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Developmental Biology

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

Abstract

제 브라 (Danio rerio) 발달 연구에서 척추 모형으로 일반적으로 사용 되 고 특히 시각적인 신경 과학에 대 한 적합 합니다. 비주얼 퍼포먼스의 기능 측정, electroretinography (에) 더 높은 척 추가 있는 종에서 잘 설립 되었습니다 이상적인 비-침략 적 방법입니다. 이 접근은 점점 zebrafish, 초기 단계에서 발달 애벌레 포함에 시각적 기능을 검토를 위해 사용 되 고 있습니다. 그러나, 애벌레 zebrafish에 날짜에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 기록 전극 유리 제 micropipette 전극 제조, 한정 된 자원을 가진 실험실에 대 한 과제를 제시에 대 한 특수 장비를 필요로 하는. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish에 프로토콜 사용 하 여 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극. 새로운 전극 제조 및 핸들, 더 경제적이 고 유리 제 micropipette 보다 애벌레 눈 손상 가능성이 쉽습니다. 이전에 게시에 방법 처럼 현재 프로토콜 각각 포토 리셉터와 양극 세포 응답, a-와 b-파도를 통해 외부 망막 기능을 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 zebrafish 애벌레, 지원 유틸리티, 감도, 및 새로운 전극의 신뢰성의 초기 개발을 통해 시각적 기능의 상세를 설명 명확 하 게 수 있습니다. 단순화 된 전극 새로운 르 그 시스템 구축 또는 기존 작은 동물에 장치는 제 브라를 사용 하 여 시각적인 신경 과학 연구자를 돕고 zebrafish 측정에 대 한 수정 모델 유기 체 때 특히 유용 하다.

Introduction

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제 브라 (Danio rerio) 시각적인 신경 과학의 연구를 포함 하 여 널리 유전 척추 모델 되고있다. 이 종족의 증가 인기 유전자 조작, 높은 보존된 척추 영상 시스템 (신경, 해부학 적 형태와 조직, 형식과 기본 유전학), 높은 통치의 용이성 등 장점을 표시 될 수 있습니다. 그리고 축산 포유류 모델1에 비해 저렴 한 비용. 비-침략 적 electroretinogram (에) 오래 사용 되었습니다 임상 인간의 시각 기능을 평가 하 고 비전의 크고 작은 설치류 등 애벌레 zebrafish2,3 범위에서 계량을 실험실 속 , 4 , 5. 가장 일반적으로 분석된에 구성 요소는 a 파와 b 파, 빛 감지 대뇌와 바이 폴라 수에서 발생 하는 각각. 애벌레 zebrafish, 망막에 뚜렷한 레이어 3 일 후 수정 (dpf)에 의해 설립 되 고 터미널 포토 리셉터 콘의 형태학 synapses 4 dpf6,7전에 성숙. 애벌레 zebrafish의 외부 망막 기능 따라서 4 dpf는 르 그 이후이 이른 나이에서 측정 가능한 것을 의미 하기 전에 설정 됩니다. 짧은 실험 주기 모델의 높은 처리량 속성 때문에 르 그에 적용 된 애벌레 zebrafish 질환 모델의 기능 평가 위한 컬러 비전 및 망막 개발 분석, 시각적 circadian 리듬 공부 그리고8,,910,,1112마약 테스트.

그러나, 애벌레 zebrafish에 대 한 현재 접근에 채택 하기 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 복잡 한 있다. 일반적으로 기록 전극3,,45,13, 고품질 micropipette 필요로 하로 전도성 액체로 채워진 유리 제 micropipette를 사용 하 여 게시 된 애벌레 zebrafish에 프로토콜 팁3. 특수 장비, micropipette 끌어당기는 등 및 microforge, 어떤 경우에는 그들의 제조에 대 한 필요 합니다. 이 한정 된 자원 가진 실험실에 대 한 도전이 될 수 있습니다 그리고 애벌레 zebrafish 시각적 기능의 측정을 위해 사용할 수 있는 작은 동물에 시스템에 적응 하는 경우에 추가 비용을 리드. 부드럽게 하는 경우에 날카로운 micropipette 팁 애벌레 눈의 표면을 손상 수 있습니다. 또한, 전기 생리학에 대 한 상업 micropipette 홀더 고정된 실버 와이어로 구성 됩니다. 이러한 전선 고정 증가 유지 보수 비용을 선도 하는 새로운 소유자의 구입을 요구 하는 반복 사용 후 패 된다.

여기는 원뿔 모양의 스폰지 팁 기록 전극, 애벌레 zebrafish에 측정에 대 한 설립된 작은 동물에 설정을 적응에 특히 유용 합니다을 사용 하 여 르 그 방법에 설명 합니다. 전극 일반적인 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA) 스폰지 및 기타 특수 장비 없이 괜 찮 실버 와이어를 사용 하 여 쉽게 이루어집니다. 우리의 데이터는이 새로운 전극 민감하고 안정적 4와 7 dpf 사이 애벌레 zebrafish에 망막 신경 회로의 기능 개발을 설명 하는 보여준다. 이 경제적이 고 실용적인 스폰지 팁 전극 연구원 새로운 르 그 시스템을 구축 또는 기존 작은 동물 시스템, zebrafish 연구에 대 한 수정에 유용할 수 있습니다.

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Protocol

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모든 electroretinogram (에) 절차 동물의 사용 그리고 배려에 대 한 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 코드의 규정에 따라 수행 했다와 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 멜버른의 대학입니다.

1. 버퍼 준비

  1. 준비 하는 금붕어 벨의 버퍼 (1.25 M NaCl, KCl 26mm, 25mm CaCl2, 10 m m MgCl2, 100 mM 포도 당, 100 mM HEPES) x 10 역삼 투 (RO) 물을 사용 하 여. PH 7.8에 버퍼를 조정 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독. 4 ° C에서 10 배 버퍼 솔루션 주식3으로 저장 합니다.
    참고: 벨의 버퍼 x 10은 3 개월 이내에 사용 되어야 한다.
  2. 실험 당일, 역방향 삼 투 물을 사용 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 10을 diluting 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 1을 확인 합니다.
    참고: 금붕어 벨의 버퍼 x 1는 PVA 스폰지, 스폰지 애벌레 zebrafish의 배치에 대 한 사용을 포함 하 여 그리고 기록 전극 끝에 스폰지를 포화 하는 데 사용 됩니다.

2. 전극 준비

  1. 원뿔 모양의 스폰지 기록 전극 준비.
    1. 백 금 전극 리드 확장에서 남성 끝을 잘라 고 10mm 메스 블레이드를 사용 하 여 외부 소계 절연 코팅의 끝에서 제거 합니다. 알아서 하지 전극 리드의 내부 와이어를 손상.
    2. 실버 와이어 (0.3 m m 직경)의 40 m m 길이 잘라 하 고 안전 하 게 노출된 내부 와이어와 함께 실버 와이어 entwining 여 이것을 전극 리드에 연결. 실버 와이어 노출 (그림 1A)의 ~ 15 m m 길이 떠나 단 열 테이프를 사용 하 여 관절을 싸는.
    3. 60 9 V DC 소스를 사용 하 여 염화와 노출된은 와이어를 전기 도금 신호 전도 개선 하기 위해 s. 일반적인 염 분에 노출 된 실버 팁을 담가 그리고 배터리의 긍정적인 터미널에 다른 쪽 끝을 연결. 배터리의 부정적인 터미널에 다른 와이어를 연결 하 고 염 분2로 와이어의 다른 쪽 끝을 담가.
      참고: 또는, 표 백제 솔루션 (활성 성분 42 g/L 나트륨도 발견 됐 죠)에 1 시간 동안 그것을 몸을 담글 하 여 실버 와이어 인터네셔널.
    4. PVA의 ~ 20 m m x 20 m m 스퀘어 콘 (그림 1A)를가 위를 사용 하 여 스폰지를 잘라. 벨의 버퍼 x 1를 사용 하 여 스폰지 포화. 접 안 렌즈에 눈금 막대와 현미경, 메스 블레이드 사용 하 여 모양 ~ 40 µ m 직경 원뿔의 꼭대기. 공기 건조 흡수 성 종이 조직에 원뿔 모양의 스폰지까지 고체.
      참고: PVA 스폰지 포화 상당히 확장, 따라서 원뿔의 꼭대기를 형성 하기 전에 스폰지 염 분으로 포화 처음은 중요 하다.
    5. Chloriding, 후 공기 건조 5 분 삽입에 대 한 흡수 성 조직에 실버 와이어는 콘의 기지를 통해 건조, 고체, 원뿔 모양의 PVA 스폰지에 실버 와이어. 어떤 과잉 노출된 금속 태양광 아티팩트 (그림 1B-C)을 줄이기 위해 마스크 테이프를 사용 하 여 보 온.
      참고: 각 실험 세션 후 실버 와이어에서 스펀지를 제거 합니다. 재사용에 대 한 역방향 삼 투 물 및 건조 공기를 사용 하 여 스폰지를 씻어. 최적의 신호 컬렉션을 보장 하기 위해 실버 와이어의 단일 사용은 권장 된다. PVA 스폰지 5 번 이상 재사용 하지.
    6. 실험의 날, 벨의 버퍼 완전히 스폰지를 포화 하 적어도 15 분 동안 x 1으로 기록 전극의 스폰지 팁을 담가.
  2. 스폰지 팁을 연결 하지 않고도 하지만, 위에서 설명한 대로 참조 전극을 준비 합니다.
  3. 접지 전극을 상업적으로 가져옵니다.

3. 제 브라 준비

  1. 다크 적응 zebrafish 애벌레 하룻밤 (> 8 h) 15 mL 튜브에 zebrafish를 배치 하 여 녹음 전에 (< 튜브 당 20 애벌레) 어두운 인큐베이터에 알루미늄 호 일에 싸여. 충분 한 산소 공급을 보장 하기 위해 뚜껑을 제거 합니다.
  2. 녹화 당일, 애벌레를 포함 하는 호 일에 싸서 팔 콘 튜브에 뚜껑을 강화 하 고 튜브 빛-증거 인지 확인 합니다. 애벌레에 연구소를 전송 합니다.
  3. 발광 다이오드 (LED; 17.4 cd.m-2, λ최대 600 nm)에서 희미 한 붉은 조명으로 어둠 속에서 배양 접시에 생선을 붓는 다. 광선이 수건을 사용 하 여 가벼운 노출을 최소화 하기 위해 접시를 커버.

4. 스폰지 플랫폼 준비

  1. 35 mm 페 트리 접시에 snugly에 맞게 건조 PVA 스폰지의 사각형 컷. 스폰지의 두께 페 트리 접시의 깊이를 대략 동일 해야 확인 하십시오.
  2. 기준 전극의 실버 와이어에 맞게 스폰지의 한쪽 끝을 통해 수직으로 작은 상처를 확인 하십시오.
  3. 금붕어 벨의 버퍼 포화 될 때까지 x 1에 PVA 스폰지를 적시 게. 그런 다음, 깨끗 한 35 mm 페 트리 접시에 스폰지를 놓습니다. 솔루션 가벼운 손가락 보도에 대 한 응답에 스폰지에서 발산 될 때까지 여분의 액체를 흡수 하는 종이 타월을 사용 합니다.

5. 동물 및 전극 위치

  1. 애벌레 금붕어 벨의 버퍼 x 1에 희석 0.02 %tricaine 사용 하 여 anesthetize
  2. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 종이 타월 (2~ 3 cm)의 광장에는 마 취 유 충.
  3. 집게를 사용 하 여 촉촉한 스폰지 플랫폼에 유 충을 포함 하는 종이 타월을 놓습니다. 벨의 버퍼에 배어 좋은 브러시를 사용 하 여 유 충의 위치를 조정. 그 한쪽 눈 위쪽으로 직면 유 충 아래 종이 타월의 광장에서 가까운 액체에서 고립 된 확인 합니다.
  4. 유 충에 녹음을 통해 촉촉한 유지 하 아이 젤 보습과 머리를 제외 하 고 애벌레 몸 유약.
  5. 패러데이 케이지 (그림 1D) 안에 위치한 Ganzfeld 그릇 빛 자극 앞 작은 물이 열 플랫폼에 스폰지 플랫폼 페 트리 접시를 놓습니다.
    참고: 스폰지와 애벌레 시체의 온도의 유지 보수 안정 르 그 신호를 보장합니다.
  6. 플랫폼 스폰지 (그림 1D)에서 만든 컷에 참조 전극을 삽입 합니다.
  7. 패러데이 케이지를 상업적으로 얻은 접지 전극을 연결 합니다.
  8. 전극 홀더를 기록 전극 연결 및 보안 stereotaxic 팔 micromanipulator (그림 1D)의 홀더. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다시 채도 대 한 전극의 스폰지 팁에 벨의 솔루션 x 1의 한 방울을 똑.
  9. 전극의 배치에 대 한 르 그 플랫폼 위에 패러데이 케이지 현미경을 놓습니다.
    참고: 조명은 dark-adaptation를 유지 하면서 dim 적색 LED (17.4 cd.m-2, λ최대 600 nm) 유 충의 관측을 허용 하 고 활성 전극의 배치에 의해 제공 되어야 한다.
  10. 현미경 애벌레의 관찰 수 있도록 스폰지 플랫폼의 위치를 조정 합니다. 다음, 흡수 성 직물을 사용 하 여 전극 스폰지 팁에서 과잉 액체를 제거.
  11. (그림 1E) 애벌레 zebrafish 눈의 중앙 각 막 표면을 부드럽게 이어지도록 합니다 활성 전극 위치.
  12. Ganzfeld 그릇 스폰지 플랫폼으로 이동 하 고 유 충은 그릇에 의해 보호 확인 합니다.
  13. 외부 전자기 소음을 줄이기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.

6. Electroretinogram 기록

  1. 특정에 시스템의 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 자극을 실행 하 고 데이터를2아래 권장 하는 설정에 따라 (자세한 재료의 표 참조).
    1. 수집 소프트웨어에서 창 (2, 560 점)을 기록 한 650 ms 이상 4 KHz을 시스템의 샘플링 속도 설정 합니다.
    2. 1000 × 시스템의 이득을 설정 합니다.
    3. 1-300 hz 시스템의 대역 통과 필터링을 설정 합니다.
    4. 노치 필터를 사용 하 여 60 Hz (또는 지역 유틸리티 주파수에 따라 50 Hz) 감소 잡음.
      참고: 이상적인 소음 수준 ± 10 µ V 보다 더 이상 이어야 한다.
  2. 아래 설명 된 절차를 사용 하 여 데이터 컬렉션을 시작 합니다.
    1. 단일 테스트-플래시 (0.06 로그 cd.s/m2)를 사용 하 여 테스트 응답 전극의 위치를 평가 하기 위해 눈을 측정.
      참고: B 파 진폭 4 dpf 애벌레에 25 µ V 보다 큰 테스트 플래시의이 강도 발생 한다. 강력한 응답, 측정 될 수 없는 경우 다음 전극 위치 고 다른 전극에 위치 잘 확인 플래시 테스트.
    2. 어두운 동물 허용 다음 테스트-플래시, 녹음 하기 전에 완전 한 어둠 속에 3 분에 대 한 적응.
    3. 현재 밝은 빛 농도를 주차에서 깜박입니다.
    4. 전체 평균 신호 신호-잡음 레벨에 따라 반복 됩니다.
      참고: 일반적으로, 더 많은 주차 가벼운 수준 (3 개 이상의 반복) 신호와 밝은 가벼운 수준 (일반적으로 반복 1) 적은 평균. 점차적으로 60 10에서 간 자극 간격을 길게 밝은 게 흐릿한 빛이 수준에서 s. 샘플 프로토콜은 표 1에 표시 됩니다.
    5. 녹음 후 고통 없이 0.1 %tricaine 사용 하 여 애벌레를 죽 일.

7입니다. 분석

  1. 초기 부정적인 파를 구 유에서 한 파 진폭 및 긍정적인 b-웨이브 피크 부정적인-파 여 물통에서 b 파 진폭 측정 합니다.
  2. 파의 여 물통을 b 파의 피크 자극 발병에서 a-와 b-웨이브 암시적 시간을 각각 측정.

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Representative Results

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이 섹션에 측정 한 매일 4에서 7 dpf에 대 한 대표적인 결과를 제공 합니다. 4 dpf에 응답 강력한 a-와 b-파 구성 요소, 각각 대뇌와 양극 세포에서 발생 하는 표시. 각 나이에 테스트, b 파의 진폭 증가 빛의 강도 (그림 2; 그림 3). 특히, 나 이와 함께 증가 하는 주차 섬광에 애벌레 zebrafish 망막의 감도. A-와 b-웨이브 명확한 신호 했다 더 오래 된 애벌레 (그림 2)에 대 한 이러한 농도에 탐지 하는 반면-1.61 cd.s/m2 4 dpf, 로그 보다 낮은 농도에서 인식할 수 없었다. B 파 응답 4와 5의 dpf 사이 크게 성장 (P < 0.0001; 그림 2A -B; 그림 3B)입니다. 낮은 농도에서 b 파 5 및 7 dpf 사이의 작은 변화를 보여, 비록 2.48 로그 cd.s/m2 신호 5와 6 dpf에 비해 7 dpf에 컸다 (P < 0.0001; 그림 2; 그림 3B)입니다. A와 b 파 암시적 번 5 dpf 후 상당히 빠른 되었다 (P < 0.0001; 그림 3C -D)입니다. 전반적으로, 이러한 결과 4 ~ 7 dpf 사이 zebrafish 망막 기능의 성숙 보여 줍니다. 흥미롭게도, 한 파 진폭 감소 7 dpf (그림 3A)에 5에서 등장. 이 외부 망막에서 시 냅 스 연결의 성숙-파 마스크 빠른 b 파 발병의 결과로 양극 세포 응답의 대기 시간을 단축 하기 때문에 있을 수 있습니다. 그는 파를 공부 하고자 약리 치료 블록 후 photoreceptoral 응답 (즉, b 파 구성 요소)를 고용 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 제 브라 G anzfeld에 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 설정. (A) 원뿔 모양의 스폰지 팁과 염화은 전극은 스폰지 팁 전극 생성 하기 전에 건조. (B-C) 그 후, 염화은 와이어 기반 전체 전극 형성을 통해 스폰지 콘에 삽입 됩니다. (D) 전형적인 애벌레 zebrafish Ganzfeld 르 그 설치 기준 전극 스폰지 플랫폼 삽입 되 고 제 브라 유 충 Ganzfeld 그릇. (E) 스폰지 팁 전극 부드럽게 애벌레 눈의 중앙 각 막 표면 접촉. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 야생-타입 애벌레 zebrafish의 대표 평균에 흔적. (A) 4 wildtype zebrafish의 르 그 흔적을 평균 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7), 및 (D) 7 dpf (n = 9). 응답 했다 백색 Led에서 섬광을 사용 하 여 elicited. 각 나이에 흔적 표시 (맨 아래)에서 섬광에 대 한 응답-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0.06, 0.72, 1.55, 1.89, 2.18, 2.48 로그 cd.s/m2. 눈금 막대 = 50 µ V. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 4 ~ 7 dpf zebrafish의 암시적 시간과 르 그 a-와 b-파 진폭. (A) 평균 (± 표준 오차의 의미)를 그룹화 한 파 진폭 플래시 강도 증가 하지만 4-7 dpf 애벌레 나 이와 함께 감소. 4-7 dpf 애벌레에 (B) 평균 b-파 진폭 증가 플래시 강도; 진폭 4와 5의 dpf 사이 성장 했다. (C) 평균 a-파 암시적 시간과 시간 (D) 평균 b-웨이브 암시적 5, 6 및 7 dpf 사이 빠른 되었다. 최적의 선 비-선형 회귀에서 파생 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

자극 빛의 강도 (로그 cd.s.m-2) 반복의 수 간 자극 간격 (s)
-2.75 3 ~ 6 10
(30 다음 전에 s)
-2.11 3 ~ 6 10
(30 다음 전에 s)
-1.61 3 ~ 6 10
(30 다음 전에 s)
-0.81 3 ~ 6 10
(60 다음 전에 s)
0.06 3 ~ 6 10
(60 다음 전에 s)
0.72 1 ~ 3 60
1.55 1 ~ 3 60
1.89 1 ~ 3 60
2.18 1 ~ 3 60
2.48 1 ~ 3 60

표 1: 르 그 녹음의 예제 프로토콜. 자극 프레 젠 테이 션 밝은 (아래) 가벼운 수준, 그 어두운 적응 유지 되도록 간 자극으로 점진적으로 더 이상 진행 하 고 흐릿한 (맨 위)에서 시작 합니다. 각 강도에서 평균 신호 수가 신호-잡음 레벨에 따라 달라 집니다.

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Discussion

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에 르 그 같은 기능 해독 애벌레 zebrafish8,9,,1214를 공부 하는 데 사용 하는 도구 제품군에 점점 더 중요 한 되 고 있습니다. 작은 크기로 인해 애벌레 zebrafish 눈의, 유리 micropipettes 전극 가장 게시 프로토콜3,4,5,,89 에 기록으로 적응 되어 , 12 , 13 , 14. 우리가 사용 하는 간단한 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 애벌레 zebrafish에 프로토콜을 설명 하는 여기. 새로운 전극 수정 추가 장비 없이 애벌레 zebrafish 망막 기능을 측정 하기 위해 표준 작은 동물에 시스템을 사용할 수 있습니다. 스폰지 팁 전극 만들기 위한 자료는 단순히 상업 PVA 스폰지 및 이전 방법 보다 더 경제적인 게 0.3 m m 실버 와이어. 또 다른 장점은입니다, 하드와 날카로운 micropipette 팁 달리 gentler 전극 스폰지 팁 덜 애벌레 눈을 손상 가능성이 높습니다. 마지막으로, PVA 스폰지 녹음을 통해 애벌레 눈에 수 분을 유지 하는 데 도움이 됩니다.

스폰지 팁 전극의 성공적인 응용 프로그램에 키 하는 스폰지의 전체 채도입니다. 이 일반적으로 금붕어 벨의 버퍼 x 1에 몸을 담글의 15 분 이상 걸립니다. 스폰지의 불완전 한 채도 전극의 빠른 건조 때문에 잡음 레벨을 높일 수 있습니다. 대 한 더 나은 신호 컬렉션, 각 실험 세션 (일반적으로 < 8 h) 사용 하지 않는 것이 좋습니다에 대 한 새로운 전극 만들기. 반복 사용 감소에 신호 간 세션 비교를 더 어렵게 될 수 있습니다.

때 스폰지 플랫폼에 애벌레 zebrafish, 위치 해야 합니다 주의 측정 눈 주변 솔루션 또는 물고기 아래 종이 타월 접촉 하지는 보장 하기 위해. 이러한 연락처 참조 전극 스폰지 플랫폼에 포함 되 고 감소는 전기 회로 반바지.

잘 포화 전극 스폰지 팁도 함께 점진적 건조 발생을 르 그 신호에 노이즈가 증가으로 분명 하다. 이 발생, 1 x 금붕어 벨의 1 mL 주사기와 바늘 30 G x ½ "를 사용 하 여 콘의 기지에의 한 방울 똑. 추가 솔루션 스폰지 팁을 잡음 레벨을 감소 하지 않습니다, 경우 눈 주변 유체와 접촉 하지 인지 확인 하 고 전극 팁은 각 막 정점에 중심으로 확인 합니다.

여기 보고 대표 결과에 기록 1-300 hz, 진동 후보 (OP)의 샘플링을 허용 하지 않는 대역 설정 되었다-포함 한 3 차 망막 신경 세포에서 파생 된 b-웨이브 웨이브 amacrine와 신경 절 세포 15,,1617. 높은 저역 설정 (예를 들어, 500 또는 1000 Hz) OP 녹음에 더 있을 수 있습니다.

요약 하자면, 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 애벌레 zebrafish에 녹음 신뢰할 수 있는 결과 제공 하는 기존 작은 동물에 시스템을 단순화 하기 위해 도움이 됩니다. 대표 결과 진폭 사이 4 및 5 dpf, dpf 빠른 암시적 번 낸 5와 7 사이 더 성숙으로 성장 하는 방법을 보여 줍니다. 경제적이 고 실용적인 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극와 우리의 간단한에 프로토콜 zebrafish 망막 기능을 공부 하는 수 사관을 활용할 수 있습니다. 기술은 또한 성인 zebrafish 또는 작은 눈을 가진 다른 척 추가 있는 모델을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

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Disclosures

저자 아무 공개가이 작품에 관련 된 있다.

Acknowledgments

자금이 프로젝트에 대 한 제공 했다 교부 금에 의해 멜버른 신경 과학 연구소에서 (PTG, PRJ & BVB)에.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. Academic Press. 143-151 (2018).
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스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram
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Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

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