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Developmental Biology

Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

Abstract

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) wird allgemein als ein Wirbeltier Modell in Studien verwendet und eignet sich besonders für visuelle Neurowissenschaften. Für Funktionsmessungen der Sehleistung ist Zitterrochens (ERG) eine ideale nicht-invasive Methode, die in höheren Wirbeltierarten bestens etabliert hat. Dieser Ansatz wird zunehmend eingesetzt, für die Prüfung der Sehfunktion im Zebrafisch, auch während der frühen Entwicklungen Larvenstadien. Allerdings ist die am häufigsten verwendeten Aufnahme-Elektrode für Larven Zebrafisch ERG bisher Mikropipette Glaselektrode, die speziellen Ausrüstung für seine Herstellung, stellen eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen erfordert. Hier präsentieren wir Ihnen ein Larven Zebrafisch-ERG-Protokoll mit einer kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode. Die neuartige Elektrode ist einfacher zu Herstellung und Griff, sparsamer und weniger anfällig für die Larven Auge als das Glas Mikropipette schädigen. Wie zuvor veröffentlichten ERG Methoden kann das aktuelle Protokoll äußere retinale Funktion durch Photorezeptor und bipolar-Zell-Antworten, die a - und b-Welle, bzw. bewerten. Das Protokoll kann die Verfeinerung der visuellen Funktion während der frühen Entwicklung von Zebrafischlarven, Unterstützung der Dienstprogramm, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der neuartige Elektrode verdeutlichen. Die vereinfachte Elektrode ist besonders nützlich bei der Errichtung eines neuen ERG oder ändern von bestehenden kleinen Tier ERG Vorrichtung zum Zebrafisch-Messung, Beihilfe Forscher in den visuellen Neurowissenschaften der Zebrabärbling verwenden Modell Organismus.

Introduction

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Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist eine verbreitete genetische vertebrate Modell, einschließlich Studien der visuellen Neurowissenschaften geworden. Die zunehmende Beliebtheit dieser Spezies kann Vorteile einschließlich einfache Genmanipulation, hoch konservierte vertebrate visuelle System (Neuron Typen, anatomischen Morphologie und Organisation sowie zugrunde liegende Genetik), hohe Fruchtbarkeit zugeschrieben werden und geringere Kosten für die Tierhaltung im Vergleich zu Säugetieren Modelle1. Die nicht-invasive Elektroretinogramm (ERG) ist seit langem verwendet klinisch menschlichen visuellen Funktion zu beurteilen und in der Laborumgebung zu quantifizieren, Vision in einer Reihe von großen und kleinen Arten, darunter Nagetiere und Larven Zebrafisch2,3 , 4 , 5. der am häufigsten untersuchten ERG Komponenten sind die a-Welle und b-Welle, mit Ursprung aus dem lichtempfindlichen Photorezeptoren und bipolar Interneuronen, beziehungsweise. Im Larvenstadium Zebrafisch unterschiedliche Schichten in der Netzhaut werden durch 3 Tage nach Befruchtung (Dpf) festgelegt und die Morphologie des Kegels Photorezeptor terminal Synapsen Reife vor 4 Dpf6,7. Damit ist äußere retinale Funktion des larvalen Zebrafisch festgelegt vor 4 Dpf, was bedeutet, dass die ERG von diesem frühen Alter ab messbar ist. Wegen der kurzen experimentellen Zyklus und Hochdurchsatz-Eigenschaften des Modells ist die ERG an Larven Zebrafisch für funktionelle Beurteilung der Krankheitsmodelle, angewendet worden Analyse Vision und Retinal Farbentwicklung, Studium der visuellen zirkadianen Rhythmen und8,9,10,11,12Drogen testen.

Aktuelle Ansätze für Larven Zebrafisch ERG hat jedoch einige Schwierigkeiten, die es erschweren können, anzunehmen. Veröffentlichten Larven Zebrafisch ERG Protokolle verwenden häufig ein Glas Mikropipette mit leitfähigen Flüssigkeit gefüllt, wie die Aufnahme Elektrode3,4,5,13, wonach eine hochwertige Mikropipette Tipp3. Spezielle Ausrüstung, wie z. B. einer Mikropipette Puller und in einigen Fällen ein Microforge, sind für ihre Herstellung benötigt. Dies kann eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen und führt zu Mehrkosten, auch bei der Anpassung zur Verfügung kleine Tier ERG Systeme zur Messung von Larven Zebrafisch Sehfunktion. Auch wenn geglättet, kann die scharfe Mikropipette Spitze Larven Augenoberfläche beschädigen. Darüber hinaus sind kommerzielle Mikropipette Halterungen für Elektrophysiologie mit einer festen Silberdraht gebaut. Diese festen Drähten werden sich wiederholende Nachgebrauch, erfordert den Kauf von neuen Inhaber führt zu erhöhten Instandhaltungskosten passiviert.

Hier beschreiben wir eine ERG-Methode mit einer kegelförmigen Schwamm-Spitze Aufzeichnung Elektrode, das ist besonders nützlich für die Anpassung der etablierten kleinen Tier ERG Setups für Larven Zebrafisch ERG Messungen. Die Elektrode ist leicht gemacht mit gemeinsamen Polyvinylacetat (PVA) Schwamm und feinem Silberdraht ohne spezielle Ausrüstung. Unsere Daten zeigen, dass diese neuartige Elektrode empfindlich und zuverlässig genug, um die funktionelle Entwicklung des retinalen neuronale Schaltkreise im Larvenstadium Zebrafisch zwischen 4 und 7 Dpf zu demonstrieren. Diese wirtschaftliche und praktische Schwamm-Tip Elektrode kann Forscher zur Gründung neuer ERG Systeme oder ändern von bestehenden kleinen Tier-Systeme für Zebrafisch Studien sinnvoll sein.

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Protocol

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Alle Elektroretinogramm (ERG) Verfahren gemäß den Bestimmungen der australischen National Health and Medical Research Council Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt wurden und institutionellen Tierethik zu vom Ausschuss angenommen wurden die Universität von Melbourne.

1. Puffer Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die 10 x Goldfisch Ringer Puffer (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 10 mM MgCl2, 25 mm CaCl2100 mM Glukose, 100 mM HEPES) mit Umkehrosmose (RO) Wasser. Passen Sie den Puffer pH 7,8 und sterilisieren Sie den Puffer mit 0,22-μm-Filter zu. Speichern Sie die 10-fach Puffer bei 4 ° C als Lösung Lager3.
    Hinweis: 10 x Ringerlösung Puffer sollte innerhalb von 3 Monaten verwendet werden.
  2. Am Tag des Experiments machen Sie 1 x Goldfisch Ringerlösung Puffer durch die 10 x Goldfisch Ringer Puffer mit Umkehr-Osmose-Wasser verdünnen.
    Hinweis: 1 x Goldfisch Ringer Puffer wird verwendet, um den PVA-Schwamm, einschließlich des Schwamms verwendet für die Platzierung der Larven Zebrafisch, und den Schwamm auf der Elektrodenspitze Aufnahme zu sättigen.

2. Elektrode Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die kegelförmigen Schwamm Aufnahme Elektrode.
    1. Schneiden Sie den Stecker aus der Platin-Elektrode Blei Erweiterung und entfernen Sie am Ende 10 mm der äußeren Polytetrafluorethylen Isolierung Beschichtung mit einem Skalpellklinge. Achten Sie darauf, nicht um das innere Seil von der Elektrode Blei zu beschädigen.
    2. Ein 40 mm Schnittlänge von Silberdraht (0,3 mm Durchmesser) und befestigen Sie dies sicher mit der Elektrode Leitung von Silberdraht mit dem belichteten inneren Draht Liebesbeziehung. Umhüllen Sie das Gelenk mit Isolierband, ein ~ 15 mm Länge von Silberdraht ausgesetzt (Abbildung 1A).
    3. Galvanisieren der exponierten Silberdraht mit Chlorid mit einer 9 V DC-Quelle für 60 s, Signal-Leitung zu verbessern. Tauchen Sie die exponierten silberne Spitze in normalen Kochsalzlösung und verbinden Sie das andere Ende mit dem Pluspol der Batterie. Schließen Sie einen weiteren Draht an den Minuspol der Batterie und Tauchen Sie das andere Ende des Drahtes in der saline2.
      Hinweis: Alternativ chloren Sie das Silberdraht durch Einweichen es für 1 Stunde in einem Bleichmittel-Lösung (Wirkstoff 42 g/L Natriumhypochlorit).
    4. Schneiden Sie ein ~ 20 mm x 20 mm Quadrat von PVA Schwamm mit einer Schere zu einem Kegel (Abbildung 1A). Sättigen Sie den Schwamm mit 1 x Ringer Puffer. Unter dem Mikroskop mit einer Maßstabsleiste am Okular verwenden einer Skalpellklinge die Spitze des Kegels auf ~ 40 µm Durchmesser zu gestalten. Luft trocknen den kegelförmigen Schwamm auf saugfähigem Papier Gewebe, bis sie fest ist.
      Hinweis: Die PVA Schwamm deutlich erweitert, wenn gesättigt, somit ist es wichtig, dass der Schwamm zuerst mit Kochsalzlösung gesättigt ist, bevor Sie die Spitze des Kegels Gestaltung.
    5. Nach Chloriding lufttrocknen Silberdraht auf ein saugfähiges Gewebe für 5 min. Insert Silberdraht in den getrockneten, feste, kegelförmige PVA Schwamm durch die Basis des Kegels. Isolieren Sie überschüssige exponierten Metall mit Maske Klebeband, um Photovoltaik-Artefakte (Abbildung 1 b-C) zu reduzieren.
      Hinweis: Entfernen Sie nach jeder experimentellen den Schwamm aus der Silberdraht. Waschen Sie den Schwamm mit Umkehr-Osmose-Wasser und Luft trocknen für Wiederverwendung. Um optimale Signal-Sammlung zu gewährleisten, empfiehlt Einzelnutzung Silberdraht. PVA-Schwämme sollte nicht mehr als 5 mal wiederverwendet werden.
    6. Am Tag des Experiments Tauchen Sie die Schwamm-Spitze der Elektrode Aufnahme in 1 x Ringer Puffer für mindestens 15 Minuten, den Schwamm vollständig zu sättigen.
  2. Bereiten Sie Referenzelektroden, wie oben, jedoch ohne Befestigung der Schwamm Tipp beschrieben.
  3. Erhalten Sie die Masseelektrode im Handel.

(3) Zebrafisch-Vorbereitung

  1. Dunkelheit anzupassen Zebrafischlarven über Nacht (> 8 h) vor der Aufnahmen durch die Platzierung von Zebrafisch in einer 15 mL Tube (< 20 Larven pro Röhre) eingewickelt in Alufolie in einem dunklen Inkubator. Entfernen Sie den Deckel um ausreichende Sauerstoffversorgung sicherzustellen.
  2. Am Tag der Aufnahme ziehen Sie den Deckel der folienverpackte Falcon-Röhrchen mit Larven und sicherstellen Sie, dass die Röhre lichtdicht ist. Larven an der ERG-Labor zu transportieren.
  3. Gießen Sie den Fisch in Petrischalen im Dunkeln mit Hilfe von dim rote Beleuchtung aus einer Leuchtdiode (LED; 17,4 cd.m-2, λMax. 600 nm). Decken Sie Petrischalen mit lichtdichten Handtücher, um Belichtung zu minimieren.

(4) Schwamm Plattform Vorbereitung

  1. Schneiden Sie ein Rechteck von trockenen PVA schwamm gemütlich in einem 35 mm Petrischale passen. Sicherstellen Sie, dass die Dicke des Schwamms in die Tiefe der Petrischale ungefähr gleich sein sollte.
  2. Machen Sie einen kleinen Schnitt senkrecht durch ein Ende des Schwamms, Silberdraht der Bezugselektrode unterzubringen.
  3. 1 x Goldfisch Ringerlösung Puffer bis gesättigt einziehen Sie den PVA Schwamm. Dann setzen Sie den Schwamm in einer sauberen 35-mm-Petrischale. Verwenden Sie ein Papiertuch, zusätzliche Flüssigkeit aufzunehmen, bis keine Lösung aus dem Schwamm in Reaktion auf einen leichten Finger drücken strahlt.

5. Tier- und Positionierung der Elektrode

  1. Die Larven mit 0,02 % Tricaine in 1 x Goldfisch Ringer Puffer verdünnt zu betäuben.
  2. Verwenden Sie eine 3 mL Pasteurpipette, um einem narkotisierten Larve auf ein Quadrat aus Papierhandtuch (~ 3 cm2) übertragen.
  3. Legen Sie das Papierhandtuch, enthält die Larve auf die feuchten Schwamm-Plattform mit Pinzette. Verwenden Sie einen feinen Pinsel getränkt in Ringerlösung Puffer um die Position von der Larve. Sicherzustellen Sie, dass ein Auge nach oben, steht isoliert von Flüssigkeiten in der Nähe auf dem Platz des Papiertuch unter der Larve.
  4. Glasieren des Larven Körpers, außer dem Kopf, mit feuchtigkeitsspendenden Augengel, die Larve während der Aufzeichnung ERG feucht zu halten.
  5. Positionieren Sie die Petrischale mit Schwamm-Plattform auf einer kleinen Warmwasser Plattform vor der Ganzfeld Schüssel Lichtreiz befindet sich im Inneren ein Faradayscher Käfig (Abbildung 1).
    Hinweis: Aufrechterhaltung der Temperatur der Schwamm und die Larven Körper sorgt für stabile ERG Signale.
  6. Legen Sie die Bezugselektrode in den Schnitt in der Plattform Schwamm (Abbildung 1).
  7. Verbinden Sie die kommerziell erworbenen Masseelektrode mit der Faraday-Käfig.
  8. Befestigen Sie die Aufnahme-Elektrode ein Elektrodenhalter und sichern Sie die Halterung an der stereotaktischen Arm von einem Mikromanipulator (Abbildung 1). Verwenden Sie eine 3 mL Pasteurpipette einen Tropfen von 1 x Ringer Lösung auf die Schwamm-Spitze der Elektrode für Re Sättigung zu Tropfen.
  9. Positionieren Sie das Mikroskop in der Faraday-Käfig über die ERG-Plattform für die Platzierung der Elektroden.
    Hinweis: Beleuchtung sollte durch eine dunkel rote LED (17,4 cd.m-2, λMax. 600 nm) ermöglicht die Beobachtung von der Larve und Platzierung der aktiven Elektrode Beibehaltung Dark-adaptation erfolgen.
  10. Passen Sie die Position der Schwamm Plattform zur Beobachtung der Larve unter dem Mikroskop zu ermöglichen. Verwenden Sie dann saugfähigem Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit aus der Elektrodenspitze Schwamm zu entfernen.
  11. Positionieren Sie die aktive Elektrode so, dass es leicht die zentrale Hornhautoberfläche des Auges Larven Zebrafisch (Abbildung 1E) berührt.
  12. Verschieben der Ganzfeld-Schüssel in Richtung der Schwamm-Plattform und sorgen dafür, dass die Larve durch die Schüssel abgedeckt ist.
  13. Schließen Sie den Faraday-Käfig um irrelevante elektromagnetisches Rauschen zu reduzieren.

(6) Elektroretinogramm Aufnahme

  1. Verwenden die Computer-Software bestimmten ERG-Systems (siehe Tabelle der Materialien für Details) den Reiz auslösen und Erfassung von Daten basierend auf den Einstellungen unter2empfohlen.
    1. Legen Sie die Abtastrate des Systems bis 4 KHz über eine 650 ms Aufnahme Fenster (2.560 Punkte) in der Software zur Datenerfassung.
    2. Legen Sie die Verstärkung des Systems auf 1.000 ×.
    3. Bandpass-Filter des Systems auf 1 – 300 Hz eingestellt.
    4. Notch-Filter verwenden, um 60 Hz (oder 50 Hz, abhängig von der lokalen Versorgungsunternehmen Frequenz) reduzieren Lärm.
      Hinweis: Der ideale Geräuschpegel sollte nicht mehr als ± 10 µV.
  2. Beginnen Sie Datenerfassung mit dem unten beschriebenen Verfahren.
    1. Verwenden Sie ein einzelnes Testblitz (0,06 Log cd.s/m2) eine Test-Reaktion aus dem Auge zu beurteilen, die Positionierung der Elektroden zu messen.
      Hinweis: Diese Intensität Testblitz sollte eine b-Wellen-Amplitude größer als 25 µV bei 4-Dpf Larven führen. Wenn eine starke Reaktion gemessen werden kann, dann positionieren Sie die Elektroden und das andere tun testen Blitz zu bestätigen, dass die Elektroden gut positioniert sind.
    2. Nach dem Test-Blitz, erlauben das Tier zu dunkel für 3 min in völliger Dunkelheit vor Aufnahmen anzupassen.
    3. Blinkt aus Dimmer, heller Lichtintensitäten zu präsentieren.
    4. Durchschnittliche Signale über wiederholt nach dem Signal-Rausch-Niveau.
      Hinweis: In der Regel durchschnittlich mehr Signale mit dem dimmer Licht (nicht weniger als 3 Wiederholungen) und weniger, bei helleren Lichtverhältnisse (normalerweise 1 wiederholen). Nach und nach verlängern die inter-Stimulus-Intervall von 10 bis 60 s von der dunkelsten zur hellsten Licht Ebene. Ein Probe-Protokoll ist in Tabelle 1dargestellt.
    5. Nach den Aufnahmen menschlich töten Sie Larven mit 0,1 % Tricaine.

7. Analyse

  1. Messen Sie a Wellenamplitude gegenüber dem Ausgangswert, negative a-Wellenwanne und die negativen a-Wellenwanne b Wellenamplitude zum Gipfel positive b-Welle.
  2. Messen Sie die a - und b-Welle implizite Zeiten von Reiz Beginn der Trog der a-Welle und dem Höhepunkt der b-Welle, bzw..

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Representative Results

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Dieser Abschnitt enthält repräsentative Ergebnisse für ERG Messungen täglich von 4 auf 7 Dpf. ERG Antworten anzeigen von 4 Dpf robuste a - und b-Welle-Komponenten, die jeweils aus Photorezeptoren und bipolaren Zellen entstehen. In jedem Alter getestet erhöht die Amplitude der b-Welle mit Lichtintensität (Abbildung 2; Abbildung 3). Vor allem die Empfindlichkeit der Netzhaut Larven Zebrafisch, dimmer Blitze mit zunehmendem Alter erhöht. Die a - und b-Welle waren nicht erkennbar bei Intensitäten niedriger als-1.61 cd.s/m2 bei 4 Dpf, melden Sie sich, während klare Signale an diese Intensitäten für ältere Larven (Abbildung 2) nachweisbar waren. Die b-Welle Antwort wuchs im Wesentlichen zwischen 4 und 5 Dpf (P < 0,0001; Abbildung 2A -B; Abb. 3 b). Obwohl die b-Welle bei geringeren Intensitäten wenig Veränderung zwischen 5 und 7 Dpf zeigte, war das Signal bei 2,48 Log cd.s/m2 größer bei 7 im Vergleich zu 5 und 6 Dpf Dpf (P < 0,0001; Abbildung 2; Abb. 3 b). A - und b-Welle implizite Zeiten wurden nach 5 Dpf deutlich schneller (P < 0,0001; Abbildung 3 -D). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse Reifung der Zebrafisch retinale Funktion zwischen 4 bis 7 Dpf. Interessanterweise erschien ein Wellenamplitude verringern von 5 bis 7 Dpf (Abb. 3A). Dies kann sein, weil die Reifung der synaptischen Verbindungen in der äußeren Netzhaut die Latenz der Bipolarzellen Antworten verkürzt, was zu schneller Beginn der b-Welle, die Masken die a-Welle. Diejenigen, die die a-Welle studieren können pharmakologische Behandlung Block Post-photoreceptoral Reaktionen (d. h. die b-Welle-Komponente) beschäftigen.

Figure 1
Abbildung 1: Zebrafish G Anzfeld ERG einrichten mit der kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode. (A) den kegelförmigen Schwamm Tipp und chlorierte Silberelektrode sind luftgetrocknet vor dem Bau der Schwamm-Tip Elektrode. (B-C) Anschließend wird die chlorierten Silberdraht in Kegels Schwamm durch die Basis bilden die vollständige Elektrode eingefügt. (D) im typischen Larven Zebrafisch Ganzfeld-ERG-Setup wird die Bezugselektrode in die Schwamm-Plattform eingefügt und der Zebrafisch-Larven unterliegt der Ganzfeld-Schüssel. (E) die Schwamm-Spitze Elektrode berührt sanft die zentrale Hornhautoberfläche des larvalen Auges. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative durchschnittliche ERG Spuren von Wildtyp Larven Zebrafisch. Durchschnittliche ERG Spuren der Wildtyp Zebrafisch bei (A) 4 Dpf (n = 8), (B) 5 Dpf (n = 8), (C) 6 Dpf (n = 7), und (D) 7 Dpf (n = 9). Antworten wurden entlockte Verwendung von weißen LED blinkt. In jedem Alter, die Spuren zeigen Reaktionen auf Lichtblitze (von unten nach oben)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0,06, 0,72, 1,55, 1,89, 2.18, 2,48 anmelden cd.s/m2. Maßstabsleiste = 50 µV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: ERG-a - und b-Wellen-Amplituden und implizite Zeiten für 4 bis 7 Dpf Zebrafisch. (A) Gruppe Durchschnitt (± Standardfehler des Mittelwerts) a-Welle-Amplitude mit Blitzintensität erhöht, aber mit dem Alter in 4 – 7 Dpf Larven verringert. (B) durchschnittliche b-Wellenamplitude in 4 – 7 Dpf Larven mit Blitzintensität erhöht; Amplitude wuchs zwischen 4 und 5 Dpf. (C) durchschnittliche a-Welle implizite und (D) durchschnittliche b-Welle implizite Zeit wurde schneller zwischen 5, 6 und 7 Dpf. Linien der Ausgleichsgerade stammen aus nicht-lineare Regression. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Leichte Reizintensität (Log cd.s.m-2) Anzahl der Wiederholungen Inter-Stimulus-Intervall (s)
-2.75 3 bis 6 10
(30 s vor dem nächsten)
-2.11 3 bis 6 10
(30 s vor dem nächsten)
-1.61 3 bis 6 10
(30 s vor dem nächsten)
-0.81 3 bis 6 10
(60 s vor dem nächsten)
0,06 3 bis 6 10
(60 s vor dem nächsten)
0,72 1 bis 3 60
1,55 1 bis 3 60
1,89 1 bis 3 60
2.18 1 bis 3 60
2.48 1 bis 3 60

Tabelle 1: Beispiel Protokoll ERG Aufnahmen. Stimulus Präsentationen beginnen die dunkelsten (oben) und des Fortschritts, heller (unten) Lichtverhältnisse mit zunehmend länger inter-Stimulus Intervalle um sicherzustellen, dass diese dunklen Anpassung beibehalten wird. Die Anzahl der Signale, die im Durchschnitt bei jeder Intensität hängt von der Signal-Rausch-Ebene.

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Discussion

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Funktionale anzeigen wie die ERG haben in die Suite von Tools zur Untersuchung Larven Zebrafisch8,9,12,14immer wichtiger geworden. Aufgrund der geringen Größe des larvalen Zebrafisch Auges haben Glas Mikropipetten angepasst, als Aufnahme Elektroden in den veröffentlichten Protokollen3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. hier beschreiben wir eine Larven Zebrafisch ERG-Protokoll mit einer einfacheren kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode. Die neuartige Elektrode kann verwendet werden, um kleine Tier ERG Standardsysteme zur Messung der Larven Zebrafisch retinale Funktion ohne zusätzliche Geräte zu ändern. Die Materialien für die Herstellung der Schwamm-Tip Elektrode sind einfach kommerzielle PVA Schwamm und 0,3 mm Silber Draht, die dadurch sparsamer als bisherige Ansätze. Ein weiterer Vorteil ist, dass im Gegensatz zu den harten und scharfen Mikropipette Tipp, sanftere Schwamm Elektrodenspitze weniger wahrscheinlich ist, die Larven Auge schädigen. Schließlich hilft der PVA-Schwamm, um Feuchtigkeit für das larvale Auge während der Aufnahme zu erhalten.

Der Schlüssel zur erfolgreichen Anwendung der Schwamm-Tip Elektrode besteht darin volle Sättigung des Schwammes. Dies dauert in der Regel nicht weniger als 15 Minuten einweichen in 1 x Goldfisch Ringer Puffer. Unvollständige Sättigung des Schwammes kann der Geräuschpegel durch schnellere Trocknung der Elektrode erhöhen. Für bessere Signal-Sammlung, machen neue Elektroden für jede experimentelle Sitzung (in der Regel < 8 h) sehr zu empfehlen. Wiederholte Nutzung führt zu reduzierten ERG Signale, Vergleiche von Inter Sitzung immer schwieriger.

Wenn die Larven Zebrafisch auf die Schwamm-Plattform zu positionieren, muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass das Auge zu messenden nicht in Kontakt mit einer umgebenden Lösung oder Papiertuch unter den Fischen. Ein solcher Kontakt shorts den Stromkreis, da die Bezugselektrode in die Schwamm-Plattform eingebettet ist und die ERG senkt.

Auch bei gut gesättigten Elektrodenspitzen Schwamm tritt allmähliche Austrocknen, die offensichtlich als erhöhter Geräuschentwicklung in ERG Signale. Sollte dies geschehen, tropft ein Tropfen von 1 X Goldfisch Ringerlösung auf der Basis des Kegels mit 1 mL Spritze und Nadel 30 x ½". Wenn hinzufügen, dass die Lösung bis zur Spitze der Schwamm nicht den Lärmpegel senkt, überprüfen Sie, dass das Auge nicht in Kontakt mit der umgebenden Flüssigkeit und sicherzustellen Sie, dass die Elektrodenspitze auf der Hornhaut Spitze zentriert ist.

Die Aufnahmen in die repräsentativen Ergebnisse hier berichtet wurden mit einem Bandpass-Einstellung von 1 bis 300 Hz, die Probenahme von oszillierenden Potentiale (OP) nicht zulässt — Wavelets auf der b-Welle abgeleitet von den dritter Ordnung Netzhaut Neuronen einschließlich amakrinen und Ganglion Zellen 15,16,17. Eine höhere Lowpass-Einstellung (z. B. 500 oder 1.000 Hz) möglicherweise besser geeignet für die Aufnahme von OP.

Zusammenfassend lässt sich sagen hilft die kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode, um larval Zebrafisch ERG Aufnahme mit bestehenden kleinen Tier ERG Systeme, liefert zuverlässige Ergebnisse zu vereinfachen. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass ERG Amplitude zwischen 4 und 5 Dpf mit weiteren Reifung zwischen 5 und 7 Dpf manifestiert als schneller implizite Zeiten wächst. Unser einfache ERG-Protokoll mit der wirtschaftlichen und praktischen kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann Ermittler Zebrafisch retinale Funktion profitieren. Die Technik kann auch angepasst werden, um Erwachsenen Zebrafisch oder anderen vertebrate Modelle mit kleinen Augen zu beurteilen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben für diese Arbeit relevant.

Acknowledgments

Finanzierung für dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss aus dem Melbourne Neuroscience Institute (PTG, PRJ & BVB) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode
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Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

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