Målet med denne protokollen er å beskrive en ny brystkreft modellering tilnærming basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus inn mus melkekjertler. Denne tilnærmingen gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte.
Brystkreft er en heterogen sykdom, muligens på grunn av komplekse interaksjoner mellom ulike celler av opprinnelse og kreftfremkallende hendelser. Musemodeller er medvirkende til å få innsikt i disse komplekse prosessene. Selv om mange musemodeller har blitt utviklet for å studere bidrag av ulike kreftfremkallende hendelser og Opprinnelses celler til bryst tumorigenesis, er disse modellene ofte ikke celle-type eller organ spesifikk eller kan ikke indusere initiering av bryst tumorigenesis i en midlertidig kontrollert måte. Her beskriver vi en protokoll for å generere en ny type brystkreft mus modeller basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus (ad-grobunn) i mus melkekjertler (MGs). På grunn av direkte injeksjon av ad-grobunn i melke kanaler, denne tilnærmingen er MG spesifikk, uten uønsket kreft induksjon i andre organer. Den intraductal injeksjon prosedyren kan utføres i mus på ulike stadier av deres MG utvikling (dermed tillater det Temporal kontroll av kreft induksjon, fra ~ 3-4 ukers alder). Den celle-type spesifisitet kan oppnås ved å bruke ulike celle-type-spesifikke arrangører til å drive grobunn uttrykk i adenoviral vektor. Vi viser at luminal og basal melke epitelceller (MECs) kan være tett målrettet for grobunn/loxP-basert genetisk manipulasjon via en intraductal injeksjon av ad-grobunn under kontroll av keratin 8 eller keratin 5 promoter, henholdsvis. Ved å innlemme en betinget grobunn reporter (f. eks grobunn/loxP-induserbart Rosa26-YFP reporter), viser vi at MECs målrettet av ad-grobunn, og tumorceller avledet fra dem, kan spores ved å følge reporter-positive celler etter intraductal injeksjon.
Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en ny brystkreft modellering tilnærming basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MG. Den grobunn/loxP rekombinasjon genetiske tilnærmingen har vært mye brukt til å modellere menneskelig brystkreft hos mus. Den første generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller er generert ved hjelp av grobunn-uttrykker transgene mus under kontroll av MEC-spesifikke arrangører (f. eks MMTV-grobunn for luminal MECs og en del av basal MECs, WAP-grobunn og Blg-grobunn for luminal forfedre og alveolære Luminal MECs, K14-grobunn for basal og en del av luminal MECs1,2,3,4,5)6, 7 andre er , 8 på alle , 9. men selv om disse grobunn transgene Lines muliggjør romlig kontroll av grobunn uttrykk (dvs. i ulike delsett av MECs), de ikke tillater timelig kontroll av grobunn uttrykk og grobunn/loxP-mediert genetisk manipulasjon. Den andre generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller benytte induserbart grobunn aktivitet/uttrykk tilnærminger (f. eks bruk av grobunn-østrogen reseptor fusjon [CreER], som bare kan indusere grobunn/loxP rekombinasjon ved administrering av Tamoxifen), og som et resultat, disse genetiske verktøyene tillater både romlige og timelige kontroller av aktiveringen av kreftfremkallende hendelser i MECs (f. eks, K8-CreER-og K5-CreER-baserte modeller)10,11,12 . I begge generasjoner av brystkreft mus modeller, som arrangører brukes til å drive grobunn eller CreER uttrykk (f. eks Krt8, Krt5) kan også være aktiv i epitelceller i andre organer (dvs. de er celle-type-spesifikke, men ikke organ-spesifikk) eller har en lekk uttrykk i celletyper enn epitelceller (f. eks, MMTV, som har Leaky aktivitet i benmarg blodkreft celler), kan disse tilnærmingene føre til utvikling av uønsket kreft (s) i andre organ (s). Hvis disse uventede kreft forårsaker dødelighet i de berørte mus, det opprinnelige formålet med modellering brystkreft i disse musene kan være forbudt (f. eks, MMTV-grobunn-drevet kreftfremkallende hendelser kan føre til blodkreft ondartet og tidlig død av mus , på grunn av leakiness av MMTV arrangøren i blodkreft celler)4.
Her rapporterer vi en brystkreft modellering tilnærming i mus som gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte. Denne tilnærmingen er basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MGs (og er dermed organ-spesifikke). Grobunn uttrykket kan styres ved hjelp av ulike MEC pasientpopulasjonen-spesifikke arrangører innebygd i adenoviral vektor (f. eks Krt8 for luminal MECs, Krt5 for basal MECs, og dermed oppnå Cell-type spesifisitet). Kreft induksjon i MGs kan være timelig styrt av en injeksjon av ad-grobunn i mus på ulike aldre, fra 3-4 ukers alder (pubertale) til voksen scenen.
Suksessen til denne tilnærmingen for inducing melke svulster fra ulike subpopulasjoner av MECs stoler ikke bare på å velge riktig celle-type-spesifikke arrangører (for å drive grobunn uttrykk), men også på intraductal injeksjon prosedyren selv. Ideen bak denne tilnærmingen er at injisert ad-grobunn virus beholdes i ductal treet, som er en skjult struktur med lumen, og derfor bare MECs er eksponert for virus og er infisert av ad-grobunn. På grunn av den begrensede lumen i melke kanalene, er det viktig å bare inj…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) stipend R01 CA222560 og ved Department of Defense gjennombrudd Award W81XWH-18-1-0037.
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |