Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Сравнительно запись в личиночной данио рерио, с помощью Роман конусообразной Губка наконечник электрода

doi: 10.3791/59487 Published: March 27, 2019

Summary

Здесь мы представляем протокол, который упрощает измерения света вызвали сравнительно ответов от личинок данио рерио. Роман конусообразной Губка наконечник электрода может помочь сделать изучение визуальной разработки в личиночной данио рерио, используя сравнительно Эрг проще для достижения надежных результатов и низкой стоимости.

Abstract

Данио рерио (Danio рерио) обычно используется как позвоночных модель развития исследований и особенно подходит для визуального нейронауки. Для функциональных измерений визуального исполнения Эрг (ЭРГ) является идеальным неинвазивный метод, который был хорошо установленных в высших позвоночных видов. Этот подход все чаще используется для изучения зрительной функции в данио рерио, в том числе на ранних стадиях развития личинок. Однако наиболее часто используемые записи электрод для личинок данио рерио Эрг на сегодняшний день является Стеклянный электрод микропипеткой, которая требует специализированного оборудования для его производства, бросая вызов для лабораторий с ограниченными ресурсами. Здесь мы представляем протокол Эрг личиночной данио рерио, используя конусообразные Губка наконечник электрода. Роман электрод легче производства и ручкой, более экономично и меньше шансов повредить личиночной глаз, чем микропипеткой стекла. Как ранее опубликованные Эрг методы текущий протокол может оценить внешней функции сетчатки через фоторецептор и биполярных клеток ответов, a - и b волны, соответственно. Протокол можно четко иллюстрируют уточнение зрительной функции на протяжении раннего развития личинок данио рерио, поддерживая Утилита, чувствительность и надежность Роман электрода. Упрощенная электрод особенно полезна при создании новой системы Эрг или модификации существующих малых животного ERG аппарат для измерения данио рерио, помогая исследователям в визуального нейронауки использовать данио рерио модели организма.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Данио рерио (Danio рерио) стала широко используемых генетических позвоночных модели, включая исследования визуального нейронауки. Растущая популярность этого вида можно объяснить преимущества, включая легкость генетической манипуляции, высоко сохранены позвоночных зрительной системы (нейрон типы, анатомические морфологии и организации и базовой генетики), высокая плодовитость и более низкая стоимость животноводства, по сравнению с млекопитающих модели1. Неинвазивная сравнительно (ЭРГ) уже давно клинически используется для оценки человеческой зрительной функции и в лабораторных условиях для количественного определения видения в ряде крупных и мелких видов, в том числе грызуны и личинок данио рерио2,3 , 4 , 5. наиболее часто анализируемого Эрг компоненты в волны и волны b, происходящих из светочувствительных фоторецепторы и биполярный интернейронов, соответственно. В личиночной данио рерио 3 дня после оплодотворения (dpf) устанавливаются различные слои в сетчатке и Морфология конуса фоторецепторных терминала синапсов Зрелые до 4 dpf6,7. Таким образом внешней сетчатки функции личиночной данио рерио устанавливается до 4 dpf, означает, что Эрг измеримые от этого раннего возраста начиная. Из-за короткий цикл экспериментальных и высок объём свойства модели Эрг был применен к личиночной данио рерио для функциональной оценки болезни моделей, анализ развития цвет видение и сетчатки, изучение визуального циркадные ритмы и тестирования препаратов8,9,10,,1112.

Однако нынешние подходы для личинок данио рерио Эрг имеет некоторые сложности, которые могут сделать это труднее принять. Опубликованные личиночной данио рерио Эрг протоколы обычно используют стекло микропипеткой, наполненный проводящие жидкости как запись электрод3,4,5,13, которое требует высокого качества микропипеткой подсказка3. Специализированное оборудование, например микропипеткой съемник и в некоторых случаях microforge, необходимых для их производства. Это может быть проблемой для лабораторий с ограниченными ресурсами и приводит к дополнительную плату даже при адаптации имеющихся небольших животных Эрг систем для измерения личиночной данио рерио зрительной функции. Даже когда сглаживаются, кончик острый микропипеткой может повредить поверхность личиночной глаза. Кроме того коммерческие микропипеткой Держатели для электрофизиологии построены с фиксированной серебряной проволокой. Эти несъемные провода стали пассивируется после повторного использования, требующих покупки новых держателей, ведущих к увеличению эксплуатационных расходов.

Здесь мы описываем метод Эрг, используя конусообразные Губка Совет запись электрода, что особенно полезно для адаптации установленных малых животных Эрг установок для личинок данио рерио Эрг измерений. Электрод легко производится с использованием общей Губка поливинилацетатные (ПВА) и тонкой серебряной проволоки без каких-либо другое специализированное оборудование. Наши данные показывают, что этот роман электрод является чувствительным и достаточно надежным, чтобы продемонстрировать функционального развития сетчатки нейронных цепей в личиночной данио рерио между 4 и 7 dpf. Это экономичный и практичный Губка наконечник электрода может быть полезным для исследователей, создания новых систем Эрг или модификации существующих систем малых животных, данио рерио исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все сравнительно (ЭРГ) процедуры выполнялись согласно положениям австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета кодекса практики для ухода и использования животных и были утверждены Комитетом по институциональной этики животных на Университет Мельбурна.

1. буфер подготовка

  1. Подготовка 10 x буфер Золотая рыбка Рингера (1,25 М NaCl, 26 мм KCl, 25 мм CaCl2, 10 мм MgCl2, глюкозы 100 мм, 100 мм HEPES) с использованием обратного осмоса (RO) воды. Настроить буфер рН 7,8 и стерилизовать буфер с помощью фильтра 0.22 мкм. Магазин 10 x буфер при 4 ° C как решение штока3.
    Примечание: 10 x буфер Рингера должны быть использованы в течение 3 месяцев.
  2. В день эксперимента сделайте 1 x Золотая рыбка звонаря буфера путем разбавления 10 x Золотая рыбка звонаря буфера с использованием обратного осмоса воды.
    Примечание: 1 x Золотая рыбка звонаря буфер используется для насыщения Губка PVA, включая Губка, используемые для размещения личиночной данио рерио и Губка на запись электрода.

2. электрод подготовка

  1. Подготовка записи электрода конусообразной Губка.
    1. Вырезать мужской конца от расширения свинца Платиновый электрод и удалить из конца 10 мм внешней политетрафторэтилена теплоизолирующего покрытия с использованием лезвием скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не повредить внутренний провод электродный свинца.
    2. Cut длиной 40 мм из серебряной проволоки (диаметром 0,3 мм) и надежно прикрепите это электрод свинца, дизайне которого гармонично сплетаются Серебряная проволока подвергается внутренней проволокой. Накрыть совместное использование изолента, оставляя ~ 15 мм длиной Серебряная проволока подвергается (рис. 1A).
    3. Гальваническим подвергаются серебряной проволоки с хлорид, с использованием источника 9 В постоянного тока для 60 s для улучшения сигнала проводимости. Погрузите кончик воздействию серебра в нормальное saline и подключите другой конец к положительной клемме аккумулятора. Подключите другой провод чтобы отрицательный вывод аккумулятора и погружать на другом конце провода в солевой2.
      Примечание: Кроме того хлорирование серебряной проволоки, впитывая его на 1 час в раствор отбеливателя (Гипохлорит натрия активного ингредиента 42 г/Л).
    4. Вырежьте квадрат ПВА ~ 20 мм х 20 мм Губка ножницами сделать конус (рис. 1A). Пропитать губку с помощью 1 x Рингера буфера. Под микроскопом с линейки на окуляр используйте лезвие скальпеля для формирования вершины конуса диаметром ~ 40 мкм. Воздух сухой конусообразной губкой на абсорбирующий бумаги до тех пор, пока это твердый.
      Примечание: Губка PVA значительно расширяется, когда насыщенный, таким образом, важно, что впервые губка насыщена с физиологического раствора до формирования вершины конуса.
    5. После chloriding воздух сухой серебряной проволоки на поглощающей ткани на 5 мин Вставка серебряной проволоки в высушенный, твердые, конусообразные Губка PVA через основание конуса. Изолируйте любой избыток подвергаются металла, с помощью маски ленты для уменьшения фотоэлектрических артефакты (Рис. 1B-C).
      Примечание: После каждой экспериментальной сессии Удалите губкой из серебряной проволоки. Промойте губку с использованием обратного осмоса вода и воздух сухой для повторного использования. Для обеспечения оптимального сигнала коллекции, рекомендуется однократное использование серебряной проволокой. ПВА губки должен быть повторно не более 5 раз.
    6. В день эксперимента погрузиться кончик губки записи электрод 1 x буфер Рингера для по крайней мере 15 минут, чтобы полностью пропитать губку.
  2. Подготовьте Справочник электродов, как описано выше, но не подключая кончик губки.
  3. Получите землю электрода коммерчески.

3. данио рерио подготовка

  1. Темный адаптировать данио рерио личинок на ночь (> 8 h) до записи, поместив данио рерио в 15 мл (< 20 личинок в трубку) завернуты в фольгу в темной инкубатора. Снимите крышку для обеспечения адекватной кислорода.
  2. В день записи затяните крышку на трубу Сокол, завернутые в фольгу, содержащие личинки и убедитесь, что трубка свет доказательство. Транспортные личинок в лабораторию Эрг.
  3. Залейте рыбу в Петри в темноте с помощью тусклый красный освещения от светоизлучающих диодов (СИД; 17,4 cd.m-2, λМакс 600 Нм). Обложка Петри с помощью света доказательство полотенца для сведения к минимуму воздействия света.

4. Губка платформы Подготовка

  1. Вырежьте прямоугольник сухой Губка PVA плотно в 35 мм Петри. Убедитесь, что толщина губка должна быть примерно равна глубине Петри.
  2. Сделайте небольшой надрез вертикально через один конец Губка для размещения серебряной проволоки электрод сравнения.
  3. Замочите губки ПВА 1 x Золотая рыбка звонаря буфера до насыщения. Затем место губки в чашке Петри чистой 35-мм. Используйте бумажную салфетку, чтобы поглотить дополнительную жидкость до тех пор, пока решение не излучает из губки в ответ на нажатие света палец.

5. животных и позиционирование электрода

  1. Анестезировать личинки, с помощью tricaine 0,02%, разводят в 1 x Золотая рыбка звонаря буфера.
  2. Используйте 3 мл пипетка Пастера для передачи наркотизированных личинка на площади бумажное полотенце (2~ 3 см).
  3. Поместите бумажное полотенце, содержащие личинки на платформе влажной губкой, используя пинцет. Позволяет регулировать положение личинка тонкой кистью, смоченной в буфере Рингера. Убедитесь, что это один глаз смотрело вверх, изолированных от близлежащих жидкость на площади бумажное полотенце под личинка.
  4. Глазурь личиночной тела, за исключением головы, с увлажняющий гель для глаз держать личинка влажные во время записи Эрг.
  5. Расположите Петри с губкой платформы на небольшой платформе с подогревом воды перед Ganzfeld шар света стимул, расположенный внутри клетки Фарадея (рис. 1 d).
    Примечание: Поддержание температуры Губка и личинок тела обеспечивает стабильные сигналы Эрг.
  6. Вставьте ссылку электрода в разруба в платформе губки (рис. 1 d).
  7. Подключите электрод коммерчески полученные земли в клетку Фарадея.
  8. Приложите электрод записи держатель электрода и зафиксируйте держатель для стереотаксического руку микроманипулятор (рис. 1 d). Используйте 3 мл пипетка Пастера закапать капли 1 x раствор Рингера на кончик губки для повторного насыщенности электрода.
  9. Поместите микроскоп в клетку Фарадея Эрг платформу для размещения электрода.
    Примечание: Освещенность должна обеспечиваться тусклый красный светодиод (17,4 cd.m-2, λМакс 600 Нм) чтобы разрешить наблюдение личинка и размещения активного электрода, сохраняя dark-adaptation.
  10. Отрегулируйте положение Губка платформы позволяют наблюдения личинка под микроскопом. Затем используйте поглощающей ткани для удаления лишней жидкости из губки электрода.
  11. Установите активный электрод, таким образом, чтобы он нежно трогает Центральной поверхности роговицы глаза личиночной данио рерио (Рисунок 1E).
  12. Переместить чашу Ganzfeld к платформе Губка и убедитесь, что личинка покрыта чаши.
  13. Закройте клетку Фарадея для уменьшения посторонних электромагнитных помех.

6. сравнительно запись

  1. Используйте компьютер программное обеспечение конкретной системы Эрг (см. таблицу материалов для деталей) для показа стимул и сбора данных на основе параметров рекомендуется ниже2.
    1. Задайте частоту выборки системы до 4 кГц над 650 ms записи окна (2560 точек) в приобретении программного обеспечения.
    2. Настроить усиление системы до 1000 ×.
    3. Полосовой фильтр системы 1 – 300 Гц установите.
    4. Используйте узкополосный режекторный фильтр для уменьшения 60 Гц (или 50 Гц, в зависимости от местных коммунальных частоты) шум.
      Примечание: Идеальный уровень шума уровень должен быть не более, чем ±10 мкВ.
  2. Начать сбор данных, с помощью описанной ниже процедуры.
    1. Используйте один тест flash (0,06 журнала cd.s/m2) для измерения тест ответ от глаз, чтобы оценить положение электродов.
      Примечание: Этот интенсивности вспышки испытания должно привести к амплитуда волны b, больше чем 25 мкВ в 4-dpf личинки. Если надежный ответ не может быть измерена, затем переместите электродов и другой тест вспышки для подтверждения, что электроды хорошо расположены.
    2. После тест flash, позволяют животное в темноте адаптировать 3 мин в полной темноте до записи.
    3. Настоящее время мигает с диммером ярче света.
    4. Средняя сигналы через повторяется в зависимости от уровня сигнала к шуму.
      Примечание: Как правило в среднем больше сигналов на уровне тусклее светло (не менее 3 повторяет) и меньше на уровне ярче света (обычно 1 повтор). Постепенно удлиняют интервал между стимул от 10 до 60 s от тёмной для яркой освещенности. Образец протокола приводится в таблице 1.
    5. После записи гуманно убить личинок, используя tricaine 0,1%.

7. анализ

  1. Измерения амплитуды в волны от базовой линии до отрицательных корыта-волны и b волны амплитуда от негативных корыта-волна на пик положительных b волны.
  2. Измерьте a - и b волны неявные раз от начала стимула корыта в волны и пик волны b, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот раздел предоставляет представителя результаты для Эрг измерений ежедневно от 4 до 7 dpf. От 4 dpf Эрг ответы свидетельствуют надежные компоненты a - и b волны, которые возникают от фоторецепторных клеток и биполярных клеток, соответственно. В каждом возрасте протестированы амплитуда волны b увеличилось с интенсивности света (рис. 2; Рисунок 3). В частности чувствительности личиночной данио рерио сетчатки для диммера вспышки увеличивается с возрастом. A - и b волны не были узнаваемы в интенсивности меньше -1.61 журнала cd.s/m2 на 4 dpf, тогда как четкие сигналы были обнаруживаемыми на эти интенсивности для старшего возраста личинок (рис. 2). B волны ответ существенно вырос между 4 и 5 dpf (P < 0,0001; Рисунок 2A -B; Рисунок 3B). Хотя b волны на нижней интенсивности показали мало изменений между 5 и 7 dpf, сигнал на 2,48 журнала cd.s/m2 был больше на 7 dpf, по сравнению с 5 и 6 dpf (P < 0,0001; Рисунок 2; Рисунок 3B). A - и b волны неявные раз стал значительно быстрее после 5 dpf (P < 0,0001; Рисунок 3 c -D). В целом эти результаты демонстрируют созревания данио рерио сетчатки функции между от 4 до 7 dpf. Интересно, что амплитуда-волна появился уменьшить от 5 до 7 dpf (рис. 3A). Это может быть потому, что созревание синаптических связей в наружной сетчатки сокращает задержку ответов биполярных клеток, что приводит к быстрее начала волны b, что маски-волна. Желающие учиться в волны могут использовать медикаментозное лечение для блока после photoreceptoral ответов (т.е. компонент b волны).

Figure 1
Рисунок 1: данио рерио G anzfeld Эрг, создана с конусообразной Губка наконечник электрода. (A) конусообразной Губка наконечник и хлорированные Серебряный электрод, воздушная сушка перед построением Губка наконечник электрода. (B-C) Впоследствии хлорированные Серебряная проволока вставляется в конус Губка через базу для формирования полного электрода. (D) в типичных личинок данио рерио установки Ganzfeld Эрг, электрод сравнения вставляется в платформе Губка и личинка данио рерио покрыта чаша Ganzfeld. (E) Губка наконечник электрода нежно трогает Центральной поверхности роговицы глаза личинок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель средняя Эрг следы одичал тип личиночной данио рерио. Средняя Эрг следы данио рерио wildtype на (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7) и (D) 7 dpf (n = 9). Ответы были вызвало использование вспышки от белых светодиодов. В каждом возрасте, следы показывают ответы на вспышки (снизу вверх) -2.75,-2.11, -1.61, -0.81, 0,06, 0,72, 1.55, 1,89, 2.18, 2,48 журнала cd.s/m2. Шкалы бар = 50 мкВ. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: a - и b волны амплитуды Эрг и неявные раз для 4-7 dpf данио рерио. (A) Группа среднем (± Среднеквадратичная ошибка среднего значения)-волна амплитуды увеличилась с интенсивности вспышки, но снизилась с возрастом в 4 – 7 dpf личинки. Амплитуда средняя b волны (B) в 4-7 dpf личинки увеличилась с интенсивности вспышки; амплитуда вырос между 4 и 5 dpf. (C) средний a волны неявные и (D) средняя b волны неявное время стал быстрее между dpf 5, 6 и 7. Линии наилучшего являются производными от нелинейной регрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Интенсивность света стимул (журнал cd.s.m-2) Количество повторов Интервал между стимулом (s)
-2.75 3-6 10
(30 s до следующего)
-2.11 3-6 10
(30 s до следующего)
-1.61 3-6 10
(30 s до следующего)
-0.81 3-6 10
(60 s до следующего)
0,06 3-6 10
(60 s до следующего)
0,72 1-3 60
1.55 1-3 60
1.89 1-3 60
2.18 1-3 60
2.48 1-3 60

Таблица 1: Пример протокол записей Эрг. Презентаций стимул начать тёмной (сверху) и прогресс ярче света уровней (внизу), с постепенно больше между стимулом интервалы для обеспечения что темный адаптация поддерживается. Количество сигналов, в среднем на каждом интенсивность зависит от уровня сигнала к шуму.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Функциональные устройства индикации как Эрг стали все более важное значение в набор инструментов, используемых для изучения личиночной данио рерио8,9,12,14. Из-за небольшого размера глаза личиночной данио рерио стекло micropipettes была адаптирована как запись электродов в наиболее опубликованные протоколы3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. здесь мы описываем личиночной данио рерио Эрг протокол, с помощью простой конусообразной Губка наконечник электрода. Роман электрод может использоваться для изменения стандартных систем Эрг малых животных для измерения личиночной данио рерио сетчатки функции без какого-либо дополнительного оборудования. Материалы для изготовления губки наконечник электрода, просто коммерческих Губка PVA и 0,3 мм Серебряная проволока, которая делает это более экономичным, чем предыдущих подходов. Еще одним преимуществом является, что, в отличие от кончика твердые и острые микропипеткой, мягкие губки электрода меньше шансов повредить личиночной глаз. Наконец Губка PVA помогает сохранить влагу в личиночной глаза во время записи.

Ключом к успешному применению Губка наконечник электрода — обеспечить полное насыщение губки. Обычно это занимает не менее 15 минут замачивания в 1 x Золотая рыбка звонаря буфера. Неполные насыщение Губка может увеличить уровень шума благодаря быстрее сушки электрода. Для лучшего сигнала коллекции, делая новые электроды для каждой экспериментальной сессии (обычно < 8 h) настоятельно рекомендуется. Повторное использование может привести к снижение ЭРГ сигналов, затрудняет сопоставление между сессиями.

При позиционировании личиночной данио рерио на платформу Губка, необходимо позаботиться для обеспечения не глаз, чтобы быть измерены при контакте с любой окружающий раствор или бумажное полотенце под рыбу. Такой контакт шорты электрической цепи, как электрод сравнения внедрен в платформе Губка и уменьшает Эрг.

Даже с хорошо насыщенный электрод Губка советы постепенно высыхание происходит, который проявляется как повышенный шум в Эрг сигналов. Это должно произойти, закапать капли 1 x Золотая рыбка Рингера в основание конуса с использованием 1 мл шприц и игла 30 G x ½". Если добавить, что решение кончик губки не снижает уровень шума, проверьте, что глаз не находится в контакте с окружающей жидкости и убедитесь, что электрода центрируется на вершине роговицы.

Записи в результатах представитель сообщил здесь были сделаны с параметром полосовой 1 – 300 Гц, которая не допускает выборки колебательной потенциалов (OP) — вейвлеты на b волны производным от сетчатки нейроны третьего порядка включая Амакриновые и ганглий клетки 15,16,17. Более высокое значение нижних частот (например, 500 или 1000 Гц) может быть лучше подходит для OP записи.

В целом конусообразные Губка наконечник электрода помогает упростить личиночной данио рерио Эрг записи с существующими системами Эрг малых животных, обеспечивая надежные результаты. Представитель результаты показывают, что амплитуды Эрг растет между 4 и 5 dpf, с дальнейшего созревания между 5 и 7 dpf проявляется как быстрее неявные раз. Наш простой протокол Эрг с экономичным и практичным конусообразной Губка наконечник электрода может принести пользу следователей, изучая данио рерио сетчатки функции. Этот метод также может быть адаптирована для оценки взрослых рыбок данио или других позвоночных модели с маленькими глазами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия информации, имеющих отношение к этой работе.

Acknowledgments

Финансирование этого проекта была оказана грант от Мельбурнский Институт неврологии (PTG, PRJ и BVB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1 mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30 G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Ko?nigshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. Academic Press. 143-151 (2018).
  2. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. e54158 (2016).
  3. Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
  4. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 57-68 (2002).
  5. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
  6. Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56, (3), 222-236 (2003).
  7. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72, (3), 302-327 (2012).
  8. Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16, (5), 881-888 (1999).
  9. Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3, (6), e201703000003 (2017).
  10. Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. dmm. 035220 (2018).
  11. Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11, (2), 995-1003 (2015).
  12. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010).
  13. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135, (1-2), 205-210 (2004).
  14. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222, (4), 564-570 (2001).
  15. Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87, (5), 459-466 (2008).
  16. Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104, (1), 17-36 (2002).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555, (1), 153-173 (2004).
Сравнительно запись в личиночной данио рерио, с помощью Роман конусообразной Губка наконечник электрода
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).More

Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter