Electroretinogram opptak i larver sebrafisk bruker A Novel koniske svamp-tip elektrode

Summary

Her presenterer vi en protokoll som forenkler måling av lys vakte electroretinogram svar fra larver sebrafisk. En roman koniske svamp-tip elektrode kan bidra til å gjøre studiet av visuell utvikling i larver sebrafisk bruker electroretinogram ERG lettere å oppnå med pålitelige resultater og lavere kostnader.

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) brukes ofte som virveldyr modell i utviklingsmessige studier og er spesielt egnet for visuell nevrovitenskap. For funksjonelle målinger av visuell ytelse er electroretinography (ERG) en ideell ikke-invasiv metode, som er godt etablert i høyere virveldyr arter. Denne fremgangsmåten brukes stadig mer for å undersøke funksjonen visuelle i sebrafisk, inkludert under de tidlige utviklingsmessige larver stadiene. Den mest brukte opptak elektroden for larver sebrafisk ERG hittil er imidlertid glass brønnene elektroden, som krever spesialisert utstyr for fremstillingen, presentere en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser. Her presenterer vi en larver sebrafisk ERG protokollen bruker en kjegle-formet svamp-tip elektrode. Romanen elektroden er lettere å produksjon og håndtak, mer økonomisk, og mindre sannsynlig å skade larver øyet enn glass brønnene. Som tidligere publiserte ERG metoder, kan gjeldende protokollen vurdere ytre netthinnefunksjon gjennom photoreceptor og bipolar celle svar, a – og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan tydelig illustrere avgrensningen av visuelle funksjon i den tidlige utviklingen av sebrafisk larvene, støtter det verktøyet, følsomhet og pålitelig romanen elektroden. Forenklet elektroden er spesielt nyttig når etablere et nytt ERG system eller endre eksisterende liten-dyr ERG apparater for sebrafisk måling, hjelpe forskere i visuelle neurosciences bruke sebrafisk modell organisme.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte genetisk virveldyr modellen, inkludert studier av visuelle neurosciences. Den økende populariteten til denne arten kan tilskrives fordeler inkludert enkel genetisk manipulasjon, høyt konservert virveldyr visuelle systemet (Nevron typer, anatomisk morfologi og organisasjon og underliggende genetikk), høy fruktbarhet og lavere kostnader rettsgrunnlag sammenlignet pattedyr modeller¹. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har lenge vært brukt klinisk å vurdere menneskelige visuelle funksjon, og i laboratorium innstillingen å kvantifisere visjon i en rekke små og store arter inkludert gnagere og larver sebrafisk^{2,3 , 4 , 5}. oftest analysert ERG komponentene er en bølge og b-bølge, som stammer fra lys-sensing fotoreseptorer og bipolar interneurons, henholdsvis. I larver sebrafisk, forskjellige lag i netthinnen er etablert av 3 dager etter befruktning (dpf) og morfologi av photoreceptor membran terminal synapser modne før 4 dpf^6,7. Ytre retinal funksjon av larver sebrafisk er dermed etablert før 4 dpf, betyr at ERG er målbare fra denne tidlig alder og utover. På grunn av korte eksperimentelle syklusen og egenskapene høy gjennomstrømming for modellen, har ERG blitt brukt til larver sebrafisk funksjonelle vurdering av sykdom modeller, analysere fargen syn og retinal utvikling, studere visuelle døgnrytme og testing narkotika^8,9,10,11,12.

Gjeldende metoder for larver sebrafisk ERG har imidlertid noen kompleksiteten som kan gjøre det vanskeligere å adoptere. Publisert larver sebrafisk ERG protokoller bruker vanligvis glass brønnene fylt med ledende væske som opptak elektrode^3,4,5,13, som krever høy kvalitet brønnene tips³. Spesialisert utstyr, som en brønnene avtrekker og i noen tilfeller en microforge, kreves for TVer. Dette kan være en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser og fører til ekstra kostnader selv når tilpasse tilgjengelige liten dyr ERG systemer for måling av larver sebrafisk visuelle funksjon. Selv når glattet kan skarpe brønnene spissen skade overflaten av larver øyet. I tillegg, er kommersiell brønnene holdere for elektrofysiologi bygget med en fast sølv wire. Disse faste ledninger bli paddivert etter repeterende bruk krever kjøp av nye fører til økt vedlikeholdskostnader.

Her beskriver vi en ERG metoden ved hjelp av en kjegle-formet svamp-tip opptak elektrode, som er spesielt nyttig for å tilpasse etablerte liten-dyr ERG oppsett for larver sebrafisk ERG målinger. Elektroden gjøres enkelt ved hjelp av vanlige polyvinylacetat (PVA) svamp og fint sølv wire uten andre spesialiserte utstyr. Våre data viser at denne romanen elektrode sensitiv og pålitelig nok å demonstrere funksjonelle utviklingen av netthinnen nevrale kretser i larver sebrafisk mellom 4 og 7 dpf. Dette økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttig for forskerne å etablere nye ERG systemer eller endre eksisterende liten-dyr systemer for sebrafisk studier.

Protocol

Alle electroretinogram (ERG) prosedyrer ble utført i henhold til bestemmelsene i den australske National Health and Medical Research Council anbefaling for omsorg og bruk av dyr og ble godkjent av institusjonelle dyreetikk på den Universitetet i Melbourne. 1. buffer forberedelse Forberede 10 x gullfisk Ringer i bufferen (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukose, 100 mM HEPES) bruke omvendt osmose (RO) vann. Juster buffer til pH 7,8 og s…

Representative Results

Denne delen gir ERG målinger tatt daglig fra 4 til 7 dpf representant resultater. Fra 4 dpf viser ERG svar robust a – og b-bølge komponenter, som oppstår fra fotoreseptorer og bipolar celler, henholdsvis. I hver alder testet, amplituden til b-bølge økt med lav intensitet (figur 2; Figur 3). Spesielt følsomheten av larver sebrafisk netthinnen til dimmer blinker økt med alderen. A – og b-bølgen var ikke gjenkjennelig på intensiteter la…

Discussion

Funksjonell readouts som ERG har blitt stadig viktigere i suite av verktøy som brukes til å studere larver sebrafisk^8,9,12,14. På grunn av den lille størrelsen på larver sebrafisk øyet, har glass Mikropipetter blitt tilpasset som spiller inn elektrodene i mest publiserte protokoller^3,4,5,</s…

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings