Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.
Abstract
El pez cebra (Danio rerio) es comúnmente usado como un modelo vertebrado en estudios del desarrollo y es particularmente conveniente para Neurociencia visual. Para la medición funcional de rendimiento visual, electroretinografía (ERG) es un método no invasivo ideal, que se ha establecido en especies de vertebrados superiores. Este enfoque se está utilizando cada vez más para examinar la función visual en el pez cebra, incluso durante las primeras etapas del desarrollo larvarias. Sin embargo, el electrodo de la grabación más comúnmente utilizado para larval pez cebra ERG hasta la fecha es el electrodo de la micropipeta de vidrio, que requiere equipo especializado para su fabricación, que presenta un desafío para los laboratorios con limitados recursos. Aquí, presentamos un protocolo ERG de larvas de pez cebra con un electrodo de punta de esponja en forma de cono. El nuevo electrodo es más fácil de fabricación y la manija, más económica y menos propensas a dañar el ojo larval de la micropipeta de vidrio. Como métodos previamente publicados de ERG, el protocolo actual puede evaluar la función retiniana externa a través de fotorreceptores y células bipolares respuestas, el a – y b-agita, respectivamente. El protocolo puede ilustrar claramente el perfeccionamiento de la función visual durante el desarrollo temprano de las larvas de pez cebra, apoyando la utilidad, sensibilidad y fiabilidad del electrodo nuevo. El electrodo simplificado es particularmente útil al establecer un nuevo sistema ERG o modificar aparatos ERG pequeño animal existentes para la medida del pez cebra, ayudando a los investigadores de la neurociencia visual con el pez cebra modelo de organismo.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo ampliamente utilizado vertebrado genético, incluidos los estudios de la neurociencia visual. La creciente popularidad de esta especie puede ser atribuida a ventajas como la facilidad de manipulación genética, el sistema visual vertebrado altamente conservado (tipos de neurona anatomía morfología y organización y genética subyacente), la alta fecundidad y un menor coste de explotación en comparación con modelos mamíferos1. El no invasiva electroretinograma (ERGIO) ha sido utilizado clínicamente para evaluar la función visual humana y en el entorno de laboratorio para cuantificar la visión en una gama de grandes y pequeñas especies como roedores y larvas de pez cebra2,3 , 4 , 5. los componentes ERG más comúnmente analizados son la b-onda, originarios de fotorreceptores sensibles a la luz los interneurons bipolares, respectivamente y una onda. En el pez cebra larval, se establecen distintas capas en la retina por la fertilización después de 3 días (PD) y la morfología del cono fotorreceptores terminal sinapsis madura antes 4 PD6,7. Función retiniana externa del pez cebra larval es establecida antes PD 4, lo que significa que el ERG es medible desde esta temprana edad a partir. Debido al corto ciclo experimental y las propiedades de alto rendimiento del modelo, el ERG se ha aplicado a larvas peces cebra para evaluación funcional de modelos de la enfermedad, análisis de desarrollo de visión y retina de color, estudio de ritmos circadianos visuales y las pruebas de drogas8,9,10,11,12.
Sin embargo, enfoques actuales de pez cebra larvas ERG tiene algunas complejidades que pueden hacer más difícil de adoptar. Pez cebra larvas publicado ERG protocolos suelen utilizan una micropipeta de vidrio llenada de líquido conductor como la grabación de electrodo3,4,5,13, que requiere de una micropipeta de alta calidad Consejo3. Equipo especializado, como un tirador de la micropipeta y en algunos casos a microforge, se requieren para su fabricación. Esto puede ser un desafío para los laboratorios con limitados recursos y conduce a costos adicionales incluso cuando la adaptación de los sistemas ERG animales pequeños disponibles para la medición de la función visual de larvas de pez cebra. Incluso cuando alisó, la punta de la micropipeta fuerte puede dañar la superficie de las larvas. Además, los titulares comercial micropipeta para electrofisiología se construyen con un alambre de plata fijado. Estos fijos los cables a ser apaciguados después de uso repetitivo, que requiere la compra de nuevos titulares a los costos de mantenimiento mayor.
Aquí describimos un método ERG usando un electrodo de la grabación de punta de esponja en forma de cono, que es particularmente útil para la adaptación establecidos pequeños animales ERG configuraciones para larvas de pez cebra ERG medidas. El electrodo se hace fácilmente usando esponja de acetato de polivinilo (PVA) común y fino hilo de plata sin necesidad de otros equipos especializado. Nuestros datos muestran que este nuevo electrodo es sensible y lo suficientemente confiable para demostrar el desarrollo funcional de circuitos neuronales retinianos en el pez cebra de larvas entre 4 y 7 PD. Este electrodo de punta de esponja económico y práctico puede ser útil a los investigadores establecer nuevos sistemas ERG o modificación de sistemas existentes de pequeños animales, estudios de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lecturas funcionales como el ERG se han vuelto cada vez más importantes en la suite de herramientas que se utilizan para el estudio de larvas de pez cebra8,9,12,14. Debido al pequeño tamaño del ojo de larvas de pez cebra, Micropipetas de vidrio se han adaptado como electrodos de grabación en más publicados protocolos3,4,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamiento para este proyecto fue proveído por una beca del Instituto de Neurociencia de Melbourne (a PTG, PRJ & BVB).
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. . Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
