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Developmental Biology

Electroretinogram एक उपंयास शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लारवल Zebrafish में रिकॉर्डिंग

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि प्रकाश की माप को सरल पेश करते है लार्वल zebrafish से electroretinogram प्रतिक्रियाओं पैदा की । एक उपंयास शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड के लिए विश्वसनीय परिणाम और कम लागत के साथ प्राप्त करने के लिए आसान electroretinogram ERG का उपयोग कर लारवल zebrafish में दृश्य विकास के अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं ।

Abstract

zebrafish (Danio rerio) आमतौर पर विकासात्मक अध्ययनों में एक कशेरुका मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है और दृश्य तंत्रिका विज्ञान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । दृश्य प्रदर्शन के कार्यात्मक माप के लिए, electroretinography (ERG) एक आदर्श गैर इनवेसिव विधि है, जो अच्छी तरह से उच्च कशेरुका प्रजातियों में स्थापित किया गया है । इस दृष्टिकोण का उपयोग तेजी से विकासात्मक लार्वा अवस्थाओं के दौरान जेबराफिश में दृश्य फलन की जांच करने के लिए किया जा रहा है । हालांकि, लार्वल zebrafish ERG के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की तारीख करने के लिए कांच micropipette इलेक्ट्रोड है, जो इसके निर्माण के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए एक चुनौती पेश. यहां, हम एक लारवल zebrafish ERG प्रोटोकॉल एक शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर मौजूद है । उपंयास इलेक्ट्रोड के निर्माण और संभाल करने के लिए आसान है, और अधिक किफायती, और कम कांच micropipette से लार्वा नेत्र को नुकसान होने की संभावना है । पहले प्रकाशित erg तरीकों की तरह, वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाशग्राही और द्विध्रुवी सेल प्रतिक्रियाओं के माध्यम से बाहरी रेटिना समारोह का आकलन कर सकते हैं, एक और बी-वेव, क्रमशः. प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से zebrafish लार्वा के प्रारंभिक विकास के दौरान दृश्य समारोह के शोधन की व्याख्या कर सकते हैं, उपयोगिता, संवेदनशीलता, और उपंयास इलेक्ट्रोड की विश्वसनीयता का समर्थन । सरलीकृत इलेक्ट्रोड विशेष रूप से उपयोगी है जब एक नई ERG प्रणाली की स्थापना या zebrafish माप के लिए मौजूदा छोटे जानवर ERG उपकरण को संशोधित, दृश्य न्यूरोसाइंसेज में शोधकर्ताओं सहायता के लिए zebrafish मॉडल जीव का उपयोग करें.

Introduction

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zebrafish (Danio rerio) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आनुवंशिक कशेरुका मॉडल बन गया है, दृश्य तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन सहित । इस प्रजाति की बढ़ती लोकप्रियता आनुवंशिक हेरफेर की आसानी सहित लाभ के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, अत्यधिक संरक्षित कशेरुका दृश्य प्रणाली (ंयूऑन प्रकार, शारीरिक आकारिकी और संगठन, और अंतर्निहित आनुवंशिकी), उच्च बहुप्रजता और ममैलियन मॉडलों की तुलना में पशुपालन की कम लागत1. गैर इनवेसिव electroretinogram (ईआरजी) लंबे समय से नैदानिक मानव दृश्य समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और प्रयोगशाला में कुतर और लार्वा zebrafish सहित बड़ी और छोटी प्रजातियों की एक सीमा में दृष्टि यों तो करने के लिए सेटिंग में2,3 , 4 , 5. सबसे अधिक विश्लेषण किया erg घटक है एक लहर और बी तरंग, प्रकाश संवेदन photoreceptors और द्विध्रुवी interneurons, क्रमशः से उद्भव । लार्वा zebrafish में, रेटिना में अलग परतों 3 दिनों के बाद निषेचन (dpf) और 4 dpf6,7से पहले परिपक्व फोटोरीसेप्टर कोन टर्मिनल synapses के आकारिकी द्वारा स्थापित कर रहे हैं । लार्वा zebrafish के बाहरी रेटिना समारोह इस प्रकार 4 dpf से पहले स्थापित किया गया है, जिसका अर्थ है कि ERG इस जल्दी उम्र के बाद से मध्यम श्रेणी का है । छोटे प्रयोगात्मक चक्र और मॉडल के उच्च थ्रॉपुट गुणों के कारण, ERG रोग मॉडल के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए लार्वा zebrafish के लिए लागू किया गया है, रंग दृष्टि और रेटिना विकास का विश्लेषण, दृश्य circadian लय का अध्ययन और दवाओं का परीक्षण8,9,10,11,12

हालांकि, लार्वा zebrafish ERG के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कुछ जटिलताओं है कि इसे अपनाने के लिए कठिन बना सकते हैं । प्रकाशित लार्वा zebrafish erg प्रोटोकॉल आमतौर पर एक गिलास micropipette रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड3,4,5,13के रूप में प्रवाहकीय तरल से भरा का उपयोग करें, जो एक उच्च गुणवत्ता micropipette की आवश्यकता है टिप3। विशेष उपकरण, जैसे एक micropipette डांड़ी और कुछ मामलों में एक microforge, उनके निर्माण के लिए आवश्यक हैं । यह सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए एक चुनौती हो सकती है और अतिरिक्त लागत की ओर जाता है जब भी उपलब्ध छोटे पशु ERG लार्वा zebrafish दृश्य समारोह के माप के लिए प्रणाली अनुकूल । यहां तक कि जब smoothed, तेज माइक्रोपिपेट टिप लार्वा आंख की सतह को नुकसान पहुंचा सकता है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए वाणिज्यिक माइक्रोपिपेट धारकों के लिए एक निश्चित चांदी के तार के साथ निर्माण कर रहे हैं । ये तय तारों दोहराए उपयोग के बाद निष्क्रियकृत तल हो जाते हैं, नए धारकों की खरीद की आवश्यकता के रखरखाव लागत में वृद्धि के लिए अग्रणी ।

यहां हम एक शंकु के आकार का स्पंज टिप रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग कर एक ERG विधि का वर्णन है, कि विशेष रूप से ढालने के लिए उपयोगी है की स्थापना की छोटे पशु ERG setups के लिए लार्वा zebrafish ERG माप । इलेक्ट्रोड आसानी से किसी अन्य विशेष उपकरण के बिना आम polyvinyl एसीटेट (PVA) स्पंज और ठीक चांदी के तार का उपयोग किया जाता है. हमारे आंकड़ों से पता चलता है कि इस उपंयास इलेक्ट्रोड संवेदनशील है और काफी विश्वसनीय के लिए 4 और 7 dpf के बीच लारवल zebrafish में रेटिना तंत्रिका सर्किट के कार्यात्मक विकास का प्रदर्शन । यह किफायती और व्यावहारिक स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है नए ERG सिस्टम की स्थापना या मौजूदा छोटे पशु प्रणाली को संशोधित, zebrafish अध्ययन के लिए.

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Protocol

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सभी electroretinogram (ईआरजी) प्रक्रियाओं को जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद अभ्यास संहिता के प्रावधानों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था और संस्थागत पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया मेलबोर्न विश्वविद्यालय ।

1. बफर तैयारी

  1. 10x सुनहरी घंटी के बफर (१.२५ मीटर NaCl, 26 मिमी केसीएल, 25 मिमी CaCl2, 10 मिमी MgCl2, १०० मिमी ग्लूकोज, १०० मिमी hepes) रिवर्स असमस (आरओ) पानी का उपयोग कर तैयार करें । ७.८ पीएच के लिए बफर समायोजित करें और ०.२२ μm फिल्टर का उपयोग कर बफर । 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टॉक3के रूप में 10X बफर स्टोर ।
    नोट: 10x है Ringer बफर 3 महीने के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. प्रयोग के दिन पर, 10x सुनहरी है Ringer बफर रिवर्स असमस पानी का उपयोग कर कमजोर द्वारा 1x सुनहरी है Ringer बफर बनाते हैं ।
    नोट: 1x सुनहरी है घंटी बफर को pva स्पंज, लार्वा zebrafish की नियुक्ति के लिए इस्तेमाल स्पंज सहित संतृप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड टिप पर स्पंज ।

2. इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. शंकु के आकार की स्पंज रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैयार करें ।
    1. प्लैटिनम इलेक्ट्रोड सीसा विस्तार से पुरुष अंत में कटौती और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग बाहरी पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन इंसुलेशन कोटिंग के अंत 10 मिमी से हटा दें । इलेक्ट्रोड लीड के भीतरी तार को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
    2. चांदी के तार की एक ४० मिमी लंबाई में कटौती (०.३ मिमी व्यास) और सुरक्षित रूप से उजागर भीतरी तार के साथ चांदी के तार ग्रथन द्वारा इलेक्ट्रोड का नेतृत्व करने के लिए इस देते हैं । Encase संयुक्त इंसुलेट टेप का उपयोग कर, एक ~ 15 मिमी चांदी के तार उजागर की लंबाई (चित्रा 1a) ।
    3. इलेक्ट्रोप्लेट के लिए संकेत चालन में सुधार करने के लिए ६० s के लिए एक 9 वी डीसी स्रोत का उपयोग कर क्लोराइड के साथ उजागर चांदी के तार । सामान्य खारा में उजागर चांदी टिप विसर्जित कर दिया और बैटरी के सकारात्मक टर्मिनल के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट । बैटरी के नकारात्मक टर्मिनल के लिए एक और तार कनेक्ट और खारा2में तार के दूसरे छोर विसर्जित कर दिया ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यह एक ब्लीच समाधान (सक्रिय संघटक ४२ g/L सोडियम हाइपोक्लोराइट) में 1 घंटे के लिए भिगोने से चांदी के तार chlorinate ।
    4. कट एक ~ 20 मिमी x 20 मिमी PVA स्पंज की स्क्वायर कैंची का उपयोग करने के लिए एक शंकु बनाने के लिए (चित्रा 1a). 1x Ringer बफर का उपयोग स्पंज संतृप्त । eyepiece पर एक पैमाने पर पट्टी के साथ एक खुर्दबीन के तहत, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए शंकु के शीर्ष आकार ~ ४० μm व्यास । एयर सूखी शंकु के आकार का स्पंज शोषक कागज ऊतक पर जब तक यह ठोस है ।
      नोट: PVA स्पंज काफी फैलता है जब संतृप्त, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है कि स्पंज पहले शंकु के शीर्ष को आकार देने से पहले खारा के साथ संतृप्त है ।
    5. क्लोराइडिंग के बाद, हवा सूखी एक शोषक ऊतक पर चांदी के तार 5 मिनट के लिए । शंकु के आधार के माध्यम से सूखे, ठोस, शंकु के आकार के PVA स्पंज में चांदी के तार डालें । किसी भी अतिरिक्त उजागर मुखौटा टेप का उपयोग करने के लिए फोटोवोल्टिक कलाकृतियों को कम करने धातु (चित्र 1b-C) को बचाने ।
      नोट: प्रत्येक प्रायोगिक सत्र के बाद स्पंज को चांदी के तार से हटा दें । पुनः प्रयोग के लिए रिवर्स असमस पानी और हवा सूखी का उपयोग कर स्पंज धो लें । इष्टतम संकेत संग्रह सुनिश्चित करने के लिए, चांदी के तार के एकल उपयोग की सिफारिश की है । PVA स्पंज अधिक से अधिक 5 बार पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए ।
    6. प्रयोग के दिन, स्पंज-टिप रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के 1x Ringer बफर में कम से 15 मिनट के लिए पूरी तरह से स्पंज संतृप्त करने के लिए विसर्जित कर दिया ।
  2. ऊपर वर्णित के रूप में संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार है, लेकिन स्पंज टिप संलग्न बिना.
  3. जमीन वाणिज्यिक इलेक्ट्रोड प्राप्त करें ।

3. Zebrafish तैयारी

  1. डार्क एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में zebrafish रखकर रिकॉर्डिंग करने से पहले (> 8 ज) रातोंरात zebrafish लार्वा (< 20 लार्वा प्रति ट्यूब) एक अंधेरे इनयूबेटर में एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे. पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए ढक्कन हटा दें ।
  2. रिकॉर्डिंग के दिन, पंनी के लिए ढक्कन कस-लिपटे फाल्कन ट्यूब लार्वा युक्त और सुनिश्चित करें कि ट्यूब प्रकाश प्रूफ है । ERG लैब के लिए परिवहन लार्वा ।
  3. एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड से मंद लाल रोशनी की सहायता से अंधेरे में पेट्री व्यंजन में मछली डालो (एलईडी; १७.४ सीडी. एम-2, λमैक्स ६०० एनएम) । प्रकाश के जोखिम को कम करने के लिए प्रकाश प्रूफ तौलिए का उपयोग कर पेट्री व्यंजन आवरण ।

4. स्पंज मंच की तैयारी

  1. एक ३५ मिमी पेट्री डिश में snugly फिट करने के लिए सूखी PVA स्पंज की एक आयत में कटौती । यह सुनिश्चित करें कि स्पंज की मोटाई मोटे तौर पर पेट्री डिश की गहराई के बराबर होनी चाहिए ।
  2. संदर्भ इलेक्ट्रोड के चांदी के तार को समायोजित करने के लिए स्पंज के एक छोर के माध्यम से एक छोटी सी कटौती खड़ी बनाओ ।
  3. 1x सुनहरी है ringer बफर में pva स्पंज सोख जब तक संतृप्त । फिर, स्पंज को एक साफ ३५-mm पेट्री डिश में रखें । एक कागज तौलिया का प्रयोग अतिरिक्त तरल को अवशोषित जब तक कोई समाधान एक हल्के उंगली प्रेस के जवाब में स्पंज से exudes ।

5. पशु और इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग

  1. anesthetize ०.०२% tricaine का उपयोग कर लार्वा 1x सुनहरी है ringer बफर में पतला ।
  2. एक 3 मिलीलीटर pasteur पिपेट कागज तौलिया के एक वर्ग पर एक ऊपर लार्वा हस्तांतरण करने के लिए (~ 3 सेमी2) का उपयोग करें ।
  3. कागज तौलिया रखें नम स्पंज मंच पर लार्वा से युक्त forceps का उपयोग । एक ठीक है Ringer बफर में लथपथ ब्रश का उपयोग करने के लिए लार्वा की स्थिति को समायोजित । सुनिश्चित करें कि एक आंख ऊपर की ओर चेहरे, लार्वा के नीचे कागज तौलिया के वर्ग पर किसी भी पास तरल से अलग ।
  4. लार्वा शरीर, सिर को छोड़कर, मॉइस्चराइजिंग नेत्र जेल के साथ ERG रिकॉर्डिंग भर में लार्वा नम रखने के लिए शीशा लगाना ।
  5. एक छोटे से पानी पर स्पंज मंच के साथ पेट्री डिश स्थिति Ganzfeld बाउल प्रकाश एक फैराडे पिंजरे के अंदर स्थित उत्तेजना के सामने गर्म मंच (चित्रा 1 डी) ।
    नोट: स्पंज और लार्वा शरीर के तापमान के रखरखाव स्थिर ERG संकेतों को सुनिश्चित करता है ।
  6. मंच स्पंज में किए गए कट में संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें (चित्रा 1D).
  7. व्यावसायिक रूप से प्राप्त जमीन इलेक्ट्रोड को फैराडे केज से कनेक्ट करें ।
  8. एक इलेक्ट्रोड धारक के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड संलग्न करें और एक माइक्रोनिपुलेटर के stereotaxic हाथ करने के लिए धारक को सुरक्षित (चित्रा 1 डी). पुनः संतृप्ति के लिए इलेक्ट्रोड के स्पंज टिप पर 1x घंटी के समाधान की एक बूंद ड्रिप करने के लिए एक 3 मिलीलीटर पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ।
  9. इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के लिए ERG मंच पर फैराडे पिंजरे में माइक्रोस्कोप स्थिति.
    नोट: प्रकाश एक मंद लाल एलईडी द्वारा प्रदान किया जाना चाहिए (१७.४ सीडी. एम-2, λअधिकतम ६०० एनएम) लार्वा और सक्रिय इलेक्ट्रोड के स्थान के अवलोकन की अनुमति के लिए, whilst अंधेरे अनुकूलन बनाए रखने.
  10. स्पंज मंच की स्थिति को समायोजित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे लार्वा के अवलोकन की अनुमति । फिर, उपयोग शोषक ऊतक इलेक्ट्रोड स्पंज टिप से अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए ।
  11. सक्रिय इलेक्ट्रोड की स्थिति इतनी है कि यह धीरे लार्वा zebrafish आँख की केंद्रीय corneal सतह को छू (चित्रा 1E).
  12. स्पंज मंच की ओर Ganzfeld कटोरा ले जाएं और सुनिश्चित करें कि लार्वा कटोरा द्वारा कवर किया जाता है ।
  13. बाहरी वैद्युतचुंबकीय रव को कम करने के लिए फैराडे केज को बंद करें ।

6. इलैक्ट्रोनोग्राम अभिलेखन

  1. विशेष ERG प्रणाली के कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (विवरण के लिए सामग्री की मेज देखें) उत्तेजना को ट्रिगर और2नीचे की सिफारिश की सेटिंग्स के आधार पर डेटा प्राप्त ।
    1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एक ६५० ms रिकॉर्डिंग विंडो (२,५६० अंक) पर 4 KHz करने के लिए प्रणाली की नमूना दर निर्धारित करें.
    2. १,००० × करने के लिए प्रणाली का लाभ सेट करें ।
    3. सेट बैंड-1-300 हर्ट्ज के लिए प्रणाली की फ़िल्टरिंग पास.
    4. ६० हर्ट्ज (या ५० हर्ट्ज, स्थानीय उपयोगिता आवृत्ति के आधार पर) शोर को कम करने के लिए एक पायदान फिल्टर का प्रयोग करें.
      नोट: आदर्श शोर स्तर ± 10 μV से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  2. नीचे बताई गई कार्यविधि का उपयोग करके डेटा संग्रह प्रारंभ करना ।
    1. इलेक्ट्रोड की स्थिति का आकलन करने के लिए आँख से एक परीक्षण प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक एकल परीक्षण-फ़्लैश (०.०६ लॉग cd. s/m2) का उपयोग करें ।
      नोट: परीक्षण फ़्लैश की इस तीव्रता के परिणामस्वरूप एक बी-वेव आयाम 4-dpf लार्वा में 25 μV से अधिक होना चाहिए । यदि एक मजबूत प्रतिक्रिया नहीं मापा जा सकता है, तो इलेक्ट्रोड सरकता और एक और परीक्षण फ़्लैश करने के लिए पुष्टि की है कि इलेक्ट्रोड अच्छी तरह से तैनात हैं.
    2. परीक्षण फ़्लैश के बाद, जानवर अंधेरे को रिकॉर्डिंग से पहले पूरा अंधेरे में 3 मिनट के लिए अनुकूलन की अनुमति दें ।
    3. चमकीले प्रकाश तीव्रता के लिए dimmer से वर्तमान चमक ।
    4. सिग्नल-से-नॉइज़ स्तर के अनुसार औसत सिग्नल दोहराता है ।
      नोट: आम तौर पर, dimmer प्रकाश के स्तर पर औसत से अधिक संकेतों (कोई कम से 3 दोहराता) और उज्ज्वल प्रकाश के स्तर पर कम (आमतौर पर 1 दोहराने). धीरे से अंतर-उत्तेजना अंतराल को 10 से ६० s dimmest से प्रतिभाशाली प्रकाश स्तर को लंबा । एक नमूना प्रोटोकॉल तालिका 1में दिखाया गया है ।
    5. रिकॉर्डिंग के बाद, humanely ०.१% tricaine का उपयोग कर लार्वा को मारने ।

7. विश्लेषण

  1. रेखा से ऋणात्मक a-तरंग गर्त और b-तरंग आयाम ऋणात्मक a-तरंग गर्त से धनात्मक b-तरंग शिखर तक एक-तरंग आयाम को मापें ।
  2. उपाय a-और b-तरंग अंतर्निहित बार उत्तेजना शुरुआत से एक लहर और बी लहर के शिखर के गर्त के लिए, क्रमशः ।

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Representative Results

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इस खंड ERG माप के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है दैनिक 4 से 7 dpf से लिया । 4 dpf से, ERG प्रतिक्रियाएं मजबूत a-और b-वेव घटकों, जो क्रमशः photoreceptors और द्विध्रुवी कोशिकाओं से पैदा दिखाते हैं । प्रत्येक उंर में परीक्षण किया, बी के आयाम-वेव प्रकाश तीव्रता के साथ वृद्धि हुई (चित्रा 2; चित्रा 3) । विशेष रूप से, डिमर चमक के लिए लार्वा zebrafish रेटिना की संवेदनशीलता उम्र के साथ बढ़ गई । a-और b-वेव तीव्रता पर पहचानने योग्य नहीं थे-१.६१ लॉग cd. s/m2 4 dpf पर, जबकि स्पष्ट संकेतों को पुराने लार्वा (चित्रा 2) के लिए इन तीव्रताओं पर detectable थे । बी वेव रिस्पांस 4 और 5 dpf (पी < ०.०००१ के बीच काफी वृद्धि हुई है; चित्रा 2A -B; चित्रा 3B) । हालांकि कम तीव्रता पर बी लहर 5 और 7 dpf के बीच थोड़ा परिवर्तन दिखाया, २.४८ पर सिग्नल सीडी. एस/एम2 5 और 6 dpf (पी < ०.०००१ के साथ तुलना में 7 dpf पर अधिक था; चित्रा 2; चित्रा 3B) । A-और b-लहर अंतर्निहित बार 5 dpf (P < ०.०००१ के बाद काफी तेजी से बन गया; चित्रा 3C -डी) । कुल मिलाकर, ये परिणाम 4 से 7 dpf के बीच zebrafish रेटिना समारोह की परिपक्वता का प्रदर्शन । दिलचस्प बात यह है कि ए-वेव आयाम 5 से 7 dpf (चित्रा 3A) से कम दिखाई दिया । यह हो सकता है क्योंकि बाहरी रेटिना में synaptic कनेक्शन की परिपक्वता द्विध्रुवी कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं की विलंबता shortens, तेजी से बी-वेव शुरुआत है कि मास्क एक लहर में जिसके परिणामस्वरूप. एक लहर का अध्ययन करने के इच्छुक लोग औषधीय उपचार के बाद ब्लॉक photoreceptoral प्रतिक्रियाओं (यानी बी वेव घटक) रोजगार कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: Zebrafish शंकु के आकार के स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड के साथ anzfeld ERG सेट अप । () स्पंज-टिप इलैक्ट्रोड का निर्माण करने से पहले कोन-आकार के स्पंज टिप और क्लोरीनेटिड सिल्वर इलैक्ट्रोड वायु सूख जाते हैं । (ख-ग) तत्पश्चात क्लोरीनित चांदी के तार को संपूर्ण इलेक्ट्रोड बनाने के लिए आधार के माध्यम से स्पंज शंकु में डाला जाता है । () ठेठ लार्वा जेबराफिश जैन्जफेल्ड एर्ग सेटअप में, संदर्भ इलेक्ट्रोड स्पंज प्लेटफॉर्म में डाला जाता है और zebrafish लार्वा को गैन्जफेल्ड बाउल द्वारा कवर किया जाता है । () स्पंज-टीप इलैक्ट्रोड लार्वा नेत्र के मध्य कॉर्नेयल पृष्ठ को धीरे से छूता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जंगली प्रकार लार्वा zebrafish के प्रतिनिधि औसत ERG निशान । (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 Dpf (n = 7), और (D) 7 Dpf (n = 9) पर वाइल्डटाइप zebrafish का औसत erg अंश । प्रतिक्रियाएं सफेद एल ई डी से चमक का उपयोग कर हासिल थे । प्रत्येक उंर में, निशान दिखाने के लिए प्रतिक्रियाओं की चमक (नीचे से ऊपर से)-२.७५,-२.११,-१.६१,-०.८१, ०.०६, ०.७२, १.५५, १.८९, २.१८, २.४८ लॉग सीडी. एस/ स्केल बार = ५० μV. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3: एक और बी तरंग amplitudes और 4 से 7 dpf zebrafish के लिए अंतर्निहित समय ERG । (ं) समूह औसत (माध्य का ± मानक त्रुटि) A-तरंग आयाम फ़्लैश तीव्रता के साथ वृद्धि हुई लेकिन 4-7 dpf लार्वा में उम्र के साथ कमी आई । () 4-7 डीपीएफ लार्वा में औसत बी-वेव आयाम फ्लैश तीव्रता के साथ बढ़ा; आयाम 4 और 5 dpf के बीच बढ़ी । () औसत a-तरंग अंतर्निहित समय और (D) औसत b-तरंग अंतर्निहित समय 5, 6 और 7 dpf के बीच तेजी से बन गया । श्रेष्ठ फ़िट की रेखाएं गैर-रेखीय प्रतीपगमन से प्राप्त होती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

उत्तेजना प्रकाश तीव्रता (log cd. s. m-2) दोहरातों की संख्या अंतर-उत्तेजना अंतराल (s)
-२.७५ 3 से 6 10
(अगले 30 से पहले एस)
-२.११ 3 से 6 10
(अगले 30 से पहले एस)
-१.६१ 3 से 6 10
(अगले 30 से पहले एस)
-०.८१ 3 से 6 10
(अगले से पहले ६० एस)
०.०६ 3 से 6 10
(अगले से पहले ६० एस)
०.७२ 1 से 3 ६०
१.५५ 1 से 3 ६०
१.८९ 1 से 3 ६०
२.१८ 1 से 3 ६०
२.४८ 1 से 3 ६०

तालिका 1: ERG रिकॉर्डिंग का उदाहरण प्रोटोकॉल । उत्तेजना प्रस्तुतियों dimmest से शुरू (ऊपर) और प्रगति उज्ज्वल करने के लिए (नीचे) प्रकाश का स्तर, उत्तरोत्तर लंबे समय तक अंतर उत्तेजना अंतराल के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंधेरे संगह बनाए रखा है । प्रत्येक तीव्रता पर औसत संकेतों की संख्या सिग्नल-से-शोर स्तर पर निर्भर करता है ।

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Discussion

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ऐसे erg के रूप में कार्यात्मक readouts तेजी से लार्वल zebrafish8,9,12,14का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के सुइट में महत्वपूर्ण हो गए हैं । लार्वा zebrafish आंख के छोटे आकार के कारण, कांच micropipettes सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के रूप में अनुकूलित किया गया है3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. यहां हम एक लार्वल zebrafish erg प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरल शंकु के आकार का स्पंज टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर । उपंयास इलेक्ट्रोड किसी भी अतिरिक्त उपकरणों के बिना लार्वा zebrafish रेटिना समारोह को मापने के लिए मानक छोटे पशु ERG सिस्टम को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड बनाने के लिए सामग्री बस वाणिज्यिक PVA स्पंज और ०.३ मिमी चांदी के तार, जो पिछले दृष्टिकोण से यह अधिक किफायती बनाता है । एक और लाभ यह है कि, कठिन और तेज micropipette टिप के विपरीत, gentler इलेक्ट्रोड स्पंज टिप को लार्वा नेत्र नुकसान होने की संभावना कम है । अंत में, PVA स्पंज रिकॉर्डिंग भर में लारवल आंख को नमी बनाए रखने में मदद करता है ।

स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड के सफल आवेदन करने के लिए कुंजी स्पंज की पूर्ण संतृप्ति सुनिश्चित करने के लिए है । यह आम तौर पर 1x सुनहरी है ringer बफर में भिगोने से कम नहीं 15 मिनट लगते हैं । स्पंज के अपूर्ण संतृप्ति इलेक्ट्रोड के तेजी से सूखने के कारण शोर के स्तर को बढ़ा सकते हैं । बेहतर संकेत संग्रह के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक सत्र के लिए नए इलेक्ट्रोड बनाने (आम तौर पर < 8 ज) अत्यधिक की सिफारिश की है. दोहराएं उपयोग कम ERG संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अंतर सत्र की तुलना अधिक कठिन बना ।

जब स्पंज मंच पर लार्वा zebrafish स्थिति, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि आंख मापा जा करने के लिए किसी भी आसपास के समाधान या मछली के नीचे कागज तौलिया के साथ संपर्क में नहीं है लिया जाना चाहिए । इस तरह के संपर्क शॉर्ट्स बिजली के सर्किट के रूप में संदर्भ इलेक्ट्रोड स्पंज मंच में एम्बेडेड है और ERG कम कर देता है.

यहां तक कि अच्छी तरह से संतृप्त इलेक्ट्रोड स्पंज युक्तियों के साथ, क्रमिक सुखाने होता है, जो ERG संकेतों में वृद्धि हुई शोर के रूप में स्पष्ट है । यह हो जाना चाहिए, 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 30 G x 1/2 "सुई का उपयोग कर शंकु के आधार पर 1x सुनहरी घंटी की एक बूंद ड्रिप । यदि स्पंज टिप के लिए समाधान जोड़ने शोर के स्तर को कम नहीं करता है, जांच करें कि आंख एक आसपास के तरल पदार्थ के साथ संपर्क में नहीं है और सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड टिप कॉर्नेअल शीर्ष पर केंद्रित है ।

प्रतिनिधि परिणामों में रिकॉर्डिंग यहां की रिपोर्ट 1-300 हर्ट्ज, जो दोलनी क्षमता (OP) के नमूने की अनुमति नहीं देता है की एक बैंडपास सेटिंग के साथ किए गए-b-तरंग पर तरंगिकाओं सहित तीसरे क्रम रेटिना ंयूरॉंस से व्युत्पंन एम्करइन और गुच्छिका की कोशिकाएँ १५,१६,१७. एक उच्च lowpass सेटिंग (जैसे, ५०० या १,००० हर्ट्ज) बेहतर सेशन रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हो सकता है.

संक्षेप में, शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड, विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने वाले मौजूदा छोटे-जानवर ERG सिस्टम के साथ लार्वा zebrafish ERG रिकॉर्डिंग को सरल बनाने में मदद करता है । प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि ERG आयाम 4 और 5 dpf के बीच बढ़ता है, 5 और 7 के बीच आगे परिपक्वता के साथ dpf तेजी से अंतर्निहित समय के रूप में प्रकट । किफायती और व्यावहारिक शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड के साथ हमारे सरल ERG प्रोटोकॉल zebrafish रेटिना समारोह का अध्ययन जांचकर्ताओं को लाभ कर सकते हैं । तकनीक भी वयस्क zebrafish या छोटी आंखों के साथ अंय कशेरुका मॉडल का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के इस काम के लिए प्रासंगिक कोई प्रकटीकरण नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए धन मेलबोर्न तंत्रिका विज्ञान संस्थान से अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी (PTG, PRJ & BVB) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

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References

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Electroretinogram एक उपंयास शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लारवल Zebrafish में रिकॉर्डिंग
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Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

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