Сравнительно запись в личиночной данио рерио, с помощью Роман конусообразной Губка наконечник электрода
Summary
Здесь мы представляем протокол, который упрощает измерения света вызвали сравнительно ответов от личинок данио рерио. Роман конусообразной Губка наконечник электрода может помочь сделать изучение визуальной разработки в личиночной данио рерио, используя сравнительно Эрг проще для достижения надежных результатов и низкой стоимости.
Abstract
Данио рерио (Danio рерио) обычно используется как позвоночных модель развития исследований и особенно подходит для визуального нейронауки. Для функциональных измерений визуального исполнения Эрг (ЭРГ) является идеальным неинвазивный метод, который был хорошо установленных в высших позвоночных видов. Этот подход все чаще используется для изучения зрительной функции в данио рерио, в том числе на ранних стадиях развития личинок. Однако наиболее часто используемые записи электрод для личинок данио рерио Эрг на сегодняшний день является Стеклянный электрод микропипеткой, которая требует специализированного оборудования для его производства, бросая вызов для лабораторий с ограниченными ресурсами. Здесь мы представляем протокол Эрг личиночной данио рерио, используя конусообразные Губка наконечник электрода. Роман электрод легче производства и ручкой, более экономично и меньше шансов повредить личиночной глаз, чем микропипеткой стекла. Как ранее опубликованные Эрг методы текущий протокол может оценить внешней функции сетчатки через фоторецептор и биполярных клеток ответов, a – и b волны, соответственно. Протокол можно четко иллюстрируют уточнение зрительной функции на протяжении раннего развития личинок данио рерио, поддерживая Утилита, чувствительность и надежность Роман электрода. Упрощенная электрод особенно полезна при создании новой системы Эрг или модификации существующих малых животного ERG аппарат для измерения данио рерио, помогая исследователям в визуального нейронауки использовать данио рерио модели организма.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) стала широко используемых генетических позвоночных модели, включая исследования визуального нейронауки. Растущая популярность этого вида можно объяснить преимущества, включая легкость генетической манипуляции, высоко сохранены позвоночных зрительной системы (нейрон типы, анатомические морфологии и организации и базовой генетики), высокая плодовитость и более низкая стоимость животноводства, по сравнению с млекопитающих модели1. Неинвазивная сравнительно (ЭРГ) уже давно клинически используется для оценки человеческой зрительной функции и в лабораторных условиях для количественного определения видения в ряде крупных и мелких видов, в том числе грызуны и личинок данио рерио2,3 , 4 , 5. наиболее часто анализируемого Эрг компоненты в волны и волны b, происходящих из светочувствительных фоторецепторы и биполярный интернейронов, соответственно. В личиночной данио рерио 3 дня после оплодотворения (dpf) устанавливаются различные слои в сетчатке и Морфология конуса фоторецепторных терминала синапсов Зрелые до 4 dpf6,7. Таким образом внешней сетчатки функции личиночной данио рерио устанавливается до 4 dpf, означает, что Эрг измеримые от этого раннего возраста начиная. Из-за короткий цикл экспериментальных и высок объём свойства модели Эрг был применен к личиночной данио рерио для функциональной оценки болезни моделей, анализ развития цвет видение и сетчатки, изучение визуального циркадные ритмы и тестирования препаратов8,9,10,,1112.
Однако нынешние подходы для личинок данио рерио Эрг имеет некоторые сложности, которые могут сделать это труднее принять. Опубликованные личиночной данио рерио Эрг протоколы обычно используют стекло микропипеткой, наполненный проводящие жидкости как запись электрод3,4,5,13, которое требует высокого качества микропипеткой подсказка3. Специализированное оборудование, например микропипеткой съемник и в некоторых случаях microforge, необходимых для их производства. Это может быть проблемой для лабораторий с ограниченными ресурсами и приводит к дополнительную плату даже при адаптации имеющихся небольших животных Эрг систем для измерения личиночной данио рерио зрительной функции. Даже когда сглаживаются, кончик острый микропипеткой может повредить поверхность личиночной глаза. Кроме того коммерческие микропипеткой Держатели для электрофизиологии построены с фиксированной серебряной проволокой. Эти несъемные провода стали пассивируется после повторного использования, требующих покупки новых держателей, ведущих к увеличению эксплуатационных расходов.
Здесь мы описываем метод Эрг, используя конусообразные Губка Совет запись электрода, что особенно полезно для адаптации установленных малых животных Эрг установок для личинок данио рерио Эрг измерений. Электрод легко производится с использованием общей Губка поливинилацетатные (ПВА) и тонкой серебряной проволоки без каких-либо другое специализированное оборудование. Наши данные показывают, что этот роман электрод является чувствительным и достаточно надежным, чтобы продемонстрировать функционального развития сетчатки нейронных цепей в личиночной данио рерио между 4 и 7 dpf. Это экономичный и практичный Губка наконечник электрода может быть полезным для исследователей, создания новых систем Эрг или модификации существующих систем малых животных, данио рерио исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Функциональные устройства индикации как Эрг стали все более важное значение в набор инструментов, используемых для изучения личиночной данио рерио8,9,12,14. Из-за небольшого размера глаза личиночной данио рерио стекло …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этого проекта была оказана грант от Мельбурнский Институт неврологии (PTG, PRJ и BVB).
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. . Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
