Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Electroretinogram opptak i larver sebrafisk bruker A Novel koniske svamp-tip elektrode

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll som forenkler måling av lys vakte electroretinogram svar fra larver sebrafisk. En roman koniske svamp-tip elektrode kan bidra til å gjøre studiet av visuell utvikling i larver sebrafisk bruker electroretinogram ERG lettere å oppnå med pålitelige resultater og lavere kostnader.

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) brukes ofte som virveldyr modell i utviklingsmessige studier og er spesielt egnet for visuell nevrovitenskap. For funksjonelle målinger av visuell ytelse er electroretinography (ERG) en ideell ikke-invasiv metode, som er godt etablert i høyere virveldyr arter. Denne fremgangsmåten brukes stadig mer for å undersøke funksjonen visuelle i sebrafisk, inkludert under de tidlige utviklingsmessige larver stadiene. Den mest brukte opptak elektroden for larver sebrafisk ERG hittil er imidlertid glass brønnene elektroden, som krever spesialisert utstyr for fremstillingen, presentere en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser. Her presenterer vi en larver sebrafisk ERG protokollen bruker en kjegle-formet svamp-tip elektrode. Romanen elektroden er lettere å produksjon og håndtak, mer økonomisk, og mindre sannsynlig å skade larver øyet enn glass brønnene. Som tidligere publiserte ERG metoder, kan gjeldende protokollen vurdere ytre netthinnefunksjon gjennom photoreceptor og bipolar celle svar, a - og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan tydelig illustrere avgrensningen av visuelle funksjon i den tidlige utviklingen av sebrafisk larvene, støtter det verktøyet, følsomhet og pålitelig romanen elektroden. Forenklet elektroden er spesielt nyttig når etablere et nytt ERG system eller endre eksisterende liten-dyr ERG apparater for sebrafisk måling, hjelpe forskere i visuelle neurosciences bruke sebrafisk modell organisme.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte genetisk virveldyr modellen, inkludert studier av visuelle neurosciences. Den økende populariteten til denne arten kan tilskrives fordeler inkludert enkel genetisk manipulasjon, høyt konservert virveldyr visuelle systemet (Nevron typer, anatomisk morfologi og organisasjon og underliggende genetikk), høy fruktbarhet og lavere kostnader rettsgrunnlag sammenlignet pattedyr modeller1. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har lenge vært brukt klinisk å vurdere menneskelige visuelle funksjon, og i laboratorium innstillingen å kvantifisere visjon i en rekke små og store arter inkludert gnagere og larver sebrafisk2,3 , 4 , 5. oftest analysert ERG komponentene er en bølge og b-bølge, som stammer fra lys-sensing fotoreseptorer og bipolar interneurons, henholdsvis. I larver sebrafisk, forskjellige lag i netthinnen er etablert av 3 dager etter befruktning (dpf) og morfologi av photoreceptor membran terminal synapser modne før 4 dpf6,7. Ytre retinal funksjon av larver sebrafisk er dermed etablert før 4 dpf, betyr at ERG er målbare fra denne tidlig alder og utover. På grunn av korte eksperimentelle syklusen og egenskapene høy gjennomstrømming for modellen, har ERG blitt brukt til larver sebrafisk funksjonelle vurdering av sykdom modeller, analysere fargen syn og retinal utvikling, studere visuelle døgnrytme og testing narkotika8,9,10,11,12.

Gjeldende metoder for larver sebrafisk ERG har imidlertid noen kompleksiteten som kan gjøre det vanskeligere å adoptere. Publisert larver sebrafisk ERG protokoller bruker vanligvis glass brønnene fylt med ledende væske som opptak elektrode3,4,5,13, som krever høy kvalitet brønnene tips3. Spesialisert utstyr, som en brønnene avtrekker og i noen tilfeller en microforge, kreves for TVer. Dette kan være en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser og fører til ekstra kostnader selv når tilpasse tilgjengelige liten dyr ERG systemer for måling av larver sebrafisk visuelle funksjon. Selv når glattet kan skarpe brønnene spissen skade overflaten av larver øyet. I tillegg, er kommersiell brønnene holdere for elektrofysiologi bygget med en fast sølv wire. Disse faste ledninger bli paddivert etter repeterende bruk krever kjøp av nye fører til økt vedlikeholdskostnader.

Her beskriver vi en ERG metoden ved hjelp av en kjegle-formet svamp-tip opptak elektrode, som er spesielt nyttig for å tilpasse etablerte liten-dyr ERG oppsett for larver sebrafisk ERG målinger. Elektroden gjøres enkelt ved hjelp av vanlige polyvinylacetat (PVA) svamp og fint sølv wire uten andre spesialiserte utstyr. Våre data viser at denne romanen elektrode sensitiv og pålitelig nok å demonstrere funksjonelle utviklingen av netthinnen nevrale kretser i larver sebrafisk mellom 4 og 7 dpf. Dette økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttig for forskerne å etablere nye ERG systemer eller endre eksisterende liten-dyr systemer for sebrafisk studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle electroretinogram (ERG) prosedyrer ble utført i henhold til bestemmelsene i den australske National Health and Medical Research Council anbefaling for omsorg og bruk av dyr og ble godkjent av institusjonelle dyreetikk på den Universitetet i Melbourne.

1. buffer forberedelse

  1. Forberede 10 x gullfisk Ringer i bufferen (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukose, 100 mM HEPES) bruke omvendt osmose (RO) vann. Juster buffer til pH 7,8 og sterilisere bufferen med 0.22 μm filter. Lagre 10 x bufferen på 4 ° C som løsning lager3.
    Merk: 10 x Ringer i bufferen brukes innen 3 måneder.
  2. På dagen for eksperimentet, gjøre 1 x gullfisk Ringer i bufferen ved å fortynne 10 x gullfisk Ringer i bufferen bruke omvendt osmose vann.
    Merk: 1 x gullfisk Ringer i bufferen brukes å mette PVA svamp, inkludert svampen brukes for plassering av larver sebrafisk, og svamp på opptak elektrode spissen.

2. elektrode forberedelse

  1. Forberede koniske svamp opptak elektroden.
    1. Skjær den mannlige enden fra platina elektroden føre forlengelsen og Fjern fra slutten 10 mm ytre polytetrafluoroethylene isolasjon Beleggets ved hjelp av en skalpell blad. Ta vare ikke for å skade indre wire elektrode bly.
    2. Skjær en 40 mm lengde av sølv wire (0,3 mm diameter) og sikkert knytte dette til elektroden ledelsen ved sammenfletter sølv wire med synlige indre wire. Encase felles med isolerende tape, forlate en ~ 15 mm lengde av sølv wire utsatt (figur 1A).
    3. Electroplate utsatt sølv wire med chloride bruker en 9 V DC kilde for 60 s å forbedre signal ledning. Fordype eksponert sølv tipset i normal saline og koble den andre enden til positiv terminalen batteriet. Koble en ledning til den negative terminalen på batteriet og dyppe den andre enden av ledningen inn i saltvann2.
      Merk: Eventuelt chlorinate sølv wire av soaking det i 1 time i en blekemidler løsning (virkestoffet 42 finans natriumhypokloritt).
    4. Skjær en ~ 20 x 20 mm kvadrat PVA svamp med saks for å gjøre en kjegle (figur 1A). Mette svampen bruker 1 x Ringer i bufferen. Under et mikroskop med en skala bar på i okularet, bruk en skalpell blad til toppen av kjeglen ~ 40 µm diameter. Lufttørke koniske svamp på absorberende papir vev før det er solid.
      Merk: PVA svampen utvider betydelig når mettet, derfor er det viktig at svampen først er mettet med saltvann før forme toppen av kjeglen.
    5. Etter chloriding lufttørke sølv wire på en absorberende vev for 5 min. Sett inn sølv wire i tørket, solid, koniske PVA svamp gjennom bunnen av kjeglen. Isolere eventuelle overskytende avdekkede metallet med maske tape for å redusere photovoltaic gjenstander (Figur 1B-C).
      Merk: Etter hver eksperimentelle økt, fjerne svamp fra sølv wire. Vask svamp med omvendt osmose vann og luft tørke for gjenbruk. For å sikre optimal signal samling, anbefales enkel bruk av sølv wire. PVA svamper skal ikke brukes mer enn 5 ganger.
    6. På dagen for eksperimentet, dyppe svamp-spissen av opptak elektroden i 1 x Ringer i bufferen for minst 15 min å fullt mette svamp.
  2. Forberede referanse elektroder som beskrevet ovenfor, men uten å knytte svamp spissen.
  3. Få bakken elektroden kommersielt.

3. sebrafisk forberedelse

  1. Mørk tilpasse sebrafisk Larvene natten (> 8 h) før opptak ved å plassere sebrafisk i en 15 mL tube (< 20 Larvene per tube) innpakket i aluminiumsfolie i en mørk inkubator. Fjern lokket for å sikre tilstrekkelig oksygentilførsel.
  2. På dagen for opptaket, skru lokket til folie innpakket falcon røret som inneholder larver og sikre at røret er lystette. Transport Larvene til ERG lab.
  3. Hell fisken i Petri retter i mørket med hjelp av svak rød belysning fra en lysdiode (LED, 17.4 cd.m-2, λMaks . 600 nm). Dekk Petri retter med lystette håndklær for å minimere lyseksponering.

4. svamp plattform forberedelse

  1. Klipp ut et rektangel av tørr PVA svamp å passe perfekt i en 35 mm Petriskål. Kontroller at tykkelsen av svampen bør være omtrent lik dybden av Petriskål.
  2. Gjør et lite kutt loddrett gjennom en ende av svamp å imøtekomme sølv wire av referanse elektroden.
  3. Suge PVA svamp i 1 x gullfisk Ringer i bufferen til mettet. Deretter plassere svamp i en ren 35 mm Petriskål. Bruk et papirhåndkle til å absorbere ekstra væske til ingen løsning utstråler fra svamp som svar på en lys finger trykk.

5. animal og elektroden posisjonering

  1. Bedøve Larvene bruker 0.02% tricaine fortynnet i 1 x gullfisk Ringer i bufferen.
  2. Bruk en 3 mL Pasteur pipette for å overføre en bedøvet Larven bort håndkle (~ 3 cm2).
  3. Plass papirhåndkle inneholder Larven på fuktig svamp plattformen ved hjelp av pinsett. Bruk en fin børste dynket i Ringer i bufferen til å justere plasseringen av Larven. Kontroller at ett øye vender oppover, isolert fra nærliggende væske på torget håndkle under Larven.
  4. Glasur larver kroppen, unntatt hodet, med en fuktighetsgivende øye gel å holde Larven fuktig hele ERG innspillingen.
  5. Plasser Petriskål svamp plattform på en liten vannet oppvarmede plattform foran Ganzfeld bolle lys stimulans ligger innenfor en Faraday bur (figur 1 d).
    Merk: Vedlikehold av temperaturen på svamp og larver kroppen sikrer stabil ERG signaler.
  6. Sett inn referanse elektroden i kuttet i plattformen svampen (figur 1 d).
  7. Koble kommersielt innhentet bakken elektroden til buret.
  8. Knytte opptak elektroden til en elektrodeholderen og sikre innehaver å stereotaxic armen av en micromanipulator (figur 1 d). Bruk en 3 mL Pasteur Pipetter til drypp en dråpe 1 x Ringer i løsningen på svamp spissen av elektroden for re metning.
  9. Plasseringen mikroskopet i buret over ERG plattformen for plassering av elektroden.
    Merk: Belysning bør gis av en svak røde LED (17.4 cd.m-2, λMaks . 600 nm) å tillate observasjon av Larven og plasseringen av den aktive elektroden, samtidig som dark-adaptation.
  10. Juster plasseringen av svamp plattformen å tillate observasjon av Larven under mikroskopet. Deretter Bruk absorberende vev for å fjerne overflødig væske fra elektrode svamp spissen.
  11. Plasser aktive elektroden slik at den forsiktig berører den sentrale hornhinnen overflaten larver sebrafisk (figur 1E).
  12. Flytt Ganzfeld bollen mot svamp plattformen og sikre at larvene er dekket av bollen.
  13. Lukk buret for å redusere overflødig elektromagnetisk støy.

6. Electroretinogram-opptak

  1. Bruke dataprogrammer bestemt ERG systemet (se tabellen for materiale for detaljer) å utløse stimulans og hente data basert på innstillingene anbefalt2nedenfor.
    1. Angi samplingshastigheten av systemet til 4 KHz over en 650 ms opptak vinduet (2,560 poeng) i oppkjøpet programvaren.
    2. Angi forsterkningen av systemet til 1000 ×.
    3. Angi båndpass filtrering av systemet til 1-300 Hz.
    4. Bruke støyfilter for å redusere 60 Hz (eller 50 Hz, avhengig av lokale verktøyet frekvens) støy.
      Merk: Ideell støynivået bør være mer enn ±10 µV.
  2. Starte innsamling bruke fremgangsmåten beskrevet nedenfor.
    1. Bruk en enkelt test-flash (0,06 Logg cd.s/m2) til å måle test svar fra øyet å vurdere plasseringen av elektroder.
      Merk: Denne intensiteten av testen flash skal resultere i en b-bølge amplitude større enn 25 µV i 4-dpf larver. Hvis en robust reaksjon ikke kan måles, og deretter flytte elektrodene og gjøre en annen test flash for å bekrefte at elektrodene er godt posisjonert.
    2. Etter test-flash, tillater dyr til mørke tilpasse for 3 min i fullstendig mørke før opptak.
    3. Presentere blinker fra dimmer til lysere lys intensiteter.
    4. Gjennomsnittlig signaler over gjentar ifølge signal-til-støy nivået.
      Merk: Generelt, gjennomsnittlig flere signaler på dimmer lysnivået (ikke mindre enn 3 gjentar) og færre på lysere lysnivået (vanligvis 1 gjenta). Gradvis forlenge intervallet mellom stimulans fra 10 til 60 s fra mørkeste til smarteste lysnivået. En eksempel-protokoll er vist i tabell 1.
    5. Etter innspillingene, Human drepe Larvene med 0,1% tricaine.

7. analyser

  1. Måle en bølge amplituden fra grunnlinjen til den negative en bølge gjennom og b-bølge amplituden fra negative en bølge bunnen til positiv b-bølge peak.
  2. Måle a - og b-bølge implisitt ganger fra stimulans utbruddet til bunnen av en bølge og toppen av b-bølge, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne delen gir ERG målinger tatt daglig fra 4 til 7 dpf representant resultater. Fra 4 dpf viser ERG svar robust a - og b-bølge komponenter, som oppstår fra fotoreseptorer og bipolar celler, henholdsvis. I hver alder testet, amplituden til b-bølge økt med lav intensitet (figur 2; Figur 3). Spesielt følsomheten av larver sebrafisk netthinnen til dimmer blinker økt med alderen. A - og b-bølgen var ikke gjenkjennelig på intensiteter lavere enn-1.61 logge cd.s/m2 på 4 dpf mens klare signaler var synlig på intensitetssonene for eldre Larvene (figur 2). B-bølge svaret vokste betydelig mellom 4 og 5 dpf (P < 0,0001; Figur 2A -B; Figur 3B). Selv om b-bølgen på lavere intensitet viste liten endring mellom 5 og 7 dpf signalet på 2.48 Logg cd.s/m2 var større på 7 dpf sammenlignet med 5 og 6 dpf (P < 0,0001; Figur 2; Figur 3B). En - og b-bølge implisitt ganger ble betydelig raskere etter 5 dpf (P < 0,0001; Figur 3 c -D). Samlet sett viser disse resultatene modning av sebrafisk retinal funksjonen mellom 4 til 7 dpf. Interessant, syntes en bølge amplituden å redusere fra 5 til 7 dpf (figur 3A). Dette kan være fordi modning av synaptic tilkoblinger i ytre netthinnen forkorter ventetiden bipolar celler svar, noe som resulterer i raskere b-bølge utbruddet som masker en bølge. De som ønsker å studere en bølge kan bruke farmakologisk behandling til blokk post photoreceptoral svar (dvs b-bølge komponent).

Figure 1
Figur 1: sebrafisk G anzfeld ERG satte opp med kjegleformet svamp-tip elektroden. (A) den koniske svampen tips og klorinerte sølv elektroden har tørket før konstruere svamp-tip elektroden. (ABC) Deretter settes klorerte sølv wire i svamp membran gjennom basen til fullstendig elektroden. (D) i typisk larver sebrafisk Ganzfeld ERG stilling, referanse elektroden i svamp plattformen og sebrafisk Larven er dekket av Ganzfeld bollen. (E) svamp-spissen elektrode berører forsiktig den sentrale hornhinnen overflaten larver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant gjennomsnittlig ERG spor av vill-type larver sebrafisk. Gjennomsnittlig ERG spor av wildtype sebrafisk på (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7), og (D) 7 dpf (n = 9). Svar var vakte bruker blinker fra hvite lysdioder. I hver alder, spor Vis Svar å glimt av (fra bunn til topp)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0.06, 0.72, 1,55, 1.89, 2.18, 2.48 logge cd.s/m2. Skala bar = 50 µV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ERG a - og b-bølge amplitudes og implisitt tider for 4 til 7 dpf sebrafisk. (A) gruppe gjennomsnittlig (± standard feil av gjsnitt) amplituden økt med blits intensitet men redusert med alderen i 4 – 7 dpf Larvene en bølge. (B) gjennomsnittlig b-bølge amplituden i 4 – 7 dpf Larvene økt med glimtet intensiteten; amplituden vokste mellom 4 og 5 dpf. (C) gjennomsnittlig en-bølge implisitt og (D) gjennomsnittlig b-bølge implisitt tid ble raskere mellom 5, 6 og 7 dpf. Linjer med beste tilpassing er avledet fra ikke-lineær regresjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Stimulans lysintensiteten (cd.s.m-for Logg-2) Antall repetisjoner Inter stimulans intervall (s)
-2.75 3 til 6 10
(30 før neste)
-2.11 3 til 6 10
(30 før neste)
-1.61 3 til 6 10
(30 før neste)
-0.81 3 til 6 10
(60 før neste)
0,06 3 til 6 10
(60 før neste)
0.72 1-3 60
1,55 1-3 60
1.89 1-3 60
2,18 1-3 60
2.48 1-3 60

Tabell 1: Eksempel protokollen av ERG innspillinger. Stimulans presentasjoner starter fra den mørkeste (øverst) og fremgangen lysere (nederst) lysnivåer, med stadig lenger mellom stimulans intervaller for å sikre at mørk tilpasning opprettholdes. Antall signaler gjennomsnitt hver intensitet avhenger av signal-til-støy nivået.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Funksjonell readouts som ERG har blitt stadig viktigere i suite av verktøy som brukes til å studere larver sebrafisk8,9,12,14. På grunn av den lille størrelsen på larver sebrafisk øyet, har glass Mikropipetter blitt tilpasset som spiller inn elektrodene i mest publiserte protokoller3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. her beskriver vi en larver sebrafisk ERG protokollen bruker en enklere koniske svamp-tip elektrode. Romanen elektroden kan brukes til å endre standard liten-dyr ERG systemer for å måle larver sebrafisk retinal funksjon uten ekstra utstyr. Materialer for å lage svamp-tip elektroden er bare kommersielle PVA svamp og 0,3 mm sølv wire, som gjør dette mer økonomisk enn tidligere tilnærmingene. En annen fordel er at i motsetning til hard og skarpe brønnene spissen, mildere elektrode svamp spissen er mindre sannsynlig å skade larver øyet. Til slutt, PVA svampen bidrar til å opprettholde fuktighet larver øyet hele innspillingen.

Nøkkelen til vellykket bruk av svamp-tip elektroden er å sikre full metning av svampen. Dette tar normalt ikke mindre enn 15 minutter av soaking i 1 x gullfisk Ringer i bufferen. Ufullstendig metning av svampen kan øke støynivået på grunn av raskere tørking av elektroden. For bedre signal samling, gjør nye elektroder for hver eksperimentelle økt (vanligvis < 8 h) anbefales. Gjenta bruk kan føre til redusert ERG signaler, sammenlikner mellom økt vanskeligere.

Ved plassering av larver sebrafisk på svamp plattformen, må hensyn tas for å sikre at øyet skal måles ikke i kontakt med omkringliggende løsning eller papirhåndkle under fisken. Slik kontakt shorts elektrisk krets, som referanse elektroden er innebygd i svamp plattformen og reduserer ERG.

Selv med godt mettet elektrode svamp tips oppstår gradvis tørking, som er tydelig som økt støy i ERG signaler. Skal dette forekommer, drypp en dråpe 1 x gullfisk Ringer i på undersiden av membran 1 mL sprøyte og en 30 G x ½" nål. Hvis legge løsningen til svamp spissen ikke reduserer støynivået, kontroller at øyet ikke er i kontakt med en omkringliggende væske og sikre at elektrode spissen er sentrert på hornhinnen apex.

Innspillingene i representant resultatene rapporteres her ble gjort med Båndpassdesign innstillingen 1-300 Hz, som ikke tillater utvalg av oscillasjon potensialer (OP)-wavelets på b-bølge avledet fra tredje-ordens retinal neurons inkludert amacrine og ganglion celler 15,16,17. En høyere lavpassfilter innstilling (f.eks 500 eller 1000 Hz) kan være bedre egnet for OP opptak.

I sammendraget bidrar koniske svamp-tip elektroden til å forenkle larver sebrafisk ERG opptak med eksisterende liten-dyr ERG systemer, gir pålitelige resultater. Representant resultatene viser at ERG amplituden vokser mellom 4 og 5 dpf med ytterligere modning mellom 5 og 7 dpf manifestert som raskere implisitt ganger. Vår enkle ERG protokoll med økonomisk og praktisk koniske svamp-tip elektroden nytte etterforskere studere sebrafisk retinal funksjon. Teknikken kan også tilpasses vurdere voksen sebrafisk eller andre virveldyr modeller med små øyne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer relevant for dette arbeidet.

Acknowledgments

Finansiering for prosjektet ble levert av en bevilgning fra Melbourne nevrovitenskap Institute (til PTG, PRJ & BVB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. Academic Press. 143-151 (2018).
  2. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. e54158 (2016).
  3. Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
  4. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 57-68 (2002).
  5. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
  6. Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56, (3), 222-236 (2003).
  7. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72, (3), 302-327 (2012).
  8. Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16, (5), 881-888 (1999).
  9. Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3, (6), e201703000003 (2017).
  10. Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. dmm. 035220 (2018).
  11. Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11, (2), 995-1003 (2015).
  12. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010).
  13. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135, (1-2), 205-210 (2004).
  14. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222, (4), 564-570 (2001).
  15. Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87, (5), 459-466 (2008).
  16. Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 17-36 (2002).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555, (1), 153-173 (2004).
Electroretinogram opptak i larver sebrafisk bruker A Novel koniske svamp-tip elektrode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter