Summary

Generation af 3-D kollagen-baserede Hydrogels til at analysere Axonal vækst og adfærd under nervesystemet udvikling

Published: June 25, 2019
doi:

Summary

Her giver vi en metode til at analysere adfærden af voksende axoner i 3D-matricer, der efterligner deres naturlige udvikling.

Abstract

Denne protokol bruger naturlige type I kollagen til at generere tredimensionale (3-D) hydrogel til overvågning og analyse af axonal vækst. Protokollen er centreret om dyrkning af små stykker af embryonale eller tidlige postnatale gnaver hjerner inde i en 3-D hydrogel dannet af Rottehale Tendon-afledt type I kollagen med specifik porøsitet. Vævs brikker dyrkes inde i hydrogel og konfronteres med specifikke hjerne fragmenter eller genetisk modificerede celle aggregater for at producere og udskille molekyler, der egner sig til at skabe en gradient inde i den porøse matrix. Trinene i denne protokol er enkle og reproducerbare, men omfatter kritiske skridt, der skal overvejes nøje under dens udvikling. Desuden kan adfærden af voksende axoner overvåges og analyseres direkte ved hjælp af et fase-kontrast mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens mikroskop efter fiksering af immunocytokemiske metoder.

Introduction

Neuronal axons, der ender i axonal vækst kegler, migrere lange afstande gennem den ekstracellulære matrix (ECM) af embryonet over specifikke veje til at nå deres passende mål. Vækst keglen er den distale del af Axon, og det er specialiseret til at fornemme det fysiske og molekylære miljø i cellen1,2. Fra et Molekylær synspunkt, vækst kegler er styret af mindst fire forskellige molekylære mekanismer: kontakt attraktion, Chemoattraction, kontakt Repulsion, og chemorepulsion udløst af forskellige axonal Guidance stikord3,4 , 5 ) i , 6. kontakt-medierede processer kan delvist overvåges i todimensionale (2D) kulturer på mikro-mønstrede substrater (f. eks med striber7,8 eller pletter9 , der indeholder molekyler). Dog kan axoner navigere til deres mål på en ikke-difpulsiv måde ved at registrere flere attraktive og frastødende molekyler fra guidepost celler i miljøet4,5,10. Her beskriver vi en nem metode til 3-D kultur for at kontrollere, om et udskilt molekyle inducerer chemorepulsive eller chemoattraktive effekter på udvikling af axoner.

De tidligste undersøgelser havde til formål at bestemme virkningerne af Axon-vejlednings signaler, der anvendes i tredimensionale (3-D) matricer til at generere gradienter, der simulerer in vivo-forhold11,12. Denne fremgangsmåde har sammen med in vivo-eksperimenter gjort det muligt at identificere fire hoved familier med vejlednings signaler: netrins, slidser, semaphoriner og ephrins4,5,6. Disse molekylære signaler og andre faktorer13 er integreret af de voksende axoner, der udløser dynamikken i vedhæftnings komplekser og transducere mekaniske kræfter via cytoskelettet14,15,16. For at generere molekylære gradienter i 3D-kulturer for axonal navigation, brugte banebrydende forskere plasma koagulerings substrater17, som også blev anvendt til organiske udsnitspræparater18. Men, i 1958, en ny protokol til at generere 3-D kollagen silicagelrogeler blev rapporteret til at studere med maximow ́s enheder19, en kultur platform, der anvendes i flere undersøgelser egnet til mikroskopiske observationer20. En anden pioner undersøgelse rapporterede kollagen gel som et værktøj til at indlejre humane fibroblaster for at studere differentieringen af fibroblaster til myofibroblaster i sårhelings processer21. Parallelt hermed anvendte Lumsden og Davies kollagen fra kvæg dermis til at analysere den formodede effekt af nerve vækstfaktoren (NGF) på retningslinjerne for sensoriske nervefibre22. Med udviklingen af nye kultur platforme (f. eks. multi-Well-plader) fra forskellige virksomheder og laboratorier, blev kollagen kulturer tilpasset disse nye anordninger6,23,24,25 ,26. Parallelt hermed blev et ekstrakt af ECM materiale afledt af Engelbreth-Holm-Swarm tumor cellelinje gjort kommercielt tilgængelig for at udvide disse undersøgelser27.

For nylig er flere protokoller blevet udviklet til at generere molekylære gradienter med formodede roller i Axon vejledning ved hjælp af 3-D silicagelrogeler (f. eks kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylet immobiliseres ved forskellige koncentrationer i en porøs matrix (f. eks ngf29) eller genereres ved dyrkning i en lille region af 3-D hydrogel celle aggregater udskilning af molekylet til at generere en radial gradient4,23,24,25,26. Den sidste mulighed vil blive forklaret i denne protokol.

Den procedure, der præsenteres her er en nem, hurtig og meget reproducerbar metode baseret på analyse af axonal vækst i 3-D hydrogel kulturer af den embryonale musehjerne. I sammenligning med andre metoder, er protokollen velegnet til ikke-uddannede forskere og kan være fuldt udviklet efter en kort uddannelse (1-2 uger). I denne protokol, vi først isolere kollagen fra voksne rottehaler til yderligere at generere 3-D matricer, hvor genetisk modificerede celle aggregater er kultiveret foran den embryonale neuronal væv. Disse celle aggregater danner radiale kemiske gradienter af et kandidat molekyle, som fremkalder et respons for de voksende axoner. Endelig kan vurderingen af molekylets virkninger på voksende axoner let udføres ved hjælp af en fasekontrast mikroskopi eller alternativt immunocytokemiske metoder.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne og protokollerne fra den etiske komité for dyreforsøg (CEEA) ved universitetet i Barcelona, og protokollen om anvendelse af gnavere i denne undersøgelse blev revideret og godkendt af CEEA i Universitetet i Barcelona (CEEA’S godkendelse #276/16 og 141/15). 1. rensning af Rottehale kollagen Saml voksne Sprague-Dawley rottehaler (8-9 uger gamle) efter at have ofret dyret efter etiske retningslinjer og skyl i 95% ethanol. Pl…

Representative Results

Her præsenterer vi en alment tilgængelig metode til at studere axonal vækst i 3-D hydrogel kollagen kulturer af embryonale muse nervesystem. Til dette formål isolerede vi kollagen fra voksne rottehaler til at generere 3-D matricer, hvor vi dyrkede genetisk modificerede celle aggregater udtrykker Netrin-1 eller Sema3E konfronteret med embryonale neuronal væv (f. eks CA region i hippocampus). Disse celle aggregater dannede en radialt distribueret gradient af kandidat molekylet inde i kollagen matrix. Til sidst, for at…

Discussion

Væksten i udvikling af axoner er primært invasive og omfatter ECM nedbrydning og Remodeling. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, kan forskerne få en homogen 3-D matrix dannet af den naturlige type I kollagen, hvor axoner (eller celler) kan reagere på en kemisk gradient udskilles af genetisk modificerede celler, som de gør in vivo. Forskellige axonal respons på gradienter af attraktive eller hæmmende stikord (protein, lipider, etc.) kan let sammenlignes med specifik kontrol (mock transficeret celler)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Tom Yohannan for den redaktionelle rådgivning og M. Segura-Feliu for den tekniske assistance. Dette arbejde blev finansieret af CERCA-programmet og af Kommissionen for universiteter og forskning i afdelingen for innovation, universiteter og virksomhedsledelse i Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dette arbejde blev finansieret af det spanske ministerium for forskning, innovation og Universitet (MEICO) gennem BFU2015-67777-R og og RTI2018-099773-B-100, det spanske prion-netværk (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT) og Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Materials

Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) Sigma D5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)  Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) Vector Labs PK-4000
B27 serum-free supplement 50x  Invitrogen 17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit Pierce 23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell lines ATTC CRL-1570
D-(+)-Glucose Sigma 16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium Sigma G8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium Invitrogen 41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures Invitrogen 14200
Ethanol  merck 108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) Sigma E5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) Electron Microscopy Sciences (EMS) 17984-25
Gelatin powder  Sigma G1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) Panreac 211008
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum  Invitrogen 10108-165
Heat-inactivated horse serum  Invitrogen 26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) Sigma 316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium Invitrogen 25030-024
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)  Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Invitrogen 11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) Biolegend 801201
N-2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium  Invitrogen 21103049
Paraformaldehyde Merck 1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x  Invitrogen 15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry Invitrogen AM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse  Vector Labs BA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM) Invitrogen 11058-021
Sodium azide  Panreac 162712
Sodium bicarbonate solution 7.5%  Invitrogen 25080-094
Sterile culture grade H2O  Sigma W3500
TritonTM X-100  Sigma X100
Trizma base  Sigma T1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) Invitrogen 25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection  Fine tools Instruments or similar
1.5-ml conical centrifuge tubes  Eppendorf or similar
15-ml conical centrifuge tubes  Corning or similar
2 haemostats   Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissors Fine tools Instruments or similar
200-ml centrifuge tubes for centrifugation Nalgene or similar
200-ml sterile glass conical flasks
2-litre glass beaker
4- and 6-well culture plates  Nunc 176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips  Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor  Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma D9402
Dialysis tubing closures  Sigma Z37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics  Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes  Nunc  150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin bars IKA or similar
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps  Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces Fine tools Instruments or similar

References

  1. Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gil, V., Del Río, J. A. Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development. J. Vis. Exp. (148), e59481, doi:10.3791/59481 (2019).

View Video