Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Electroretinogram optagelse i larve zebrafisk ved hjælp af en roman kegle-formede svamp-tip elektrode

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

Vi præsenterer her, en protokol, der forenkler måling af lys evoked electroretinogram svar fra larve zebrafisk. En roman kegle-formede svamp-tip elektrode kan bidrage til at gøre studiet af visuelle udvikling i larve zebrafisk bruger electroretinogram ERG lettere at opnå med pålidelige resultater og lavere omkostninger.

Abstract

Zebrafisk (Danio rerio) er almindeligt anvendt som en hvirveldyr model i udviklingsmæssige undersøgelser og er især velegnet til visuelle neurovidenskab. For funktionelle målinger af visuel ydeevne er electroretinography (ERG) en ideel non-invasiv metode, som har været veletablerede i højere vertebrater. Denne tilgang er i stigende grad anvendes til at undersøge den visuelle funktion i zebrafisk, herunder under den tidlige larve udviklingsstadier. Den hyppigst anvendte optagelse elektrode til larve zebrafisk ERG til dato er imidlertid glas mikropipette elektrode, som kræver specialudstyr til dens fremstilling, præsentere en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer. Her præsenterer vi en larve zebrafisk ERG protokollen ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip elektrode. Roman elektroden er lettere at fremstilling og håndtag, mere økonomisk og mindre tilbøjelige til at skade larve øjet end glas mikropipette. Ligesom tidligere udgivne ERG 's metoder, kan den nuværende protokol vurdere ydre retinal funktion gennem fotoreceptor og bipolar celle svar, a - og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan klart illustrere forfinelse af visuelle funktion i hele den tidlige udvikling af zebrafisk larver, støtte til nytte, følsomhed og pålidelighed af de nye elektrode. Den forenklede elektrode er især nyttig, når oprettelse af en ny ERG system eller ændre eksisterende små-dyrs ERG apparater til måling af zebrafisk, medvirken forskere i de visuelle neurovidenskab bruge zebrafisk model organisme.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en udbredt genetiske hvirveldyr model, herunder undersøgelser af de visuelle neurovidenskab. Den stigende popularitet af denne art kan tilskrives fordele, herunder brugervenlighed genmanipulation, stærkt bevarede hvirveldyr visuelle system (neuron typer, anatomiske morfologi og organisation og underliggende genetik), høj frugtbarhed og lavere udgifter til dyrehold i forhold til pattedyr modeller1. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har længe været anvendt klinisk til at vurdere menneskets visuelle funktion, og i laboratoriet indstilling til at kvantificere vision i en række store og små arter herunder gnavere og larver zebrafisk2,3 , 4 , 5. de oftest analyseres ERG komponenter er en bølge og b-bølge, stammer fra den oplyse-sensing fotoreceptorer og bipolær interneurons, henholdsvis. I larver zebrafisk, adskilte lag i nethinden er etableret af 3 dage efter befrugtningen (dpf) og morfologi af fotoreceptor kegle terminal synapser modne før 4 dpf6,7. Ydre retinal funktion af larve zebrafisk er således etableret før 4 dpf, hvilket betyder, at ERG er målelige fra denne tidlige alder og fremefter. På grund af den korte eksperimentelle cyklus og høj overførselshastighed egenskaber af modellen, har ERG udlignet larve zebrafisk for funktionel vurdering af sygdomsmodeller, analysere farve vision og retinal udvikling, studere visuelle døgnrytmen og test narkotika8,9,10,11,12.

Men nuværende strategier for larver zebrafisk ERG har nogle kompleksiteter, som kan gøre det sværere at vedtage. Offentliggjorte larve zebrafisk ERG protokoller bruger normalt en glas mikropipette fyldt med ledende væske som den optagelse elektrode3,4,5,13, der kræver en høj kvalitet mikropipette Tip3. Specialiseret udstyr, såsom en mikropipette aftrækker og i nogle tilfælde en microforge, der kræves til deres fremstilling. Dette kan være en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer og medfører ekstra omkostninger selv når tilpasning tilgængelige små dyr ERG systemer til måling af larve zebrafisk visuel funktion. Selv når glattede, kan skarpe mikropipette tip beskadige larve øjets overflade. Derudover er kommercielle mikropipette holdere til Elektrofysiologi konstrueret med en fast sølvtråd. Disse faste ledninger blive passivated efter gentagen brug, som kræver køb af nye indehavere fører til øgede vedligeholdelsesudgifter.

Her beskriver vi et ERG-metoden ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip optagelse elektrode, der er særligt nyttig for at tilpasse etablerede små-dyrs ERG opsætninger for larver zebrafisk ERG målinger. Elektroden er let lavet ved hjælp af fælles polyvinylacetat (PVA) svamp og fine sølvtråd uden nogen andre specialiseret udstyr. Vores data viser, at denne roman elektrode er følsomme og pålidelige nok til at påvise funktionelle udviklingen af retinale neurale kredsløb i larve zebrafisk mellem 4 og 7 dpf. Denne økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttigt at forskere om oprettelse af nye ERG systemer eller ændre eksisterende små-animalsk systemer, for zebrafisk undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle electroretinogram (ERG), der blev udført efter bestemmelserne i den australske National sundhed og Medical Research Council adfærdskodeks for pasning og brug af dyr og blev godkendt af den institutionelle Dyreetik på den University of Melbourne.

1. buffer forberedelse

  1. Forberede 10 x guldfisk ringelyden bufferen (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukose, 100 mM HEPES) ved hjælp af omvendt osmose (RO) vand. Justere buffer til pH 7,8 og sterilisere bufferen ved hjælp af 0,22 μm filter. Gemme 10 x buffer ved 4 ° C som løsning stock3.
    Bemærk: 10 x Ringer's buffer skal bruges indenfor 3 måneder.
  2. På dagen af forsøget, skal du gøre 1 x guldfisk ringelyden bufferen ved at fortynde 10 x guldfisk ringelyden bufferen ved hjælp af omvendt osmosevand.
    Bemærk: 1 x guldfisk ringelyden bufferen bruges til at mætte PVA svamp, herunder svamp anvendes til placering af larve zebrafisk, og svamp på optagelse elektrode spids.

2. elektrode forberedelse

  1. Forberede kegle-formede svamp optagelse elektrode.
    1. Skær den mandlige ende fra platinum elektrode bly udvidelse og Fjern fra slutningen 10 mm af den ydre polytetrafluorethylen isolering belægning ved hjælp af en skalpel klinge. Passe på ikke for at beskadige de indvendige wire elektrode bly.
    2. Skære en 40 mm længde af sølv wire (0,3 mm i diameter) og sikkert tillægger dette elektrode føringen af blander fornemt sølvtråd med udsatte indvendige wiren. Encase fælles hjælp af isolerende tape, forlader en ~ 15 mm længde af sølvtråd udsat (figur 1A).
    3. Elektroplade den udsatte sølvtråd med klorid ved hjælp af et 9 V DC kilde for 60 s at forbedre signal overledning. Fordybe den udsatte sølv tip i normal saltvand og Tilslut anden enden til pluspolen på batteriet. Tilslut en anden ledning til den negative terminal af batteriet og fordybe anden enden af wiren i den saltholdige2.
      Bemærk: Alternativt, chlorinate den sølvtråd af gennemvædning det i 1 time i en blegemiddelopløsning (aktive ingrediens 42 g/L natriumhypochlorit).
    4. Skære en ~ 20 mm x 20 mm square PVA svamp bruger saks til at gøre en kegle (figur 1A). Mætte svamp bruger 1 x Ringer's buffer. Under et mikroskop med en skalalinjen på okularet, skal du bruge en skalpel blade til at forme apex Cone ~ 40 µm diameter. Luft tørre den kegle-formede svamp på absorberende papir væv, indtil den er solidt.
      Bemærk: PVA svamp udvider markant når mættet, derfor er det vigtigt, at svampen først er mættet med saltvand før forme apex af kegle.
    5. Efter chloriding tørre luft sølvtråd på en absorberende væv i 5 min. Indsæt sølvtråd til tørrede, solid, kegleformet PVA svampen gennem bunden af kegle. Isolere eventuelle overskydende udsatte metal ved hjælp af maske tape til at reducere fotovoltaiske artefakter (Figur 1B-C).
      Bemærk: Efter hver eksperimentelle session, skal du fjerne svamp fra den sølvtråd. Vask svamp ved hjælp af omvendt osmosevand og luft tørre for genbrug. For at sikre optimale signal samling, anbefales enkelt brug af sølvtråd. PVA svampe må ikke genbruges mere end 5 gange.
    6. På dagen for eksperimentet, fordybe svamp-spidsen af optagelse elektrode i 1 x Ringer's buffer i mindst 15 min. til fuldt mætte svamp.
  2. Forberede referenceelektroder, som beskrevet ovenfor, men uden at knytte svamp spidsen.
  3. Få jorden elektrode kommercielt.

3. zebrafisk forberedelse

  1. Mørke tilpasse zebrafisk larver natten (> 8 h) før optagelser ved at placere zebrafisk i en 15 mL tube (< 20 larver pr tube) i aluminiumsfolie i en mørk inkubator. Fjerne låget for at sikre tilstrækkelig ilttilførsel.
  2. På dagen for optagelse, stramme låget til folie-indpakkede falcon røret indeholder larver og sikre, at røret er lyset-bevis. Transport larver til ERG lab.
  3. Hæld fisken i petriskåle i mørke med bistand fra svagt rød belysning fra en lysdiode (LED; 17.4 cd.m-2, λmax 600 nm). Dække petriskåle ved hjælp af lys-bevis håndklæder for at minimere lys eksponering.

4. svamp Platform forberedelse

  1. Klip et rektangel af tørre PVA svamp til at passe stramt i en 35 mm petriskål. Sikre, at tykkelsen af svampen bør være nogenlunde svarer til dybden af petriskålen.
  2. Gør et lille snit lodret gennem ene ende af svamp til at rumme referenceelektrode sølvtråd.
  3. Sættetid PVA svamp i 1 x guldfisk ringelyden bufferen indtil mættet. Anbring svampen i en ren 35-mm petriskål. Brug et stykke køkkenrulle til at absorbere ekstra væske, indtil ingen løsning udstråler fra svamp i svar til en lys finger presse.

5. dyr og elektrode placering

  1. Bedøver larverne ved hjælp af 0,02% tricaine fortyndes i 1 x guldfisk ringelyden bufferen.
  2. Brug en 3 mL Pasteur pipette til at overføre en bedøvede larve over på en firkant af papir håndklæde (~ 3 cm2).
  3. Placer et stykke køkkenrulle indeholdende larve på fugtig svamp-platformen ved hjælp af pincet. Brug en fin pensel dyppet i Ringer's buffer til at justere placeringen af larve. Sikre at ene øje vender opad, isoleret fra nærliggende væske på kvadratet på køkkenrulle nedenunder larve.
  4. Glasur larve kroppen, undtagen i hovedet, med moisturizing eye gel til at holde larve fugtig hele ERG optagelse.
  5. Placer petriskål med svamp platform på en lille vand-opvarmet platform foran Ganzfeld skål lys stimulus beliggende inde i et Faraday bur (fig. 1 d).
    Bemærk: Vedligeholdelse af temperaturen i svamp og larver kroppen sikrer stabil ERG signaler.
  6. Indsæt referenceelektrode i snittet i platform svamp (fig. 1 d).
  7. Tilslut den kommercielt fremstillede jorden elektrode til Faraday bur.
  8. Tillægger en elektrode indehaveren optagelse elektrode og sikre indehaveren med stereotaxisk armen af en micromanipulator (fig. 1 d). Brug en 3 mL Pasteur pipette til at dryppe en dråbe af 1 x Ringers løsning på svamp spids af elektrode til fornyet mætning.
  9. Placer mikroskop i Faraday bur over ERG platform for placering af elektroden.
    Bemærk: Belysning bør varetages af et svagt røde LED (17.4 cd.m-2, λmax 600 nm) at give observation af larve og placeringen af den aktive elektrode, samtidig opretholde dark-adaptation.
  10. Justere placeringen af svamp platform til at tillade observation af larve under mikroskop. Brug derefter absorberende væv til at fjerne overskydende væske fra elektrode svamp spids.
  11. Placer den aktive elektrode, så det rører forsigtigt larve zebrafisk øjet (figur 1E) centrale hornhindens overflade.
  12. Flytte Ganzfeld skål mod svamp platform og sikre, at larve er omfattet af skålen.
  13. Luk Faraday bur for at reducere elektromagnetisk støj.

6. Electroretinogram optagelse

  1. Brug af computersoftware af ordningen særlig ERG (se tabel af materialer for detaljer) til at udløse stimulien og erhverve data baseret på indstillingerne for anbefales under2.
    1. Indstil samplingshastigheden for systemet til 4 KHz over en 650 ms optagelse vindue (2,560 point) i erhvervelse software.
    2. Indstille forstærkningen af systemet til 1.000 ×.
    3. Indstille båndpas filtrering af systemet til 1 – 300 Hz.
    4. Brug et notch-filter til at reducere 60 Hz (eller 50 Hz, afhængigt af lokale forsyningsselskab frekvens) støj.
      Bemærk: Den ideelle støjniveau bør ikke være mere end ±10 µV.
  2. Påbegynde indsamling af data ved hjælp af nedenstående fremgangsmåde.
    1. Bruge en enkelt test-flash (0,06 log cd.s/m2) til at måle en test svar fra øjet til at vurdere placeringen af elektroder.
      Bemærk: Denne intensitet af test flash bør resultere i en b-bølge amplitude større end 25 µV i 4-dpf larver. Hvis en robust svar ikke kan måles, derefter flytte elektroderne og gøre en anden test flash til at bekræfte, at elektroderne er godt positioneret.
    2. Efter test-flash, tillade, at dyr til mørk tilpasse i 3 min. i komplet mørke før optagelser.
    3. Øjeblikket blinker fra lysdæmper til lysere lys intensiteter.
    4. Gennemsnitlige signaler på tværs af gentager efter signal-støj-niveau.
      Bemærk: Generelt, gennemsnitlig flere signaler på lysdæmper lys niveauer (ikke færre end 3 gentagelser) og færre på de lysere lys niveauer (normalt 1 gentagelse). Gradvist forlænge Inter stimulus intervallet fra 10 til 60 s fra den dimmest til lyseste lysniveau. En prøve protokol er vist i tabel 1.
    5. Efter optagelserne, humant Dræb larverne med 0,1% tricaine.

7. analyse

  1. Måle en bølge amplitude fra baseline til negativ a-wave lavpunktet og b-bølge amplitude fra negativ a-wave lavpunktet at positive b-wave peak.
  2. Måle de a - og b-bølge implicitte gange fra stimulus debut til truget af en bølge og toppen af b-bølge, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette afsnit indeholder repræsentative resultater for ERG målinger taget dagligt fra 4 til 7 dpf. Fra 4 dpf Vis ERG 's svar robust a - og b-bølge komponenter, som opstår fra fotoreceptorer og bipolar celler, henholdsvis. I hver alder testet, b-bølge amplitude steg med lysintensiteten (figur 2; Figur 3). Navnlig, følsomheden af larve zebrafisk nethinden til lysdæmper blinker øges med alderen. A - og b-bølgen var ikke genkendelige ved intensitet lavere end-1.61 log cd.s/m2 på 4 dpf, mens klare signaler blev påviselig ved disse intensiteter for ældre larver (figur 2). B-bølge svar voksede betydeligt mellem 4 og 5 dpf (P < 0,0001; Figur 2A -B; Figur 3B). Selv om b-wave ved lavere intensitet viste lille ændring mellem 5 og 7 dpf, signal på 2,48 log cd.s/m2 var større på 7 dpf sammenlignet med 5 og 6 dpf (P < 0,0001; Figur 2; Figur 3B). A - og b-bølge implicitte gange blev væsentligt hurtigere efter 5 dpf (P < 0,0001; Figur 3 c -D). Samlet, disse resultater viser modning af zebrafisk retinal funktion mellem 4 til 7 dpf. Interessant nok, syntes en bølge amplitude at falde fra 5 til 7 dpf (figur 3A). Dette kan skyldes, at modningen af synaptiske forbindelser i den ydre retina forkorter latenstiden for bipolar celler svar, hvilket resulterer i hurtigere b-bølge debut, der skjuler en bølge. Dem, der ønsker at studere en bølge kan ansætte farmakologiske behandling til blok post photoreceptoral svar (dvs. komponenten b-bølge).

Figure 1
Figur 1: zebrafisk G anzfeld ERG sat op med kegle-formede svamp-tip elektrode. (A) den kegle-formede svamp spids og chlorerede sølv elektrode er lufttørret før konstruere svamp-tip elektrode. (B-C) Efterfølgende, indsættes de chlorerede sølvtråd svamp kegle gennem base til at danne det komplette elektrode. (D) i den typiske larve zebrafisk Ganzfeld ERG setup, indsættes referenceelektrode svamp platform og zebrafisk larve er omfattet af Ganzfeld skål. (E) svamp-tip elektrode rører forsigtigt larve øjets centrale hornhindens overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative gennemsnitlige ERG spor af wild-type larve zebrafisk. Gennemsnitlig ERG spor af vildtype zebrafisk på (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7), og (D) 7 dpf (n = 9). Svar var fremkaldt ved hjælp af blinker fra hvide lysdioder. I hver alder, sporene vise svar til glimt af (fra bund til top)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0,06, 0.72, 1,55, 1.89, 2.18, 2,48 log cd.s/m2. Skalalinjen = 50 µV. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ERG a - og b-bølge amplituder og implicitte gange for 4 til 7 dpf zebrafisk. (A) gruppe gennemsnitlig (± standard fejl af middelværdien) a-bølge amplitude steg med flash intensitet men faldt med alder i 4-7 dpf larver. (B) gennemsnitlige b-bølge amplitude i 4-7 dpf larver steg med flash intensitet; amplitude voksede mellem 4 og 5 dpf. (C) gennemsnitlig a-wave implicitte tid og (D) gennemsnitlige b-bølge implicitte tid blev hurtigere mellem 5, 6 og 7 dpf. Linjer for bedste pasform er afledt af ikke-lineær regression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Stimulus lysintensitet (log cd.s.m-2) Antallet af gentagelser Inter stimulus interval (s)
-2.75 3-6 10
(30 s før næste)
-2.11 3-6 10
(30 s før næste)
-1.61 3-6 10
(30 s før næste)
-0.81 3-6 10
(60 s før næste)
0,06 3-6 10
(60 s før næste)
0.72 1 til 3 60
1,55 1 til 3 60
1.89 1 til 3 60
2.18 1 til 3 60
2,48 1 til 3 60

Tabel 1: Eksempel protokol af ERG optagelser. Stimulus præsentationer starter fra dimmest (øverst) og fremskridt til lysere (nederst) lys niveauer, med gradvis længere mellem stimulus mellemrum for at sikre, at mørke tilpasning opretholdes. Antallet af signaler i gennemsnit på hver intensitet afhænger af signal-støj-niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Funktionelle udlæsninger som ERG er blevet stadig vigtigere i suite af værktøjer, der anvendes til at studere larve zebrafisk8,9,12,14. På grund af den lille størrelse af larve zebrafisk øjet er glas Mikropipetter blevet tilpasset som optagelse elektroder i mest publicerede protokoller3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. her beskriver vi en larve zebrafisk ERG protokollen ved hjælp af en enklere kegle-formede svamp-tip elektrode. Roman elektroden kan bruges til at ændre standard små-dyrs ERG systemer til at måle larve zebrafisk retinal funktion uden nogen ekstra udstyr. Materialer til at lave svamp-tip elektrode er blot kommercielle PVA svamp og 0,3 mm sølv wire, hvilket gør det mere økonomisk end tidligere metoder. En anden fordel er, at i modsætning til den hårde og skarpe mikropipette spids, blidere elektrode svamp spids er mindre tilbøjelige til at skade larve øjet. Endelig, PVA svamp bidrager til at opretholde fugt til larve øjet hele optagelsen.

Nøglen til vellykket anvendelse af svamp-tip elektrode er at sikre fuld mætning af svampen. Dette tager normalt ikke mindre end 15 minutter af iblødsætning i 1 x guldfisk ringelyden bufferen. Ufuldstændig mætning af svampen kan øge støj på grund af hurtigere tørring af elektrode. For bedre signal samling, gør nye elektroder for hver eksperimentelle session (generelt < 8 h) er stærkt anbefales. Gentagen brug kan føre til nedsat ERG signaler, vanskeliggør Inter session sammenligninger.

Ved placering af larve zebrafisk på svamp platform, skal sørges for at sikre, at øjet skal måles ikke er i kontakt med nogen omkringliggende løsning eller køkkenrulle nedenunder fisken. Sådan kontakt shorts det elektriske kredsløb, som referenceelektrode er indlejret i svamp platformen og reducerer ERG.

Selv med godt mættet elektrode svamp tips opstår gradvis tørring, hvilket er tydeligt som øget støj i ERG signaler. Hvis dette sker, dryp en dråbe af 1 x guldfisk Ringers på soklen af kegle ved hjælp af 1 mL sprøjte og en 30 G x ½" nål. Hvis du tilføjer løsningen på svamp spidsen ikke reducerer støjniveauet, Kontroller, at øjet ikke er i kontakt med en omkringliggende væske og sikre at elektrode tip er centreret på den hornhinde apex.

Optagelser i de repræsentative resultater rapporteret her blev foretaget med en bandpass indstilling af 1 – 300 Hz, som ikke tillader prøveudtagning af oscillerende potentialer (OP) — bølger på b-bølge stammer fra de tredje ordens retinal neuroner herunder amacrine og ganglion celler 15,16,17. En højere lowpass indstilling (fx, 500 eller 1.000 Hz) kan være bedre egnet til OP optagelse.

I Resumé, kegle-formede svamp-tip elektrode hjælper med at forenkle larve zebrafisk ERG optagelse med eksisterende små-dyrs ERG systemer, giver pålidelige resultater. Repræsentative resultater viser, at ERG amplitude vokser mellem 4 og 5 dpf, med yderligere modning mellem 5 og 7 dpf manifesterer sig som hurtigere implicitte gange. Vores enkle ERG protokol med økonomisk og praktisk kegle-formede svamp-tip elektrode kan gavne efterforskere studerer zebrafisk retinal funktion. Teknikken kan også tilpasses for at vurdere voksen zebrafisk eller andre hvirveldyr modeller med små øjne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger er relevante for dette arbejde.

Acknowledgments

Finansieringen af dette projekt blev leveret af et tilskud fra Melbourne Neuroscience Institute (til PTG, PRJ & BVB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. Academic Press. 143-151 (2018).
  2. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. e54158 (2016).
  3. Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
  4. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 57-68 (2002).
  5. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
  6. Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56, (3), 222-236 (2003).
  7. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72, (3), 302-327 (2012).
  8. Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16, (5), 881-888 (1999).
  9. Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3, (6), e201703000003 (2017).
  10. Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. dmm. 035220 (2018).
  11. Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11, (2), 995-1003 (2015).
  12. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010).
  13. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135, (1-2), 205-210 (2004).
  14. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222, (4), 564-570 (2001).
  15. Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87, (5), 459-466 (2008).
  16. Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 17-36 (2002).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555, (1), 153-173 (2004).
Electroretinogram optagelse i larve zebrafisk ved hjælp af en roman kegle-formede svamp-tip elektrode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter