Generation af 3-D kollagen-baserede Hydrogels til at analysere Axonal vækst og adfærd under nervesystemet udvikling
Summary
Her giver vi en metode til at analysere adfærden af voksende axoner i 3D-matricer, der efterligner deres naturlige udvikling.
Abstract
Denne protokol bruger naturlige type I kollagen til at generere tredimensionale (3-D) hydrogel til overvågning og analyse af axonal vækst. Protokollen er centreret om dyrkning af små stykker af embryonale eller tidlige postnatale gnaver hjerner inde i en 3-D hydrogel dannet af Rottehale Tendon-afledt type I kollagen med specifik porøsitet. Vævs brikker dyrkes inde i hydrogel og konfronteres med specifikke hjerne fragmenter eller genetisk modificerede celle aggregater for at producere og udskille molekyler, der egner sig til at skabe en gradient inde i den porøse matrix. Trinene i denne protokol er enkle og reproducerbare, men omfatter kritiske skridt, der skal overvejes nøje under dens udvikling. Desuden kan adfærden af voksende axoner overvåges og analyseres direkte ved hjælp af et fase-kontrast mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens mikroskop efter fiksering af immunocytokemiske metoder.
Introduction
Neuronal axons, der ender i axonal vækst kegler, migrere lange afstande gennem den ekstracellulære matrix (ECM) af embryonet over specifikke veje til at nå deres passende mål. Vækst keglen er den distale del af Axon, og det er specialiseret til at fornemme det fysiske og molekylære miljø i cellen1,2. Fra et Molekylær synspunkt, vækst kegler er styret af mindst fire forskellige molekylære mekanismer: kontakt attraktion, Chemoattraction, kontakt Repulsion, og chemorepulsion udløst af forskellige axonal Guidance stikord3,4 , 5 ) i , 6. kontakt-medierede processer kan delvist overvåges i todimensionale (2D) kulturer på mikro-mønstrede substrater (f. eks med striber7,8 eller pletter9 , der indeholder molekyler). Dog kan axoner navigere til deres mål på en ikke-difpulsiv måde ved at registrere flere attraktive og frastødende molekyler fra guidepost celler i miljøet4,5,10. Her beskriver vi en nem metode til 3-D kultur for at kontrollere, om et udskilt molekyle inducerer chemorepulsive eller chemoattraktive effekter på udvikling af axoner.
De tidligste undersøgelser havde til formål at bestemme virkningerne af Axon-vejlednings signaler, der anvendes i tredimensionale (3-D) matricer til at generere gradienter, der simulerer in vivo-forhold11,12. Denne fremgangsmåde har sammen med in vivo-eksperimenter gjort det muligt at identificere fire hoved familier med vejlednings signaler: netrins, slidser, semaphoriner og ephrins4,5,6. Disse molekylære signaler og andre faktorer13 er integreret af de voksende axoner, der udløser dynamikken i vedhæftnings komplekser og transducere mekaniske kræfter via cytoskelettet14,15,16. For at generere molekylære gradienter i 3D-kulturer for axonal navigation, brugte banebrydende forskere plasma koagulerings substrater17, som også blev anvendt til organiske udsnitspræparater18. Men, i 1958, en ny protokol til at generere 3-D kollagen silicagelrogeler blev rapporteret til at studere med maximow ́s enheder19, en kultur platform, der anvendes i flere undersøgelser egnet til mikroskopiske observationer20. En anden pioner undersøgelse rapporterede kollagen gel som et værktøj til at indlejre humane fibroblaster for at studere differentieringen af fibroblaster til myofibroblaster i sårhelings processer21. Parallelt hermed anvendte Lumsden og Davies kollagen fra kvæg dermis til at analysere den formodede effekt af nerve vækstfaktoren (NGF) på retningslinjerne for sensoriske nervefibre22. Med udviklingen af nye kultur platforme (f. eks. multi-Well-plader) fra forskellige virksomheder og laboratorier, blev kollagen kulturer tilpasset disse nye anordninger6,23,24,25 ,26. Parallelt hermed blev et ekstrakt af ECM materiale afledt af Engelbreth-Holm-Swarm tumor cellelinje gjort kommercielt tilgængelig for at udvide disse undersøgelser27.
For nylig er flere protokoller blevet udviklet til at generere molekylære gradienter med formodede roller i Axon vejledning ved hjælp af 3-D silicagelrogeler (f. eks kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylet immobiliseres ved forskellige koncentrationer i en porøs matrix (f. eks ngf29) eller genereres ved dyrkning i en lille region af 3-D hydrogel celle aggregater udskilning af molekylet til at generere en radial gradient4,23,24,25,26. Den sidste mulighed vil blive forklaret i denne protokol.
Den procedure, der præsenteres her er en nem, hurtig og meget reproducerbar metode baseret på analyse af axonal vækst i 3-D hydrogel kulturer af den embryonale musehjerne. I sammenligning med andre metoder, er protokollen velegnet til ikke-uddannede forskere og kan være fuldt udviklet efter en kort uddannelse (1-2 uger). I denne protokol, vi først isolere kollagen fra voksne rottehaler til yderligere at generere 3-D matricer, hvor genetisk modificerede celle aggregater er kultiveret foran den embryonale neuronal væv. Disse celle aggregater danner radiale kemiske gradienter af et kandidat molekyle, som fremkalder et respons for de voksende axoner. Endelig kan vurderingen af molekylets virkninger på voksende axoner let udføres ved hjælp af en fasekontrast mikroskopi eller alternativt immunocytokemiske metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Væksten i udvikling af axoner er primært invasive og omfatter ECM nedbrydning og Remodeling. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, kan forskerne få en homogen 3-D matrix dannet af den naturlige type I kollagen, hvor axoner (eller celler) kan reagere på en kemisk gradient udskilles af genetisk modificerede celler, som de gør in vivo. Forskellige axonal respons på gradienter af attraktive eller hæmmende stikord (protein, lipider, etc.) kan let sammenlignes med specifik kontrol (mock transficeret celler)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Tom Yohannan for den redaktionelle rådgivning og M. Segura-Feliu for den tekniske assistance. Dette arbejde blev finansieret af CERCA-programmet og af Kommissionen for universiteter og forskning i afdelingen for innovation, universiteter og virksomhedsledelse i Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dette arbejde blev finansieret af det spanske ministerium for forskning, innovation og Universitet (MEICO) gennem BFU2015-67777-R og og RTI2018-099773-B-100, det spanske prion-netværk (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT) og Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
