Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

Abstract

O peixe-zebra (Danio rerio) é comumente usado como um modelo de vertebrados em estudos do desenvolvimento e é particularmente adequado para a neurociência visual. Para a medição funcional de desempenho visual, estudos de electroretinografia (ERG) é um método não-invasivo ideal, que tem sido bem estabelecido em espécies de vertebrados superiores. Esta abordagem é cada vez mais sendo usada para examinar a função visual no zebrafish, incluindo durante os estágios iniciais de desenvolvimento larvas. No entanto, o eletrodo de gravação mais comumente usados para larval zebrafish ERG até à data é o eléctrodo de micropipeta de vidro, que exige equipamentos especializados para sua fabricação, apresentando um desafio para os laboratórios com recursos limitados. Aqui, apresentamos um protocolo ERG zebrafish larval usando um eletrodo esponja-ponta cônica. O eléctrodo de romance é mais fácil fabricação e punho, mais econômico e menos susceptível de danificar o olho larval que a micropipeta de vidro. Como métodos ERG anteriormente publicados, o atual protocolo pode avaliar função da retina exterior através do fotoreceptor e respostas de célula bipolar, o a – e b-onda, respectivamente. O protocolo claramente pode ilustrar o refinamento da função visual ao longo do desenvolvimento precoce de larvas de peixe-zebra, apoiando o utilitário, sensibilidade e confiabilidade do eléctrodo romance. O eletrodo simplificado é particularmente útil quando estabelecer um novo sistema ERG ou modificação de aparelho ERG pequeno-animal existente para medição de zebrafish, auxiliando os pesquisadores em Neurociências visuais para usar o zebrafish do organismo modelo.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrados genético amplamente utilizado, incluindo estudos de Neurociências visuais. A crescente popularidade desta espécie pode ser atribuída ao vantagens, incluindo a facilidade de manipulação genética, o sistema de visual vertebrado altamente conservado (neurônio e tipos de morfologia anatômica e organização genética subjacente), alta fecundidade e menor custo de produção animal em comparação com modelos mamíferos¹. O electroretinogram não-invasiva (ERG) tem sido muito utilizado clinicamente para avaliar a função visual humana e na configuração de laboratório para quantificar a visão em uma variedade de espécies de grandes e pequenas, incluindo roedores e larval zebrafish^{2,3 , 4 , 5}. os componentes ERG mais comumente analisados são a uma onda e onda b, provenientes do sensor de luz fotorreceptores e interneurônios bipolares, respectivamente. No zebrafish larval, camadas distintas na retina são estabelecidas pela fertilização pós de 3 dias (dpf) e a morfologia do cone fotorreceptoras terminal sinapses maduro antes 4 dpf^6,7. Função da retina exterior de zebrafish larval é assim estabelecida antes dpf 4, significando que o ERG é mensurável nesta idade precoce em diante. Por causa do curto ciclo experimental e as propriedades de alto rendimento do modelo, o ERG foi aplicado ao larval zebrafish para avaliação funcional dos modelos da doença, analisando o desenvolvimento de visão e da retina de cor, estudando visual dos ritmos circadianos e teste de drogas^8,9,10,11,12.

No entanto, as abordagens atuais para zebrafish larval ERG tem algumas complexidades que podem dificultar a adoptar. Publicado zebrafish larval ERG protocolos geralmente usam uma micropipeta de vidro cheia com líquido condutor, como a gravação de eletrodo^3,4,5,13, que exige uma micropipeta de alta qualidade Dica³. Equipamentos especializados, tais como um puxador de micropipeta e em alguns casos, um microforge, são necessários para o seu fabrico. Isto pode ser um desafio para os laboratórios com recursos limitados e leva a custos extras, mesmo quando adapta disponíveis pequenos animais ERG sistemas para medição de função visual zebrafish larval. Mesmo quando alisado, a ponta afiada micropipeta pode danificar a superfície do olho larval. Além disso, micropipeta comercial os suportes para eletrofisiologia são construídos com um fio de prata fixo. Estas fixa os fios se tornam passivadas após uso repetitivo, exigindo a compra de novos titulares, levando a manutenção do aumento dos custos.

Aqui nós descrevemos um método de ERG usando um eletrodo gravação de esponja-ponta em forma de cone, que é particularmente útil para configurações ERG pequeno-animal estabelecidas para medições de ERG zebrafish larval a adaptação. O eletrodo é feito facilmente usando a esponja comum de acetato de polivinila (PVA) e fio de prata fino sem outros equipamentos especializados. Nossos dados mostram que este romance eletrodo é sensível e confiável o suficiente para demonstrar o desenvolvimento funcional de circuitos neurais da retina no zebrafish larval entre 4 e 7 dpf. O eletrodo de ponta em esponja econômico e prático pode ser útil para pesquisadores, o estabelecimento de novos sistemas ERG ou modificando os sistemas existentes de pequenos animais, para estudos de zebrafish.

Protocol

Electroretinogram (ERG) todos os procedimentos foram realizados de acordo com as disposições do código de prática para o cuidado da saúde nacional australiano e o Medical Research Council e o uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional na Universidade de Melbourne. 1. preparação buffer Preparar o 10x buffer de peixinho Ringer (1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10mm MgCl2, glicose de 100 mM, 100 mM HEPES) usando água de…

Representative Results

Esta seção fornece resultados representativos para medições de ERG tomadas diariamente de 4 a 7 dpf. De 4 dpf, ERG respostas show robustos componentes a e b-onda, que surgem de fotorreceptores e células bipolares, respectivamente. Em cada idade testada, a amplitude da onda-b aumentou com a intensidade de luz (Figura 2-; Figura 3). Notavelmente, a sensibilidade da retina larval zebrafish para flashes redutor aumentada com a idade. O a – e…

Discussion

Leituras funcionais como o ERG tornaram-se cada vez mais importantes na suíte de ferramentas usadas para estudar o zebrafish larval^8,9,12,14. Devido ao pequeno tamanho do olho zebrafish larval, micropipetas de vidro foram adaptadas como gravação eletrodos em protocolos mais publicado^{3,4,5,</sup…}

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings