Vi præsenterer her, en protokol, der forenkler måling af lys evoked electroretinogram svar fra larve zebrafisk. En roman kegle-formede svamp-tip elektrode kan bidrage til at gøre studiet af visuelle udvikling i larve zebrafisk bruger electroretinogram ERG lettere at opnå med pålidelige resultater og lavere omkostninger.
Zebrafisk (Danio rerio) er almindeligt anvendt som en hvirveldyr model i udviklingsmæssige undersøgelser og er især velegnet til visuelle neurovidenskab. For funktionelle målinger af visuel ydeevne er electroretinography (ERG) en ideel non-invasiv metode, som har været veletablerede i højere vertebrater. Denne tilgang er i stigende grad anvendes til at undersøge den visuelle funktion i zebrafisk, herunder under den tidlige larve udviklingsstadier. Den hyppigst anvendte optagelse elektrode til larve zebrafisk ERG til dato er imidlertid glas mikropipette elektrode, som kræver specialudstyr til dens fremstilling, præsentere en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer. Her præsenterer vi en larve zebrafisk ERG protokollen ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip elektrode. Roman elektroden er lettere at fremstilling og håndtag, mere økonomisk og mindre tilbøjelige til at skade larve øjet end glas mikropipette. Ligesom tidligere udgivne ERG ‘s metoder, kan den nuværende protokol vurdere ydre retinal funktion gennem fotoreceptor og bipolar celle svar, a – og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan klart illustrere forfinelse af visuelle funktion i hele den tidlige udvikling af zebrafisk larver, støtte til nytte, følsomhed og pålidelighed af de nye elektrode. Den forenklede elektrode er især nyttig, når oprettelse af en ny ERG system eller ændre eksisterende små-dyrs ERG apparater til måling af zebrafisk, medvirken forskere i de visuelle neurovidenskab bruge zebrafisk model organisme.
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en udbredt genetiske hvirveldyr model, herunder undersøgelser af de visuelle neurovidenskab. Den stigende popularitet af denne art kan tilskrives fordele, herunder brugervenlighed genmanipulation, stærkt bevarede hvirveldyr visuelle system (neuron typer, anatomiske morfologi og organisation og underliggende genetik), høj frugtbarhed og lavere udgifter til dyrehold i forhold til pattedyr modeller1. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har længe været anvendt klinisk til at vurdere menneskets visuelle funktion, og i laboratoriet indstilling til at kvantificere vision i en række store og små arter herunder gnavere og larver zebrafisk2,3 , 4 , 5. de oftest analyseres ERG komponenter er en bølge og b-bølge, stammer fra den oplyse-sensing fotoreceptorer og bipolær interneurons, henholdsvis. I larver zebrafisk, adskilte lag i nethinden er etableret af 3 dage efter befrugtningen (dpf) og morfologi af fotoreceptor kegle terminal synapser modne før 4 dpf6,7. Ydre retinal funktion af larve zebrafisk er således etableret før 4 dpf, hvilket betyder, at ERG er målelige fra denne tidlige alder og fremefter. På grund af den korte eksperimentelle cyklus og høj overførselshastighed egenskaber af modellen, har ERG udlignet larve zebrafisk for funktionel vurdering af sygdomsmodeller, analysere farve vision og retinal udvikling, studere visuelle døgnrytmen og test narkotika8,9,10,11,12.
Men nuværende strategier for larver zebrafisk ERG har nogle kompleksiteter, som kan gøre det sværere at vedtage. Offentliggjorte larve zebrafisk ERG protokoller bruger normalt en glas mikropipette fyldt med ledende væske som den optagelse elektrode3,4,5,13, der kræver en høj kvalitet mikropipette Tip3. Specialiseret udstyr, såsom en mikropipette aftrækker og i nogle tilfælde en microforge, der kræves til deres fremstilling. Dette kan være en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer og medfører ekstra omkostninger selv når tilpasning tilgængelige små dyr ERG systemer til måling af larve zebrafisk visuel funktion. Selv når glattede, kan skarpe mikropipette tip beskadige larve øjets overflade. Derudover er kommercielle mikropipette holdere til Elektrofysiologi konstrueret med en fast sølvtråd. Disse faste ledninger blive passivated efter gentagen brug, som kræver køb af nye indehavere fører til øgede vedligeholdelsesudgifter.
Her beskriver vi et ERG-metoden ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip optagelse elektrode, der er særligt nyttig for at tilpasse etablerede små-dyrs ERG opsætninger for larver zebrafisk ERG målinger. Elektroden er let lavet ved hjælp af fælles polyvinylacetat (PVA) svamp og fine sølvtråd uden nogen andre specialiseret udstyr. Vores data viser, at denne roman elektrode er følsomme og pålidelige nok til at påvise funktionelle udviklingen af retinale neurale kredsløb i larve zebrafisk mellem 4 og 7 dpf. Denne økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttigt at forskere om oprettelse af nye ERG systemer eller ændre eksisterende små-animalsk systemer, for zebrafisk undersøgelser.
Funktionelle udlæsninger som ERG er blevet stadig vigtigere i suite af værktøjer, der anvendes til at studere larve zebrafisk8,9,12,14. På grund af den lille størrelse af larve zebrafisk øjet er glas Mikropipetter blevet tilpasset som optagelse elektroder i mest publicerede protokoller3,4,5,…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen af dette projekt blev leveret af et tilskud fra Melbourne Neuroscience Institute (til PTG, PRJ & BVB).
0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |