna (under epifluorescens med 488 nm våglängd excitation) och lämplig Cellmorfologi (under brightfield).
- Om den laterala förskjutningen av Mikroskop scenen inte påverkar den vertikala fokuseringen för mycket, Välj flera regioner av intressen med hjälp av en multipoint-funktion på program varan. Ibland är fokuseringen mycket känslig för någon lateral förskjutning av scenen. I sådana fall, bild en cell i taget. Markera x-, y-och z-positionerna för varje cell av intresse.
- Spela in breda fält (eller öppna hål) bilder av kärnan med 488 nm våglängd excitation och av cellen med brightfield excitation med intervaller på 30 s per ram under en total varaktighet på minst 30 min.
8. data analys
-
Nukleära fluktuationer
- Öppna en sekvens med Nucleus-bilder (figur 6a) i ett bild analys program och tröskel-Nucleus-tidsfördröjningsbilder (Använd till exempel kommandot Threshold i imagej eller kommandot GRAYTHRESH i program varan MATLAB).
- Få kärnan området (i pixlar) som en funktion av tiden, rita den i en data plottning program vara (figur 6b), och montera en tredje ordningens polynom till data (figur 6c) (till exempel använda analysen | Montering | Polynomial Fit kommandot i Origin eller polyfit kommandot i program varan MATLAB).
- Subtrahera värdet av den monterade polynom från den faktiska arean (i pixlar) för varje tidpunkt. Detta korrigerade område kallas restareal.
Obs: denna process tar bort alla ökande eller minskande trend i data som kommer från instrumentella fel och kallas detrends.- Beräkna procent andelen restareal genom att dividera restarealen vid varje tidpunkt med värdet av den monterade polynom vid den tidpunkten (figur 6D).
- Beräkna standard avvikelsen för resterande Area tids serier. Denna standard avvikelse betecknar amplituden av nukleära fluktuationer.
-
Data plottning och statistisk analys
- Beräkna amplituden av nukleära fluktuationer som ett medelvärde av minst 20 kärnor per tillstånd.
- Genomföra en enkelriktad analys av var Ian sen statistiskt test med Bonferroni korrigering för att avgöra om det finns en betydande skillnad i amplituden av fluktuationer som en funktion av villkor av intresse (till exempel, med och utan tillämpad stam).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Senaste arbetet med att undersöka effekten av drag belastning på oligodendrocyter10 visade att en 10% enaxiell drag hållfasthet främjar differentiering av oligodendrocyte stamceller genom globala förändringar i gen uttryck. Mekanismen bakom dessa förändringar i gen uttryck kan probed via avbildning av subcellulära parametrar, såsom cytoskelettet struktur, transkription faktor lokalisering, nukleär dynamik, och kromatin organisation. Emellertid, den tidigare geometrin av Polydimetylsiloxan underlaget tillät inte hög upplöst Single-cell Imaging. Som beskrivs i detta arbete, den omarbetade geometrin av Polydimetylsiloxan underlaget och Imaging setup minimerat avståndet mellan cellerna och målet. Detta gör det möjligt att fånga tids fördröjnings bilder av fluorescensmarkerade märkta cell kärnor med ett 100x oljeimmersion mål (figur 6a).
Variationer i det planerade kärn krafts området beror på cellernas differentierings tillstånd11,12. En jämförelse av de nukleära fluktuationerna av oligodendrocyte stamceller och av terminalt differentierade oligodendrocyter visade att de senare har betydligt lägre fluktuationer (figur 6E). Nästa, de nukleära fluktuationerna av oligodendrocyte stamceller vid 1 h, 24 h, och 48 h post-kemisk induktion av differentiering med och utan en 10% drag kraft jämfördes. Med kemisk induktion ensam, amplituden av nukleära fluktuationer visade en signifikant minskning på 48 h men inte vid 24 h (figur 6F). Å andra sidan, kemisk induktion tillsammans med en 10% drag hållfasthet visade en signifikant minskning vid 24 h, som förblev konstant, utan ytterligare minskning vid 48 h (figur 6G).
Under stratum-geometrin och den bild konfiguration som beskrivs i detta dokument möjliggjorde inspelning av högupplösta filmer med ansträngda celler. Efterföljande analys av dessa filmer visade att stammen påskyndar dämpningen av nukleära fluktuationer, vilket är en markör för differentiering. Dessa resultat ger insikt i mekanismen genom vilken stam främjar oligodendrocyte differentiering. Ytterligare diskussion om tolkningen av dessa resultat och framtida experiment beskrivs i Makhija et al.13.
I figur 1: Design och geometri för Polydimetylsiloxan mögel. (A) skiss av mögel som visar alla dimensioner i millimeter (denna skiss genererades av Whits teknik, Singapore). (B) tredimensionell bild av formen (anpassad från Makhija et al.11). Inset visar ett foto av mögel. (C) tredimensionell bild av Polydimetylsiloxan plattan fabricerade med hjälp av mögel (anpassad från Makhija et al.11). Inset visar ett foto av Polydimetylsiloxan plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Preparering av provet. (A) Foto av en polydimetylsiloxanplatta och ett kvadratiskt fack. Bdet fyrkantiga facket placeras på det upphöjda torget på polydimetylsiloxanplattan. Dess syfte är att innehålla medium för cellerna. (C) polydimetylsiloxanplattor lagras i 150 mm-diameter plast rätter med parafilm papper för att förhindra att Polydimetylsiloxan fastnar på plasten. (D) medan du monterar plattan på stammen anordningen, stödja den från botten med två fingrar för att förhindra att hängande av plattan. Om plattan fortfarande slappnar lite efter monteringen, öka avståndet mellan stammen enheten armar genom att vrida översättnings stadiet. I detta steg bör översättningen av scenen inte inducera stam i Polydimetylsiloxan plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: cell sträckning. (A) Mät den initiala längden på plattan mellan klämmorna, med hjälp av en linjal. (B) sträck plattan genom att vrida skruven på översättnings stadiet för att öka den initiala plattlängden med önskad procents ATS. X% ökning av längd motsvarar X% av stammen. Observera att för att generera önskad stam (X%) i det upphöjda cell odlings Utrymmet måste huvud plattan belastas med ett högre belopp (ungefär 2X%) på grund av skillnaden i deras tjocklek i den beskrivna plattan geometri. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Förberedelse för avbildning. (A) sätta 100x mål till den centrala positionen i tornet, skruva loss målet, och skruva tillbaka tillsammans med objektiv ringen. (B) skiss av hållaren som visar alla mått i millimeter. (C) Sprid ut vakuum fettet i fönstrets omkrets i hållaren med hjälp av en pipettspets och placera ett täckglas ovanpå. Använd ett täckglas med tjocklek #0 eller #1, för att möjliggöra fokusering med 100x olje nedsänkning linsen. (D) placera hållaren (1) på Mikroskop stadiet (2). Placera olje (6) målet (3) närmare täckglasen (5) som sitter fast på hållaren med hjälp av vakuum fett (4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: bild inställning på Mikroskop. (A) montera z-Translation-scenen (gul pil) och hållaren (röd pil) på Mikroskop stadiet. (B) luta stammen enheten på Mikroskop scenen så att varje medium släppa på glas täckglaset av innehavaren. Stick en dubbel häftande tejp (blå pil) på stammen enhet som kommer att fastna på z-Translation scenen. Cplacera töjnings anordningen i omvänd position och stödja den på z-Translation-stadiet. Cellerna måste vara i linje med plast hållarens täckglasglas. D) den inverterade geometrin hos stammen minimerar avståndet mellan cellerna och målet, vilket underlättar bild tagning med hög upplösning (anpassad från Makhija m. fl.11). (E) sidovy innan du tar av stam anordningen (1). sido utsikt efter att ha bringat drag anordningen nedåt (2). uppifrån och ned efter att drag anordningen har bringat (3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativa bilder och områdets Fluktuationdata för kärnan. Denna siffra är anpassad från Makhija et al.11. (A) typisk bild av en kärna märkt med Histon H2B taggade med grönt fluorescerande protein, och en differentierande oligodendrocyte progenitorcell. Kärnan är i fokus, medan cell processerna är ur fokus. B) typiska tids serier för ett kärn krafts område (i pixlar). C) tredje ordningens polynom som monterats på uppgifterna. Dprocent andel av tids serierna för kvarvarande areal variationer. (E) nukleära kanten fluktuationer i prolifererande oligodendrocyte stamceller och obotligt differentierade oligodendrocyter. Fnukleär kant fluktuationer vid 1 h, 24 h och 48 h postinduktion av kemisk differentiering utan stam. (G) nukleära området fluktuationer vid 1 h, 24 h, och 48 h postinduktion av kemisk differentiering med 10% drag belastning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enhet har tidigare1 utformats för applicering av extracellulär drag belastning på anhängare celler. Utformningen av polydimetylsiloxanunderlaget i detta arbete var tillräckligt för biokemiska analyser, liksom lågupplösta bilder av utsträckta celler. I detta arbete har under stratum omformats, och en ny avbildning konfiguration som underlättar hög upplöst subcellulär levande cell Imaging infördes. Fördelarna med detta system är många: det kan byggas in-Lab med hjälp av enkla komponenter, är det billigt jämfört med kommersiella stam enheter (500 USD per cell stam enhet), och det är tillräckligt liten för att passa inuti vävnad kultur inkubatorer, samt på Mikroskop. Dessutom, även om bild systemet har beskrivits här med inverterade Mikroskop setup, kan det lätt justeras för upprätt Mikroskop konfiguration.
Det finns några kritiska steg inblandade i prov beredning och avbildning. Först måste Polydimetylsiloxan plattor och kvadratiska fack rengöras grundligt innan cell sådd (protokoll steg 2,8) för att säkerställa cellernas överlevnad (som ohärdat Polydimetylsiloxan är giftigt för celler). För det andra, eftersom volymen av vätske medium som kan passa in i kvadratiska facket är mindre än 1 mL, kan det avdunsta om provet är i inkubator för ett par dagar. Därför måste mediet kontrol leras varje dag och fyllas på vid behov. Dessutom kan det upphöjda området på Polydimetylsiloxan plattan täckas med en inverterad 60 mm-diameter plast skålen för att minimera avdunstning. För det tredje måste extrem försiktighet iakttas vid förflyttning av stammen enheten på Mikroskop ner via z-Translation scenen för att föra cellerna närmare glaset täckglasen. Om cellerna (även för ett ögonblick) komprimeras mellan polydimetylsiloxansubstratet och glas täckglasen kan det orsaka celldöd. För det fjärde kan de döda cellerna och cell skräpet fastna i glas täckglasen efter att polydimetylsiloxanprovet har avlägsnats. Efter avbildning måste därför glas täckglasen dras av från vakuum fettet och en ny täckglasvägg bör fästas innan ett nytt prov monteras.
Begränsningarna för stammen anordningen är att tillämpningen av steg lateral förskjutning inte kan programmeras för att utföra cykliska eller ramped stam och att det endast kan tillämpa enaxiell stam. Begränsningen av polydimetylsiloxanunderlaget i den beskrivna geometrin är att en stam som är högre än 25% kan orsaka en fraktur av Polydimetylsiloxan.
En framtida modifiering för att förbättra utformningen av Polydimetylsiloxan underlaget kan vara införlivandet av ett rutnät på cell odlings ytan. Detta skulle möjliggöra spårning av samma cell före och efter applicering av drag belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Alla författare tacksamt erkänner finansiering stöd från National Research Foundation i Singapore genom Singapore-MIT Alliance för forskning och teknik (SMART) bio Systems och Micromekanik (BioSyM) tvärvetenskaplig forskar grupp. Författarna Dr. Jagielska och Dr van Vliet också tacksamt erkänna finansiering och stöd från Saks-Kavanaugh stiftelsen. Författarna tackar William Ong och Dr Sing Yian Chew från Nanyang Technological University, Singapore, för att ge råtta oligodendrocyte progenitorceller för vissa experiment som beskrivs i detta arbete, och författarna tackar Dr G. V. Shivashankar från Mechanobiology Institute, National University of Singapore, Singapore, för diskussioner om fluktuationer i kärn krafts området.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
