Electroretinogram एक उपंयास शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लारवल Zebrafish में रिकॉर्डिंग
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि प्रकाश की माप को सरल पेश करते है लार्वल zebrafish से electroretinogram प्रतिक्रियाओं पैदा की । एक उपंयास शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड के लिए विश्वसनीय परिणाम और कम लागत के साथ प्राप्त करने के लिए आसान electroretinogram ERG का उपयोग कर लारवल zebrafish में दृश्य विकास के अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं ।
Abstract
zebrafish (Danio rerio) आमतौर पर विकासात्मक अध्ययनों में एक कशेरुका मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है और दृश्य तंत्रिका विज्ञान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । दृश्य प्रदर्शन के कार्यात्मक माप के लिए, electroretinography (ERG) एक आदर्श गैर इनवेसिव विधि है, जो अच्छी तरह से उच्च कशेरुका प्रजातियों में स्थापित किया गया है । इस दृष्टिकोण का उपयोग तेजी से विकासात्मक लार्वा अवस्थाओं के दौरान जेबराफिश में दृश्य फलन की जांच करने के लिए किया जा रहा है । हालांकि, लार्वल zebrafish ERG के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की तारीख करने के लिए कांच micropipette इलेक्ट्रोड है, जो इसके निर्माण के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए एक चुनौती पेश. यहां, हम एक लारवल zebrafish ERG प्रोटोकॉल एक शंकु के आकार का स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर मौजूद है । उपंयास इलेक्ट्रोड के निर्माण और संभाल करने के लिए आसान है, और अधिक किफायती, और कम कांच micropipette से लार्वा नेत्र को नुकसान होने की संभावना है । पहले प्रकाशित erg तरीकों की तरह, वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाशग्राही और द्विध्रुवी सेल प्रतिक्रियाओं के माध्यम से बाहरी रेटिना समारोह का आकलन कर सकते हैं, एक और बी-वेव, क्रमशः. प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से zebrafish लार्वा के प्रारंभिक विकास के दौरान दृश्य समारोह के शोधन की व्याख्या कर सकते हैं, उपयोगिता, संवेदनशीलता, और उपंयास इलेक्ट्रोड की विश्वसनीयता का समर्थन । सरलीकृत इलेक्ट्रोड विशेष रूप से उपयोगी है जब एक नई ERG प्रणाली की स्थापना या zebrafish माप के लिए मौजूदा छोटे जानवर ERG उपकरण को संशोधित, दृश्य न्यूरोसाइंसेज में शोधकर्ताओं सहायता के लिए zebrafish मॉडल जीव का उपयोग करें.
Introduction
zebrafish (Danio rerio) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आनुवंशिक कशेरुका मॉडल बन गया है, दृश्य तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन सहित । इस प्रजाति की बढ़ती लोकप्रियता आनुवंशिक हेरफेर की आसानी सहित लाभ के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, अत्यधिक संरक्षित कशेरुका दृश्य प्रणाली (ंयूऑन प्रकार, शारीरिक आकारिकी और संगठन, और अंतर्निहित आनुवंशिकी), उच्च बहुप्रजता और ममैलियन मॉडलों की तुलना में पशुपालन की कम लागत1. गैर इनवेसिव electroretinogram (ईआरजी) लंबे समय से नैदानिक मानव दृश्य समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और प्रयोगशाला में कुतर और लार्वा zebrafish सहित बड़ी और छोटी प्रजातियों की एक सीमा में दृष्टि यों तो करने के लिए सेटिंग में2,3 , 4 , 5. सबसे अधिक विश्लेषण किया erg घटक है एक लहर और बी तरंग, प्रकाश संवेदन photoreceptors और द्विध्रुवी interneurons, क्रमशः से उद्भव । लार्वा zebrafish में, रेटिना में अलग परतों 3 दिनों के बाद निषेचन (dpf) और 4 dpf6,7से पहले परिपक्व फोटोरीसेप्टर कोन टर्मिनल synapses के आकारिकी द्वारा स्थापित कर रहे हैं । लार्वा zebrafish के बाहरी रेटिना समारोह इस प्रकार 4 dpf से पहले स्थापित किया गया है, जिसका अर्थ है कि ERG इस जल्दी उम्र के बाद से मध्यम श्रेणी का है । छोटे प्रयोगात्मक चक्र और मॉडल के उच्च थ्रॉपुट गुणों के कारण, ERG रोग मॉडल के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए लार्वा zebrafish के लिए लागू किया गया है, रंग दृष्टि और रेटिना विकास का विश्लेषण, दृश्य circadian लय का अध्ययन और दवाओं का परीक्षण8,9,10,11,12।
हालांकि, लार्वा zebrafish ERG के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कुछ जटिलताओं है कि इसे अपनाने के लिए कठिन बना सकते हैं । प्रकाशित लार्वा zebrafish erg प्रोटोकॉल आमतौर पर एक गिलास micropipette रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड3,4,5,13के रूप में प्रवाहकीय तरल से भरा का उपयोग करें, जो एक उच्च गुणवत्ता micropipette की आवश्यकता है टिप3। विशेष उपकरण, जैसे एक micropipette डांड़ी और कुछ मामलों में एक microforge, उनके निर्माण के लिए आवश्यक हैं । यह सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए एक चुनौती हो सकती है और अतिरिक्त लागत की ओर जाता है जब भी उपलब्ध छोटे पशु ERG लार्वा zebrafish दृश्य समारोह के माप के लिए प्रणाली अनुकूल । यहां तक कि जब smoothed, तेज माइक्रोपिपेट टिप लार्वा आंख की सतह को नुकसान पहुंचा सकता है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए वाणिज्यिक माइक्रोपिपेट धारकों के लिए एक निश्चित चांदी के तार के साथ निर्माण कर रहे हैं । ये तय तारों दोहराए उपयोग के बाद निष्क्रियकृत तल हो जाते हैं, नए धारकों की खरीद की आवश्यकता के रखरखाव लागत में वृद्धि के लिए अग्रणी ।
यहां हम एक शंकु के आकार का स्पंज टिप रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग कर एक ERG विधि का वर्णन है, कि विशेष रूप से ढालने के लिए उपयोगी है की स्थापना की छोटे पशु ERG setups के लिए लार्वा zebrafish ERG माप । इलेक्ट्रोड आसानी से किसी अन्य विशेष उपकरण के बिना आम polyvinyl एसीटेट (PVA) स्पंज और ठीक चांदी के तार का उपयोग किया जाता है. हमारे आंकड़ों से पता चलता है कि इस उपंयास इलेक्ट्रोड संवेदनशील है और काफी विश्वसनीय के लिए 4 और 7 dpf के बीच लारवल zebrafish में रेटिना तंत्रिका सर्किट के कार्यात्मक विकास का प्रदर्शन । यह किफायती और व्यावहारिक स्पंज-टिप इलेक्ट्रोड शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है नए ERG सिस्टम की स्थापना या मौजूदा छोटे पशु प्रणाली को संशोधित, zebrafish अध्ययन के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे erg के रूप में कार्यात्मक readouts तेजी से लार्वल zebrafish8,9,12,14का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के सुइट में महत्वपूर्ण हो गए हैं । लार्वा zebrafish आंख के छो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए धन मेलबोर्न तंत्रिका विज्ञान संस्थान से अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी (PTG, PRJ & BVB) ।
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
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