스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

Summary

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

Abstract

제 브라 (Danio rerio) 발달 연구에서 척추 모형으로 일반적으로 사용 되 고 특히 시각적인 신경 과학에 대 한 적합 합니다. 비주얼 퍼포먼스의 기능 측정, electroretinography (에) 더 높은 척 추가 있는 종에서 잘 설립 되었습니다 이상적인 비-침략 적 방법입니다. 이 접근은 점점 zebrafish, 초기 단계에서 발달 애벌레 포함에 시각적 기능을 검토를 위해 사용 되 고 있습니다. 그러나, 애벌레 zebrafish에 날짜에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 기록 전극 유리 제 micropipette 전극 제조, 한정 된 자원을 가진 실험실에 대 한 과제를 제시에 대 한 특수 장비를 필요로 하는. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish에 프로토콜 사용 하 여 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극. 새로운 전극 제조 및 핸들, 더 경제적이 고 유리 제 micropipette 보다 애벌레 눈 손상 가능성이 쉽습니다. 이전에 게시에 방법 처럼 현재 프로토콜 각각 포토 리셉터와 양극 세포 응답, a-와 b-파도를 통해 외부 망막 기능을 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 zebrafish 애벌레, 지원 유틸리티, 감도, 및 새로운 전극의 신뢰성의 초기 개발을 통해 시각적 기능의 상세를 설명 명확 하 게 수 있습니다. 단순화 된 전극 새로운 르 그 시스템 구축 또는 기존 작은 동물에 장치는 제 브라를 사용 하 여 시각적인 신경 과학 연구자를 돕고 zebrafish 측정에 대 한 수정 모델 유기 체 때 특히 유용 하다.

Introduction

제 브라 (Danio rerio) 시각적인 신경 과학의 연구를 포함 하 여 널리 유전 척추 모델 되고있다. 이 종족의 증가 인기 유전자 조작, 높은 보존된 척추 영상 시스템 (신경, 해부학 적 형태와 조직, 형식과 기본 유전학), 높은 통치의 용이성 등 장점을 표시 될 수 있습니다. 그리고 축산 포유류 모델¹에 비해 저렴 한 비용. 비-침략 적 electroretinogram (에) 오래 사용 되었습니다 임상 인간의 시각 기능을 평가 하 고 비전의 크고 작은 설치류 등 애벌레 zebrafish^2,3 범위에서 계량을 실험실 속 ^{, 4 , 5}. 가장 일반적으로 분석된에 구성 요소는 a 파와 b 파, 빛 감지 대뇌와 바이 폴라 수에서 발생 하는 각각. 애벌레 zebrafish, 망막에 뚜렷한 레이어 3 일 후 수정 (dpf)에 의해 설립 되 고 터미널 포토 리셉터 콘의 형태학 synapses 4 dpf^6,7전에 성숙. 애벌레 zebrafish의 외부 망막 기능 따라서 4 dpf는 르 그 이후이 이른 나이에서 측정 가능한 것을 의미 하기 전에 설정 됩니다. 짧은 실험 주기 모델의 높은 처리량 속성 때문에 르 그에 적용 된 애벌레 zebrafish 질환 모델의 기능 평가 위한 컬러 비전 및 망막 개발 분석, 시각적 circadian 리듬 공부 그리고^8,,910,,1112마약 테스트.

그러나, 애벌레 zebrafish에 대 한 현재 접근에 채택 하기 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 복잡 한 있다. 일반적으로 기록 전극^3,,45,13, 고품질 micropipette 필요로 하로 전도성 액체로 채워진 유리 제 micropipette를 사용 하 여 게시 된 애벌레 zebrafish에 프로토콜 팁³. 특수 장비, micropipette 끌어당기는 등 및 microforge, 어떤 경우에는 그들의 제조에 대 한 필요 합니다. 이 한정 된 자원 가진 실험실에 대 한 도전이 될 수 있습니다 그리고 애벌레 zebrafish 시각적 기능의 측정을 위해 사용할 수 있는 작은 동물에 시스템에 적응 하는 경우에 추가 비용을 리드. 부드럽게 하는 경우에 날카로운 micropipette 팁 애벌레 눈의 표면을 손상 수 있습니다. 또한, 전기 생리학에 대 한 상업 micropipette 홀더 고정된 실버 와이어로 구성 됩니다. 이러한 전선 고정 증가 유지 보수 비용을 선도 하는 새로운 소유자의 구입을 요구 하는 반복 사용 후 패 된다.

여기는 원뿔 모양의 스폰지 팁 기록 전극, 애벌레 zebrafish에 측정에 대 한 설립된 작은 동물에 설정을 적응에 특히 유용 합니다을 사용 하 여 르 그 방법에 설명 합니다. 전극 일반적인 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA) 스폰지 및 기타 특수 장비 없이 괜 찮 실버 와이어를 사용 하 여 쉽게 이루어집니다. 우리의 데이터는이 새로운 전극 민감하고 안정적 4와 7 dpf 사이 애벌레 zebrafish에 망막 신경 회로의 기능 개발을 설명 하는 보여준다. 이 경제적이 고 실용적인 스폰지 팁 전극 연구원 새로운 르 그 시스템을 구축 또는 기존 작은 동물 시스템, zebrafish 연구에 대 한 수정에 유용할 수 있습니다.

Protocol

모든 electroretinogram (에) 절차 동물의 사용 그리고 배려에 대 한 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 코드의 규정에 따라 수행 했다와 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 멜버른의 대학입니다. 1. 버퍼 준비 준비 하는 금붕어 벨의 버퍼 (1.25 M NaCl, KCl 26mm, 25mm CaCl2, 10 m m MgCl2, 100 mM 포도 당, 100 mM HEPES) x 10 역삼 투 (RO) 물을 사용 하 여. PH 7.8에 버퍼를 조정…

Representative Results

이 섹션에 측정 한 매일 4에서 7 dpf에 대 한 대표적인 결과를 제공 합니다. 4 dpf에 응답 강력한 a-와 b-파 구성 요소, 각각 대뇌와 양극 세포에서 발생 하는 표시. 각 나이에 테스트, b 파의 진폭 증가 빛의 강도 (그림 2; 그림 3). 특히, 나 이와 함께 증가 하는 주차 섬광에 애벌레 zebrafish 망막의 감도. A-와 b-웨이브 명확한 신호 했다 더 오래 된 …

Discussion

에 르 그 같은 기능 해독 애벌레 zebrafish^8,9,,1214를 공부 하는 데 사용 하는 도구 제품군에 점점 더 중요 한 되 고 있습니다. 작은 크기로 인해 애벌레 zebrafish 눈의, 유리 micropipettes 전극 가장 게시 프로토콜^3,4,5,,<sup cl…

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings