Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.
Der Zebrabärbling (Danio Rerio) wird allgemein als ein Wirbeltier Modell in Studien verwendet und eignet sich besonders für visuelle Neurowissenschaften. Für Funktionsmessungen der Sehleistung ist Zitterrochens (ERG) eine ideale nicht-invasive Methode, die in höheren Wirbeltierarten bestens etabliert hat. Dieser Ansatz wird zunehmend eingesetzt, für die Prüfung der Sehfunktion im Zebrafisch, auch während der frühen Entwicklungen Larvenstadien. Allerdings ist die am häufigsten verwendeten Aufnahme-Elektrode für Larven Zebrafisch ERG bisher Mikropipette Glaselektrode, die speziellen Ausrüstung für seine Herstellung, stellen eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen erfordert. Hier präsentieren wir Ihnen ein Larven Zebrafisch-ERG-Protokoll mit einer kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode. Die neuartige Elektrode ist einfacher zu Herstellung und Griff, sparsamer und weniger anfällig für die Larven Auge als das Glas Mikropipette schädigen. Wie zuvor veröffentlichten ERG Methoden kann das aktuelle Protokoll äußere retinale Funktion durch Photorezeptor und bipolar-Zell-Antworten, die a – und b-Welle, bzw. bewerten. Das Protokoll kann die Verfeinerung der visuellen Funktion während der frühen Entwicklung von Zebrafischlarven, Unterstützung der Dienstprogramm, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der neuartige Elektrode verdeutlichen. Die vereinfachte Elektrode ist besonders nützlich bei der Errichtung eines neuen ERG oder ändern von bestehenden kleinen Tier ERG Vorrichtung zum Zebrafisch-Messung, Beihilfe Forscher in den visuellen Neurowissenschaften der Zebrabärbling verwenden Modell Organismus.
Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist eine verbreitete genetische vertebrate Modell, einschließlich Studien der visuellen Neurowissenschaften geworden. Die zunehmende Beliebtheit dieser Spezies kann Vorteile einschließlich einfache Genmanipulation, hoch konservierte vertebrate visuelle System (Neuron Typen, anatomischen Morphologie und Organisation sowie zugrunde liegende Genetik), hohe Fruchtbarkeit zugeschrieben werden und geringere Kosten für die Tierhaltung im Vergleich zu Säugetieren Modelle1. Die nicht-invasive Elektroretinogramm (ERG) ist seit langem verwendet klinisch menschlichen visuellen Funktion zu beurteilen und in der Laborumgebung zu quantifizieren, Vision in einer Reihe von großen und kleinen Arten, darunter Nagetiere und Larven Zebrafisch2,3 , 4 , 5. der am häufigsten untersuchten ERG Komponenten sind die a-Welle und b-Welle, mit Ursprung aus dem lichtempfindlichen Photorezeptoren und bipolar Interneuronen, beziehungsweise. Im Larvenstadium Zebrafisch unterschiedliche Schichten in der Netzhaut werden durch 3 Tage nach Befruchtung (Dpf) festgelegt und die Morphologie des Kegels Photorezeptor terminal Synapsen Reife vor 4 Dpf6,7. Damit ist äußere retinale Funktion des larvalen Zebrafisch festgelegt vor 4 Dpf, was bedeutet, dass die ERG von diesem frühen Alter ab messbar ist. Wegen der kurzen experimentellen Zyklus und Hochdurchsatz-Eigenschaften des Modells ist die ERG an Larven Zebrafisch für funktionelle Beurteilung der Krankheitsmodelle, angewendet worden Analyse Vision und Retinal Farbentwicklung, Studium der visuellen zirkadianen Rhythmen und8,9,10,11,12Drogen testen.
Aktuelle Ansätze für Larven Zebrafisch ERG hat jedoch einige Schwierigkeiten, die es erschweren können, anzunehmen. Veröffentlichten Larven Zebrafisch ERG Protokolle verwenden häufig ein Glas Mikropipette mit leitfähigen Flüssigkeit gefüllt, wie die Aufnahme Elektrode3,4,5,13, wonach eine hochwertige Mikropipette Tipp3. Spezielle Ausrüstung, wie z. B. einer Mikropipette Puller und in einigen Fällen ein Microforge, sind für ihre Herstellung benötigt. Dies kann eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen und führt zu Mehrkosten, auch bei der Anpassung zur Verfügung kleine Tier ERG Systeme zur Messung von Larven Zebrafisch Sehfunktion. Auch wenn geglättet, kann die scharfe Mikropipette Spitze Larven Augenoberfläche beschädigen. Darüber hinaus sind kommerzielle Mikropipette Halterungen für Elektrophysiologie mit einer festen Silberdraht gebaut. Diese festen Drähten werden sich wiederholende Nachgebrauch, erfordert den Kauf von neuen Inhaber führt zu erhöhten Instandhaltungskosten passiviert.
Hier beschreiben wir eine ERG-Methode mit einer kegelförmigen Schwamm-Spitze Aufzeichnung Elektrode, das ist besonders nützlich für die Anpassung der etablierten kleinen Tier ERG Setups für Larven Zebrafisch ERG Messungen. Die Elektrode ist leicht gemacht mit gemeinsamen Polyvinylacetat (PVA) Schwamm und feinem Silberdraht ohne spezielle Ausrüstung. Unsere Daten zeigen, dass diese neuartige Elektrode empfindlich und zuverlässig genug, um die funktionelle Entwicklung des retinalen neuronale Schaltkreise im Larvenstadium Zebrafisch zwischen 4 und 7 Dpf zu demonstrieren. Diese wirtschaftliche und praktische Schwamm-Tip Elektrode kann Forscher zur Gründung neuer ERG Systeme oder ändern von bestehenden kleinen Tier-Systeme für Zebrafisch Studien sinnvoll sein.
Funktionale anzeigen wie die ERG haben in die Suite von Tools zur Untersuchung Larven Zebrafisch8,9,12,14immer wichtiger geworden. Aufgrund der geringen Größe des larvalen Zebrafisch Auges haben Glas Mikropipetten angepasst, als Aufnahme Elektroden in den veröffentlichten Protokollen3,4,5,</sup…
The authors have nothing to disclose.
Finanzierung für dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss aus dem Melbourne Neuroscience Institute (PTG, PRJ & BVB) zur Verfügung gestellt.
0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |