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Neuroscience

माउस मस्तिष्क स्लाइस में लंबी-रेंज इनपुट के Optogenetic उत्तेजना के लिए Vivo Intracerebral Stereotaxic इंजेक्शन में

doi: 10.3791/59534 Published: September 20, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में optogenetic उत्तेजनाओं का उपयोग कर दूर मस्तिष्क क्षेत्रों से लंबी दूरी की आदानों की सेल प्रकार विशिष्ट कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पहचान करने के लिए तरीकों का एक सेट का वर्णन करता है.

Abstract

सेल प्रकार विशिष्ट synaptic कनेक्टिविटी का ज्ञान मस्तिष्क चौड़ा न्यूरॉन सर्किट को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. लंबी दूरी के कनेक्शन के कार्यात्मक जांच की पहचान दूर आदानों की विशिष्ट उत्तेजना के साथ संयुक्त एकल न्यूरॉन्स के लक्षित रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है. यह अक्सर पारंपरिक और विद्युत उत्तेजना तकनीकों के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, क्योंकि अपस्ट्रीम मस्तिष्क क्षेत्रों converging से axons लक्ष्य क्षेत्र में intermingle हो सकता है. प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनलों के वायरस-मध्यस्थ अभिव्यक्ति के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण प्रकाश के साथ उस क्षेत्र से उत्पन्न axons के चयनात्मक उत्तेजना की अनुमति देता है. इंट्रासेरेब्रल स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग अच्छी तरह से सीमांकित संरचनाओं में किया जा सकता है, जैसे कि मस्तिष्क में अन्य subcortical या cortical क्षेत्रों के अलावा, पूर्वकाल थैलेमिक नाभिक।

यहाँ वर्णित वायरल वैक्टर के सटीक stereotaxic इंजेक्शन के लिए तकनीक का एक सेट है माउस मस्तिष्क में channelrhodopsin व्यक्त, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में एक्सॉन टर्मिनलों के photostimulation द्वारा पीछा किया. इन प्रोटोकॉल सरल और व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. एक postsynaptically जुड़े न्यूरॉन से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में, axons के photostimulation कार्यात्मक synaptic कनेक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, औषधीय लक्षणीकरण, और उनकी ताकत का मूल्यांकन. इसके अलावा, दर्ज न्यूरॉन के biocytin भरने postynaptic न्यूरॉन के पोस्ट-हॉक रूपात्मक पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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तंत्रिका परिपथों को समझने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच संपर्क को परिभाषित करना आवश्यक है। शास्त्रीय शारीरिक अनुरेखण विधियों से अंतरक्षेत्रीय संपर्क स्थापित करने की अनुमति मिलजाती है, और घाव अध्ययन सूचना प्रवाह के पदानुक्रमिक संगठन को समझने में मदद करते हैं। उदाहरण के लिए, स्थानिक अभिविन्यास और सिर दिशा संकेतन के लिए मस्तिष्क सर्किट presubiculum करने के लिए thalamus से जानकारी के दिशात्मक प्रवाह शामिल है. यह एन्टेरो-डोर्सल थैलेमिक नाभिक (एडीएन) के घाव अध्ययनों द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो डाउनस्ट्रीम पृष्ठीय पूर्वउपिकुलम में सिर की दिशा संकेत को नीचा दिखाते हैं, साथ ही पैराहिप्पोकैम्पल ग्रिड सेल संकेत1,2.

मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी एक सेलुलर और subcellular स्तर पर स्थापित करने के लिए और अधिक कठिन है. हिप्पोकैम्पस में, एक अत्यधिक संगठित शरीर रचना विज्ञान टुकड़ा तैयारी में बिजली के अनुकरण का उपयोग कर पथ-विशिष्ट synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए अनुमति देता है। उत्तेजना इलेक्ट्रोड CA1 के स्तर radiatum में रखा विशेष रूप से CA33से Schaffer संपार्श्विक इनपुट को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CA1 के स्तर lacunosum आणविक में रखा इलेक्ट्रोड उत्तेजक CA14के लिए छिद्रक पथ इनपुट सक्रिय हो जाएगा,5. विद्युत उत्तेजना एक्सॉन टर्मिनलों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को सक्रिय करता है; हालांकि, यह उत्तेजना साइट के पास somata के साथ न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारित होने के axons सक्रिय करता है. यह इसलिए परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों से afferents का अध्ययन करने के लिए सीमित उपयोग की है जब मूल के विभिन्न क्षेत्रों के फाइबर लक्ष्य संरचना में intermingle, के रूप में आम तौर पर neocortex में मामला है.

न्यूरॉन्स भी प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है. ऑप्टिकल तरीकों में बंदी ग्लूटामेट की फोटो सक्रियण शामिल है, जिसे एक या दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। एकाधिक बारीकी से अंतरिक्ष साइटों क्रमिक रूप से प्रेरित किया जा सकता है, ऊतक के लिए कोई यांत्रिक क्षति के साथ6. यह सफलतापूर्वक synaptic रिसेप्टर्स नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और साथ ही व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को सक्रिय7. जबकि ग्लूटामेट uncaging स्थानीय सर्किट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह लंबी दूरी की आदानों के विशिष्ट सक्रियण के लिए अनुमति नहीं है.

न्यूरोनल सर्किट में लंबी दूरी की कनेक्टिविटी की जांच के लिए पसंद की एक विधि वायरस मध्यस्थता चैनलहोडोप्सिन अभिव्यक्ति का उपयोग है। यहाँ वर्णित के रूप में विवो stereotaxic इंजेक्शन में प्रयोग, प्रकाश gated आयन चैनलों की अभिव्यक्ति को लक्षित किया जा सकता है और स्थानिक रूप से एक वांछित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित. इस तरह, चैनलहोडोप्सिन एक क्षेत्र से अपने लक्ष्य के लिए उत्तेजक या निरोधात्मक कनेक्टिविटी मानचित्रण के लिए प्रभावी रहे हैं। Transfected axons टर्मिनलों एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है, और पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के रूप में एक पढ़ने के बाहर कार्यों और मस्तिष्क में विशिष्ट सर्किट घटकों की ताकत की परीक्षा की अनुमति8. किसी विषाणु के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के साथ संयोजित ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण अभूतपूर्व विशिष्टता और आनुवंशिक नियंत्रण 9 प्रदान करताहै. इसके अतिरिक्त प्रकाश के साथ उत्तेजक दोनों उच्च लौकिक और स्थानिक परिशुद्धता के लिए अनुमति देता है10,11.

पूर्वाश्म हिप्पोकैम्पस के संक्रमण पर एक छह परतदार कॉर्टिकल संरचना है और पैरा-हिप्पोकैम्पस गठन12,13. यह ADN11 से महत्वपूर्ण synaptic इनपुट प्राप्त करता है लेकिन यह भी कई अन्य cortical और subcortical क्षेत्रों से14. इस प्रकार, एक presubicular टुकड़ा के भीतर thalamic एक्सॉन टर्मिनलों के चयनात्मक उत्तेजना बिजली की उत्तेजना और न ही ग्लूटामेट uncaging के साथ संभव नहीं है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रकाश gated चैनलों को व्यक्त वायरल वैक्टर इंजेक्शन के सटीक स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग कर मस्तिष्क क्षेत्रों (एडीएन और presubiculum) के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए तरीके हैं। इसके अलावा वर्णित अपने लक्ष्य क्षेत्र में न्यूरॉन्स पेश करने के axons टर्मिनलों के photostimulation है, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में पोस्ट synaptic न्यूरॉन्स के पूरे सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के साथ युग्मित.

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Protocol

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सभी प्रक्रियाओं यूरोपीय समुदाय परिषद के निदेशक (2010/63/EU) के अनुसार प्रदर्शन किया और पेरिस Descartes विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रयोगकर्ता को स्थानीय नियमों का अनुपालन करने के लिए प्रक्रिया के लिए प्राधिकरण प्राप्त करना होगा.

1. प्रयोग की योजना

  1. लक्षित किया जा करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्र को परिभाषित करें. माउस ब्रेन एटलस15की सहायता से इंजेक्शन स्थल के स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांकों का निर्धारण करें। सही एन्टेरो-डोर्सल थैलेमिक नाभिक (एडीएन) के लिए निर्देशांक हैं: -0.82 पश्च, 0ण्75 पार्श्व, -3.2 गहराई (मिमी) ब्रीग्मा के सापेक्ष। निर्देशांक अलग अलग उम्र, लिंग, या तनाव के जानवरों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. एक फ्लोरोसेंट अनुरेखक (150 से 300 nL) एक पायलट प्रयोग में एक epifluorscence माइक्रोस्कोप के साथ प्रेक्षणीय इंजेक्शन द्वारा निर्देशांकों की सटीकता की पुष्टि करें और दस्तावेज़ (चित्र 1ए,बी).।
  3. इंजेक्शन होने के लिए वायरस के प्रकार को परिभाषित करें। निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर 6 डिग्री एल एलिकोट्स में वायरस को स्टोर करें। एक दिन में एक से छह जानवरों के इंजेक्शन के लिए, सर्जरी के कमरे में बर्फ पर रखा 1 alicot लाओ। AAV के उपयोग के लिए जैव सुरक्षा नियमों देश या संस्था पर निर्भर हो सकता है, और एक पीएसएम 2 हुड के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है.
    नोट: यहाँ, हम Chronos, एक तेजी से channelrhodospin-2 संस्करण व्यक्त एक AAV2/5 serotype का उपयोग करें, Synapsin प्रमोटर के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी

  1. एक स्थिर मानक प्रयोगशाला बेंच पर एक पंप धारक के साथ सुसज्जित एक stereotaxic फ्रेम स्थापित करें. स्टीरियोस्कोप को समायोजित करें ताकि स्पष्ट रूप से उस क्षेत्र को देखें जहां जानवर का सिर रखा जाएगा। रोशनी के लिए एक एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें. स्टीरियोस्कोप दूर घुमाएँ पंप धारक है, जो सर्जरी के पहले कदम के लिए आवश्यक नहीं है का उपयोग करने के लिए.
  2. पंप धारक में एक 33 जी beveled धातु सुई के साथ सुसज्जित एक 10 जेडएल हैमिल्टन सिरिंज स्थापित करें। पानी के साथ निष्कासन प्रणाली का परीक्षण करें।
  3. केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और जाइलज़ीन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के मिश्रण के एक इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के साथ 4 से 5 सप्ताह पुराने C57BL6 माउस को एनेस्थेटाइज करें। 0.9% NaCl के 8.5 एमएल में केटामाइन के 1 एमएल और xylazine के 0.5 एमएल का मिश्रण तैयार करें। इसके परिणामस्वरूप मिश्रण में 10 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन और 1 मिलीग्राम/एमएल xylazine का परिणाम होगा। इस मिश्रण में से, पशु के शरीर के वजन के प्रति ग्राम इंट्रापेरिटोनली 10 $L इंजेक्ट करें। संज्ञाहरण की अवधि के बारे में है 1 ज.
  4. सत्यापित करें कि जानवर अच्छी तरह से एक अंगुली चुटकी के साथ anesthetized है. फिर, सांस लेने की सुविधा के लिए जीभ बाहर खींच. कपाल बाल दाढ़ी.
  5. स्थानीय संज्ञाहरण के लिए सिर की त्वचा के नीचे लिडेकेन हाइड्रोक्लोराइड (4 मिलीग्राम/एमएल; 2 मिलीग्राम/किलोग्राम) के 20 डिग्री एल इंजेक्शन और प्रभाव शुरू करने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें। सूखापन के कारण आंखों की क्षति से बचने के लिए, आंखों को सामयिक नेत्र मलम के साथ कवर करें।
  6. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए, छोटी सर्जरी कैंची के साथ खोपड़ी में एक सीधे कटौती बनाएँ। एक stereotaxic फ्रेम में जानवर प्लेस, हड्डी पर आराम करने के लिए वास्तविक कान के लिए कान सलाखों थोड़ा रोस्ट्रल डालने और त्वचा है, जो खोपड़ी के लिए अच्छा उपयोग करना चाहिए नीचे खींच. जगह में कस. नाक का टुकड़ा स्थापित करें।
  7. एक ऊंचाई समायोजित समर्थन का उपयोग कर सिर के स्तर पर क्षैतिज जानवर के शरीर को बनाए रखें। इसे शारीरिक तापमान पर रखने के लिए माउस के नीचे एक हीटिंग पैड रखें।
  8. हड्डी से नरम ऊतक को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ 0.9% NaCl लागू करने से खोपड़ी को साफ करें। सर्जरी के बाकी के लिए स्टीरियोस्कोप का प्रयोग करें।
  9. खोपड़ी को समायोजित करें ताकि ब्रीग्मा-लैम्बडा अक्ष स्तर है, नाक और दांतों के टुकड़े को ऊपर या नीचे ले जा रहा है। यह bregma और लैम्बा के पुनरावर्ती उपायों की आवश्यकता है, के रूप में दोनों नाक के स्तर के समायोजन के बाद बदल जाएगा.
  10. खोपड़ी पर इंजेक्शन साइट के स्थान का पता लगाएं। पीछे और मध्यस्थ निर्देशांक के अनुसार इंजेक्शन साइट के ऊपर इंजेक्शन सुई समायोजित करें और एक डिस्पोजेबल सुई के साथ खोपड़ी चिह्नित करें। इंजेक्शन सुई को 4 सेमी से ऊपर की ओर ले जाएं।
  11. अधिकतम गति के एक आधे पर, निशान पर एक 1 मिमी व्यास craniotomy एहसास करने के लिए एक ड्रिल के साथ एक 0.5 मिमी बर्र का प्रयोग करें। एक कागज के ऊतकों के साथ स्वब अंतिम रक्तस्राव।
  12. पूरी तरह से पंप के साथ इसे बाहर निकालने के द्वारा भंडारण के लिए हैमिल्टन सिरिंज में निहित पानी खाली. केवल सुई अभी भी पानी से भर जाएगा. सुई शुद्ध deionized पानी के साथ प्रत्येक उपयोग के बीच धोया जाता है. बंध्याकरण की आवश्यकता नहीं है।
  13. इस दिन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए है कि वायरस के alicot ले लो। सुनिश्चित करें कि वायरल समाधान अब और जमे हुए नहीं है, लेकिन ठंडा रह गया है (बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस के करीब)। केवल संक्षेप में छोटे संस्करणों के लिए एक micropipette के साथ 700 nL प्राप्त करने के लिए बर्फ से हटा दें. एक 5 सेमी x 5 सेमी पैराफिन फिल्म के टुकड़े पर ड्रॉप जमा. बुलबुले बनाने से बचें। शेष वायरल समाधान बर्फ पर वापस रखो.
    नोट: ड्रॉप वॉल्यूम वांछित इंजेक्शन मात्रा से अधिक होना चाहिए (700 nL के लिए 200 nL इंजेक्शन). यह एक सुरक्षा मार्जिन दे अगर तरल के कुछ हस्तांतरण के दौरान खो दिया है और आगे बढ़ने से पहले एक छोटे से परीक्षण निष्कासन (कदम 2.16) प्रदर्शन की अनुमति देता है.
  14. कपाल के शीर्ष पर पैराफिन फिल्म रखें। एंट्रो-पोस्टर और पार्श्व स्थिति को बदले बिना वायरल समाधान की बूंद में सुई को डुबोएं।
  15. पैराफिन फिल्म पर निपटा वायरल समाधान के बारे में 500 एनएल के साथ सिरिंज को भरने के लिए पंप के "वापस ले" समारोह का उपयोग करें।  दृश्य नियंत्रण (stereoscope) के तहत यह मत करो, ड्रॉप गायब देखते हैं, और हवा aspirate करने के लिए सुनिश्चित नहीं करते हैं।
  16. सुनिश्चित करें कि सिरिंज सही ढंग से भरा गया है। दृश्य नियंत्रण के तहत 50 एनएल के तरल की एक छोटी सी बूंद बाहर निकालने का परीक्षण करने के लिए प्लंजर नीचे ड्राइविंग द्वारा निष्कासन प्रणाली के कामकाज की पुष्टि करें। ड्रॉप को साफ करें.
  17. चुना गहराई के लिए मस्तिष्क में सुई डालें, दस्ता स्टीरियोटैक्सिक तंत्र दक्षिणावर्त के डोर्सो-वेंट्रल अक्ष को नियंत्रित करके. पुश "रन" बटन (गति 15 nL/मिनट प्रति मात्रा 150 nL इंजेक्शन). एक छोटी सी मात्रा (50-300 nL, इस्तेमाल किया वायरस के आधार पर) धीरे से एक स्वचालित पंप के साथ 10 मिनट से अधिक निकाल दिया है.
  18. इंजेक्शन साइट से लीक से बचने के लिए इंजेक्शन के बाद 10 मिनट प्रतीक्षा करें। फिर, धीरे धीरे डोर्सो-वेंट्रल अक्ष counterclockwise को नियंत्रित करने घुंडी मोड़ से 3-5 मिनट से अधिक सुई को हटा दें।
  19. जानवर से दूर सिरिंज के साथ स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के ऊर्ध्वाधर भाग घुमाएँ। इसे कई बार भरने से साफ आसुत पानी में सुई को तुरंत धो लें, ताकि clogging से बचने के लिए। सिरिंज को पानी से भर दें।
  20. स्टीरियोटैक्सिक फ़्रेम से माउस निकालें. त्वचा को 4-0 पॉलीमाइड सीवन फिलामेंट के साथ सीवन करें। तीन या चार स्टिच बनाओ, 2-1-1 मानक शल्य समुद्री मील के साथ बंधे.
  21. माउस को एक गर्म पिंजरे में तब तक रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से जाग न हो जाए, और जमीन पर रखे एक पेट्री डिश में पानी और भिगोया हुआ भोजन प्रदान करें। यदि ऊष्मा स्रोत पिंजरे के नीचे है, तो ओवरहीटिंग से बचने के लिए स्पेसर ग्रिड का उपयोग करें।
    नोट: स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार, दर्द को रोकने के लिए केटोप्रोफेन (2-5 मिलीग्राम/किग्रा, subcutaneously) या buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg, subcutaneously) की एक खुराक लागू किया जा सकता है।
  22. जब जानवर पूरी तरह से जाग रहा है, यह अपने घर पिंजरे में लौटने और इसकी भलाई की निगरानी, विशेष रूप से इंजेक्शन के बाद दिन पर. दर्द के लक्षण के लिए जाँच करें. यदि किसी भी व्यवहार संशोधन मनाया जाता है, जानवर अपने शरीर के वजन पर नजर रखने के लिए तौला जाता है.
  23. इस्तेमाल किया वायरस के आधार पर, पूर्ण अभिव्यक्ति के लिए समय भिन्न हो सकते हैं. यहाँ, हम AAV5 की अभिव्यक्ति के लिए 3 सप्ताह की अनुमति देते हैं. Syn.Chronos-GFP.

3. तीव्र टुकड़ा रिकॉर्डिंग और निर्धारण के लिए समाधान

  1. 10x केंद्रित काटने समाधान (125 एमएम NaCl, 25 एमएम Sucrose, 2.5 एमएम केसीएल, 25 एमएम NaHCO3,1.25 एम एम एन एच2पीओ4, और 2.5 एमएम डी-ग्लूकोज) और कृत्रिम सेरेब्रोस्पिनल तरल पदार्थ (एसीएसएफ) समाधान (124 एमएम नैक्ल, 2.5 एम एम एल, 2.5 एम एम सी एल 6) के शेयर समाधान तैयार करें। नHको3, 1 एमएम नाह2पीओ4, और 11 एमएम डी-ग्लूकोज) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों से पहले शुद्ध deionized पानी में। इन समाधानों को CaCl2 और MgCl2के बिना 1 L बोतलों में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. प्रयोग के दिन, 0.5 एल प्रत्येक के अंतिम मात्रा के लिए समाधान और ACSF 10x काटने के शेयर समाधान पतला. एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ आंदोलन और 95% / 5%2/ डाइवेलेंट आयनों को काटने के समाधान के लिए 0ण्1 म म कक्ल2 तथा 7 म मगबक् 2 तथा एसीएसएफ के लिए 2 म म् क्ल2 तथा 2 म म् म म्क्लक्ल2 की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए द्विसंयोजक आयन जोड़ें।
  3. पोटेशियम-ग्लूकोनेट आधारित पिपेट समाधान को शामिल करने के लिए तैयार करें: 135 एमएम के-ग्लूकोनेट, 1.2 एमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपी, 0.2 एमएम ईजीटीए, 2 एमएम एमजीसीएल2,4 एमएम एमजीएटीपी, 0.4 एमएम ट्राइस-जीटीपी, 10 एमएम नै 2-फॉस्फोक्रेट, और 2.7 मीटर बायो-फॉक्ट-फॉक्ट-पोएट-पोसेट के लिए 2.7 एम.एम.एस.टी.टी. आकारिकी रहस्योद्घाटन. समाधान के पीएच को 7.3 और 290 mOsm करने के लिए osmolarity समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट स्टोर करें।
  4. 0.1 एम पीबीएस को 500 एमएल आसुत जल में बुपH पीबीएस ड्राई-ब्लेंड पाउडर पाउच को कम करके तैयार करें, जिसके परिणामस्वरूप 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट, 0.15 एम एन सीएल, पीएच 7.2।
  5. 4% पीएफए घोल का 1 L तैयार करने के लिए, आसुत जल में 36% तरल पीएफए के 111 एमएल और 10 एमएल 10 x पीबीएस घोल को पतला करें।
  6. 0.1 एम पीबीएस के 500 एमएल में 150 ग्राम सुक्रोज युक्त 30% सुक्रोज घोल तैयार करें।

4. मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

  1. भ्रम से पहले शोषक बेंच पेपर के साथ बेंच स्पेस तैयार करें।
  2. गुरुत्वाकर्षण-पोषित भ्रम के लिए बेंच के ऊपर लगभग 1 मीटर की ड्रिप स्थापित करें। एक 24 जी तितली सुई संलग्न करें।
  3. बर्फ के साथ vibratome के काटने कक्ष के चारों ओर और यह एक फ्रीजर में स्टोर.
  4. सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया एक ही ketamine-xylazine मिश्रण के इंट्रापर्टोनियल इंजेक्शन के साथ माउस Anesthetize. बल के साथ टो को चुटकी द्वारा संज्ञाहरण के चरण का आकलन करें। जब पूरी तरह से सो, heparin के 100 $L (5000 U.I./mL) intraperitoneally इंजेक्ट करें.
  5. शोषक कागज पर चिपकने वाला टेप के साथ जानवर को ठीक करें, इसकी पीठ पर झूठ बोल रही है। ऊपर की ओर डायाफ्राम से, छोटे कैंची के साथ बाईं और दाईं ओर पसलियों को काटने से वक्ष ीय पिंजरे खोलें। चिपकने वाला टेप की मदद से वक्ष पिंजरे को खुला बनाए रखें।
  6. एक hemostat के साथ उतरते aorta दबाना और 4 डिग्री सेल्सियस ठंडा और oxygenated (95%/5% ओ2/सीओ2),24 जी तितली सुई के माध्यम से समाधान काटने के साथ दिल के बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से perfuse. 5 s के बाद, छोटे कैंची के साथ सही atrium खोलें.
  7. 5 मिनट की गिरावट के बाद, जब अंग रक्तहीन होते हैं, तो भ्रम को रोक देते हैं। बड़े कैंची के साथ जानवर decapitate और एक पेट्री डिश में 4 डिग्री सेल्सियस ठंडा और oxygenated काटने समाधान में सिर डूब।
  8. मस्तिष्क को निकालने के लिए, गर्दन से नाक तक त्वचा को काटें, फिर कैंची से खोपड़ी से अंतिम कशेरुकी को काट दें। मैन्युअल रूप से त्वचा को वापस लेने और खोपड़ी को खोलने के लिए छोटे कैंची का उपयोग करें, इसे मिडलाइन के साथ काटने, पुच्छसे से रोस्ट्रल तक, आंखों के बीच ऊपर की ओर।
  9. ध्यान से घुमावदार या हड्डी संदंश के साथ ललाट हड्डी के पार्श्विक हड्डी और पुच्छीय भाग को हटा दें। मस्तिष्क और कपाल मंजिल के बीच साधन डालने से एक छोटे गोल spatula के साथ मस्तिष्क निकालें, घ्राण बल्ब अनुभाग, ऑप्टिक तंत्रिका और अन्य कपाल नसों, और सेरिबैलम.
  10. एक बीकर में बर्फ-ठंडा काटने के घोल (4 डिग्री सेल्सियस) में मस्तिष्क को धीरे-धीरे जलमग्न कर दें। फिल्टर कागज पर मस्तिष्क स्थिति धीरे cortical सतह सूखी. क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस में कटौती करने के लिए, ब्लेड का सामना करना पड़ पुच्छ पक्ष के साथ, एक vibratome के नमूना धारक के लिए मस्तिष्क प्रांतस्था नीचे गोंद.
  11. बर्फ ठंडा oxygenated काटने के समाधान के साथ काटने कक्ष भरें ताकि मस्तिष्क पूरी तरह से डूब गया है. स्लाइस पर संभावित बाएँ-दाएँ अस्पष्टता से बचने के लिए बाएँ गोलार्द्ध (प्रतिपार्श्विक पक्ष) पर एक कटौती करें।
    चेतावनी: हमेशा समाधान oxygenate और प्रकाश जोखिम से स्लाइस की रक्षा.
  12. 1 मिमी आयाम पर 0ण्00 मिमी प्रति कक की चाल पर थरथानेम के साथ 300 डिग्री मीटर मोटी स्लाइस काटें। इस स्तर पर, यह संक्षेप में एक फ्लोरोसेंट टॉर्च (440-460 एनएम) और इसी फिल्टर चश्मा (500 एनएम लंबे पास) का उपयोग कर thalamus में Chronos-GFP अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए सिफारिश की है।
  13. एक स्केलपेल के साथ हिप्पोकैम्पस क्षेत्र को अलग करें और इसे स्नान-गर्म (34 डिग्री सेल्सियस) से भरे बीकर में तैनातएक कक्ष में स्थानांतरित करें, ऑक्सीजनयुक्त (95%/5% ओ2/
  14. 15 मिनट के बाद, गर्म पानी स्नान से बाहर कक्ष ले और स्लाइस कमरे के तापमान पर आराम करते हैं, अभी भी उपयोग तक कम से कम 45 मिनट के लिए oxygenated.

5. पूरे सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग

  1. धीरे से एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए एक कस्टम बनाया ग्लास हस्तांतरण pipette के साथ हिप्पोकैम्पस परिसर युक्त एक मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण। एक स्थानांतरण पिपेट एक रबर पिपेट बल्ब से जुड़ी एक छोटा पास्चर पिपेट (इनर व्यास 6.5 मिमी) से बना है। लगातार रिकॉर्डिंग चैम्बर (3 एमएल) 34 डिग्री सेल्सियस (गर्म) ACSF के साथ 95%/5% ओ2/ परिस्तिथी पंप की गति 2-3 एमएल/मिनट पर सेट करें।
  2. नीले एलईडी रोशनी (470 एनएम) के साथ ब्याज के क्षेत्र में एक्सॉन टर्मिनलों में Chronos-GFP अभिव्यक्ति की संक्षिप्त जांच और एक 4x उद्देश्य के साथ निरीक्षण करते हैं। GFP फ्लोरोसेंट एक उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से कल्पना की है, एक सीसीडी कैमरा छवि के साथ एक कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित.
  3. इसे बनाए रखने के लिए स्लाइस पर कसकर स्थान नायलॉन तार ("हार्प") के साथ एक यू-आकार के प्लैटिनम तार से बने एक टुकड़ा लंगर रखें।
  4. एक 63x विसर्जन उद्देश्य को बदलें और ध्यान समायोजित करें. Chronos-GFP व्यक्त axons के लिए जाँच करें और पैच रिकॉर्डिंग के लिए एक पिरामिड न्यूरॉन का चयन करें.
  5. उद्देश्य को ऊपर की ओर ले जाएँ.
  6. बोरोसिलिकेट ग्लास से ब्राउन-फ्लैमिंग इलेक्ट्रोड पुलर का उपयोग करके पाइपेट को खींचें। पुलर टिप व्यास में लगभग 1 डिग्री मीटर के साथ पिपेट का उत्पादन करने के लिए सेट किया गया है। कश्मीर-ग्लूकोनेट-आधारित आंतरिक समाधान के साथ पिपेट भरें।
  7. सिर के चरण पर पिपेट धारक में पिपेट माउंट करें। कक्ष में पिपेट को कम करें और उद्देश्य के तहत टिप पाते हैं। पिपेट प्रतिरोध 3-8 म$ के बीच होना चाहिए। एक सिरिंज के साथ एक प्रकाश सकारात्मक दबाव लागू करें ताकि पाइपेट से बाहर समाधान के एक शंकु को देखने के लिए और उत्तरोत्तर टुकड़ा की सतह के लिए पिपेट और उद्देश्य को कम करें।
  8. वोल्टेज-क्लैम्प विन्यास में सेल पैच: पहचान न्यूरॉन दृष्टिकोण और नाजुक सोमा पर पिपेट टिप दबाएँ. सकारात्मक दबाव झिल्ली की सतह पर एक डिंपल का उत्पादन करना चाहिए। एक गीगा-ओम सील बनाने के लिए दबाव छोड़ें ([1 G] प्रतिरोध।। एक बार सील कर दिया, होल्डिंग वोल्टेज को -65 एमवी पर सेट करें। नकारात्मक दबाव की एक तेज नाड़ी के साथ झिल्ली तोड़: यह एक पाइपेट धारक से जुड़े ट्यूब के लिए मजबूत चूषण लागू करने से हासिल की है।
  9. संपूर्ण कोशिका धारा क्लैम्प मोड में वर्तमान चरणों को हाइपरpolarizing और depolarizing करने के लिए न्यूरॉन की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड (चित्र 2) .
    नोट: इस प्रोटोकॉल सेल के सक्रिय और निष्क्रिय आंतरिक गुणों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कस्टम-लिखित MATLAB दिनचर्या ऑफ लाइन विश्लेषण10,16के लिए उपयोग किया जाता है।
  10. वर्तमान में रिकॉर्ड- या वोल्टेज-क्लैम्प पदों में पूरे क्षेत्र 475 एनएम एलईडी उत्तेजना के लिए क्रोनोस व्यक्त. 20 हर्ट्ज पर 2 ms durations की 10 उत्तेजनाओं की गाड़ियों के साथ उत्तेजित (चित्र 2B, C)। प्रकाश तीव्रता 0ण्1-2 उ. से भिन्न हो सकती है।
    नोट: प्रकाश तीव्रता उद्देश्य के तहत तैनात एक photodiod सेंसर के साथ सुसज्जित एक डिजिटल हाथ ऑप्टिकल पावर कंसोल के साथ मापा गया था. 2-4 मों की अनुक्रिया विलंब एक-एकसंश्ती संबंध के लिए लक्षण हैं।
  11. लंबी दूरी के afferents और दर्ज न्यूरॉन के बीच synaptic संचरण की प्रकृति की जांच करने के लिए, विभिन्न औषधीय एजेंटों का इस्तेमाल किया जा सकता है. औषधीय रूप से नेटवर्क सक्रियण के माध्यम से अप्रत्यक्ष प्रतिक्रियाओं से प्रत्यक्ष, monosynaptic प्रतिक्रियाओं भेद करने के लिए, ACSF करने के लिए 1 $M TTX और 100 डिग्री एम 4-एपी जोड़ें।
    नोट: ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स के स्नान आवेदन न्यूरोट्रांसमीटर है कि जारी की है और postsynaptic रिसेप्टर्स की पहचान की प्रकृति निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, AMPA प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स NBQX द्वारा अवरुद्ध किया जाएगा (10 डिग्री सेल्सियस) और NMDA रिसेप्टर्स APV द्वारा (100 डिग्री सेल्सियस). अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल समय के साथ synaptic प्रतिक्रियाओं या प्रतिक्रिया गतिशीलता की वोल्टेज निर्भरता की जांच करने के लिए कल्पना की जा सकती है.
  12. एक और सेल पैच करने के लिए मूल ACSF समाधान के साथ धो लें, या 4% पीएफए से भरा एक छोटा सा शीशी में एक biocytin से भरे न्यूरॉन युक्त टुकड़ा हस्तांतरण.
  13. 4% पीएफए में रात भर निर्धारण के बाद, 0.1 एम पीबीएस (2x 5 मिनट के लिए, 20 मिनट के लिए 1x) में टुकड़ा धो लें।
  14. 30% में स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर sucrose.

6. बायोसाइटिन रहस्योद्घाटन

  1. 30% sucrose की एक बूंद में एक गिलास ब्लेड पर biocytin से भरे न्यूरॉन्स युक्त निश्चित स्लाइस स्थानांतरण और ठंड-थिंग के तीन चक्र प्रदर्शन: सूखी बर्फ पर ब्लेड जगह 1 मिनट के लिए एक styrofoam बॉक्स में निपटा जब तक sucrose की बूँदें पूरी तरह से जमे हुए हैं, तो हाथ हथेली के खिलाफ ब्लेड दबाएँ thaw करने के लिए.
  2. 0.1 M PBS (2x के लिए 5 मिनट, 1 h और 50 मिनट के लिए 1x) में टुकड़ा 3x धो लें, धीरे से उत्तेजित. पिछले धोने के लिए 2 एच से अधिक नहीं है।
  3. 2% दूध पाउडर (0.4 ग्राम 20 एमएल में) से युक्त उत्तेजित बफर समाधान में 2 एच के लिए आरटी पर स्लाइस को प्री-इनक्यूबेट करें, गैर-विशिष्ट साइटों को संतृप्त करने के लिए और 0.5% ट्राइटन X100 (0.1 एमएल में 20 एमएल) 0.1 एम पीबीएस में झिल्ली को पार करने के लिए।
  4. 2% दूध पाउडर युक्त एक समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 संयुग्मी (1/500), और DAPI (1/1000) में 0.1 एम पीबीएस, धीरे उत्तेजित.
  5. 0.1 M PBS (2x 5 मिनट के लिए, 1x के लिए 2 ज) में तीन बार टुकड़ा धो लें. पिछले धोने अब पिछले कर सकते हैं, अप करने के लिए 4 ज, पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए.
  6. टुकड़ा बढ़ते से पहले, 10x आवर्धन पर एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के क्रम में PBS से भरा एक कक्ष में चिह्नित सेल युक्त टुकड़ा के पक्ष की पहचान करने के लिए Cy5 फ्लोरोसेंट मार्करों का निरीक्षण करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया.
  7. एक ब्लेड पर टुकड़ा स्थानांतरण, सेल साइड अप, यह एक कागज के ऊतकों के साथ सूखी, और यह उच्च प्रतिरोध बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट.
  8. कोशिका शरीर के स्थान की जांच करने के लिए Cy5 और DAPI विन्यास में 10x आवर्धन पर एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और GFP विन्यास में चिह्नित afferents का निरीक्षण करने के लिए, या विस्तृत कायिक, axonal के लिए 20x पर एक उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोप, और डेन्ड्रिटिक आकारिकी (चित्र 2डी, ई)। फ़िल्टर सेटिंग्स सामग्री तालिकामें विस्तृत हैं।

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Representative Results

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यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया एक नीले प्रकाश के प्रति संवेदनशील channelrhodopsin व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (Chronos) thalamus के antero-dorsal नाभिक में GFP के लिए जुड़े (एडीएन), anterograde एडेनो संबद्ध वायरस के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन द्वारा. स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक एक माउस मस्तिष्क एटलस के अनुसार निर्धारित किया गया था और फ्लोरोसेंट अनुरेखक फ्लोरो-रूबी के 200 एनएल इंजेक्शन द्वारा परीक्षण किया. पशु इंजेक्शन के बाद 10 मिनट बलिदान किया गया था, और मस्तिष्क निकाला और रात भर fixated था. कोरोनल मस्तिष्क वर्गों इंजेक्शन साइट है, जो सही ढंग से में रखा गया था और ADN तक सीमित की जांच करने के लिए तैयार थे (चित्र 1ए, बी).

आदेश में ADN के न्यूरॉन्स में Chronos-GFP व्यक्त करने के लिए, हम AAV5 के 300 एनएल इंजेक्शन. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. इंजेक्शन के तीन सप्ताह बाद, तीव्र क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस तैयार किए गए थे. चित्र 1 सी एक मस्तिष्क टुकड़ा सही गोलार्द्ध में thalamic इंजेक्शन साइट युक्त से पता चलता है, हरे रंग में GFP अभिव्यक्ति के साथ. 4x उद्देश्य से सुसज्जित एक एपि-फ्लोरेसेंट माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण करने पर, जीएफपी लेबल थैलेमिक एक्सॉन्स को प्रीसबीकुलम में देखा गया (चित्र 1ब्, डी)। यह नोट किया गया था कि थैलेमिक एक्सॉन्स ने पूर्वानुबकम् की सतही परतों I और III को सघन रूप से आंतरिक रूप दिया था (चित्र 1D)

परत III में presubicular न्यूरॉन्स की गतिविधि पूरे सेल पैच-क्लैम्प विन्यास में दर्ज किया गया था. झिल्ली की विभवात्मक विविधताओं को रिकॉर्ड करते समय अतिध्रुवण और विध्रुवण वर्तमान चरणों को लागू किया गया था (चित्र 2)। डेटा सक्रिय और निष्क्रिय झिल्ली गुणों के बाद ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर संग्रहीत किया गया था। Presubicular परत III प्रमुख कोशिकाओं आम तौर पर एक नकारात्मक आराम क्षमता के पास -63 एमवी और आवश्यक वर्तमान इंजेक्शन depolarizing झिल्ली क्षमता फायरिंग सीमा के लिए ड्राइव करने के लिए. उनके आंतरिक गुणों का पूर्ण विवरण11प्रकाशित किया गया है।

उत्तेजक ADN एक्सॉन टर्मिनलों Chronos-GFP व्यक्त उत्तेजक पोस्ट-synaptic क्षमता (EPSPs) वर्तमान दबाना मोड में presubicular परत III प्रमुख कोशिकाओं में प्राप्त (चित्र 2बी). प्रकाश तीव्रता के आधार पर, EPSPs कार्रवाई संभावित सीमा तक पहुँच सकता है. वोल्टेज-क्लैम्प मोड में पोस्टिनैप्टिक अनुक्रियाएँ भी देखी गई क्योंकि उत्तेजक पोस्ट-साइनैप्टिक धाराओं (ईपीएससी) को प्राप्त किया गया था (चित्र 2)। ईपीएससी की ऑनसेट विलंबता प्रकाश उत्तेजनाओं द्वारा पैदा की गई छोटी (मध्य, 1.4 एमएस10),थैलेमिक एक्सॉन और परत III presubicular न्यूरॉन्स के बीच एक सीधा synaptic संपर्क का संकेत. TTX-4AP हालत में EPSCs का समर्थन इस monosynaptic सक्रियण की पुष्टि की. यह उल्लेखनीय है कि इन कोशिकाओं को एक नियमित रूप से फायरिंग पैटर्न के साथ afferent axons के प्रकाश उत्तेजनाओं को मज़बूती से जवाब दिया.

Figure 1
चित्र 1 : एंटरडोर्सल थैलेमिक नाभिक (एडीएन) में स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन। (क) इंजेक्शन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) एक कोरोनल अनुभाग में फ्लोरो-रूबी के साथ इंजेक्शन साइट पुष्टि। इनसेट एंट्रो-डोर्सल स्तर और ब्रीग्मा से दूरी को इंगित करता है। (C)थालेमस में एएवी-क्रोनोस-जीएफपी इंजेक्शन के बाद क्षैतिज स्लाइस। आइपिसिओरल प्रेसुबिकुलम के एक्सोनल अनुमानों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। टुकड़ा के बाईं ओर एक चीरा (एक काले त्रिकोण द्वारा इंगित) contralateral गोलार्द्ध के निशान. (बी, सी) स्केल बार 1 मिमी(घ) पूर्वउप्युलर सतही परतों के लिए एडीएन अनुमानों के साथ(सी) में इनसेट का बढ़ाया दृश्य। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पूर्वाब्य परत III न्यूरॉन: आंतरिक गुण, थैलेमिक एफ़लंट्स की हल्की उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया, और सेल आकारिकी के बाद के रहस्योद्घाटन. (ए) फायरिंग पैटर्न और झिल्ली hyperpolarizing और वर्तमान कदम depolarizing के लिए परत III न्यूरॉन की संभावित विविधताओं. (बी, सी) परत III न्यूरॉन के जवाब 2 एमएस प्रकाश उत्तेजनाओं (नीले सलाखों) में दर्ज thalamic axons के (बी) वर्तमान clamp और (सी) वोल्टेज-क्लग मोड. (डी, ई) परत III पिरामिडीय न्यूरॉन (सफेद, भरा पीला त्रिकोण द्वारा संकेत) एक epifluorscence माइक्रोस्कोप के साथ छवि क्षैतिज में DAPI धुंधला (नीले) के साथ presubicular सतही परतों में Chronos-GFP (हरा) व्यक्त thalamic axons से घिरा हुआ (नीले) घ, मापनी छड़ र् 100 उ) तथा उच्च आवर्धन पर कोनाफोकल सूक्ष्मदर्शी(इ,स्केल छड़ र् 50 उ)। में सेल(ए) भरा पीले त्रिकोण के साथ संकेत दिया है. एक दूसरे, आंशिक रूप से भरा न्यूरॉन खाली पीले त्रिकोण के साथ संकेत इस टुकड़ा में मौजूद है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsins व्यक्त करने के लिए विवो वायरल इंजेक्शन में लंबी दूरी के कार्यात्मक कनेक्टिविटी10,11,17,18के optogenetic विश्लेषण के लिए एक विकल्प विधि है. Stereotaxic इंजेक्शन ठीक मस्तिष्क के एक विशिष्ट क्षेत्र को लक्षित करने की संभावना प्रदान करते हैं. एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ एक ऑप्सिन का सह-अभिव्यक्ति आसानी से सफल अभिव्यक्ति और सटीक इंजेक्शन साइट की पुष्टि के मूल्यांकन की अनुमति देता है। AAV serotype 2/5 का उपयोग आम तौर पर लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करता है. इस तरह, न्यूरॉन्स की एक प्रतिबंधित आबादी transfected है, उनके सेल निकायों और एक्सॉन टर्मिनलों में प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनलों को व्यक्त. बाद के पूर्व vivo टुकड़ा प्रयोगों में, यह एक के बाद synaptically जुड़े न्यूरॉन के पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के माध्यम से सफल synaptic संचरण बाहर पढ़ने, अपने लक्ष्य क्षेत्र में सीधे प्रकाश दालों के साथ इन एक्सॉन टर्मिनलों को प्रोत्साहित करने के लिए संभव है. उपरोक्त प्रोटोकॉल मजबूत और सुविधाजनक है, और कुछ अतिरिक्त नोट्स सफल प्रयोगों के प्रदर्शन में मदद कर सकते हैं.

संज्ञाहरण के विभिन्न प्रकार के इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ वर्णित एक केटामाइन-xylazine संयोजन के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के रूप में एक आसान करने के लिए उपयोग, सुविधाजनक analgesia19के साथ अल्पकालिक संज्ञाहरण है. संज्ञाहरण की गहराई और अवधि कुछ हद तक भिन्न हो सकती है। कुछ मामलों में, यह प्रोटोकॉल के दौरान ketamine-xylazine की एक और आधा खुराक इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है. Isoflurane संज्ञाहरण और अधिक जल्दी और बेहतर संज्ञाहरण की गहराई को नियंत्रित करने के लिए प्रेरित करने के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है। इंजेक्शन साइटों के निर्देशांक एक माउस मस्तिष्क एटलस की मदद से निर्धारित किया जा सकता है. व्यवहार में, निर्देशांक का परीक्षण किया और समायोजित करने की आवश्यकता है, यदि आवश्यक हो तो.

स्वच्छ काम की स्थिति भी महत्वपूर्ण हैं. यह दस्ताने, एक भीड़ टोपी, और एक प्रयोगशाला कोट सहित डिस्पोजेबल सुरक्षात्मक गियर, का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में जानवर की स्थिति, बहुत संज्ञाहरण की दक्षता में सुधार होगा, जो जानवर के आराम करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। जानवर के शरीर के सिर और गर्दन के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए. जानवर की स्थिति में और craniotomy से पहले सबसे महत्वपूर्ण कदम bregma-lambda अक्ष का समायोजन है. विशेष रूप से जब गहरी मस्तिष्क संरचनाओं को लक्षित, यहां तक कि एक छोटे से विचलन त्रुटियों उत्पन्न जब मस्तिष्क में इंजेक्शन सुई को कम करेगा. कुछ मामलों में, एक जानबूझकर चुन सकते हैं और एक तिरछी सुई प्रक्षेप पथ की गणना.

इंजेक्शन की मात्रा ठीक स्थानीयकृत opsin अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक निर्धारक कारक है. एक छोटी सी मात्रा विशेषाधिकार के लिए आदर्श है एक कसकर प्रतिबंधित transfection क्षेत्र. उच्च मात्रा एक बड़े लक्ष्य क्षेत्र की पूरी हद तक कवर करने के लिए उपयोगी हो सकता है. यदि एक बड़े क्षेत्र को कवर करने की जरूरत है, जैसे पट18, यह पड़ोसी निर्देशांक की एक श्रृंखला के साथ कई छोटे इंजेक्शन जगह उपयोगी हो सकता है. अंतराल जब तक पूर्व vivo electrophysiological रिकॉर्डिंग भी महत्वपूर्ण है. पूर्ण अभिव्यक्ति के लिए न्यूनतम समय आवश्यक है। जबकि 3 सप्ताह के लिए इन प्रयोगों के लिए एक इष्टतम देरी लग रहेहो 11, आवश्यक देरी वायरस के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, इसके serotype, और postsynaptic मस्तिष्क क्षेत्र के लिए दूरी.

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण भी अधिक शक्तिशाली है जब ट्रांसजेनिक जानवरों में इंजेक्शन के साथ संयुक्त. पिछले काम GABAergic न्यूरॉन्स के subtypes के लिए विभिन्न माउस लाइनों का शोषण किया है, आदेश में विशेष रूप से या तो पीवी- या SST-expressing interneurons पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के लिए लक्ष्य20. पड़ोसी पीवी और पिरामिड न्यूरॉन्स या एसएसटी और पिरामिड न्यूरॉन्स की एक साथ डबल रिकॉर्डिंग तो दो न्यूरॉन प्रकार11के बीच लंबी दूरी की आदानों की ताकत की तुलना की अनुमति देता है. यह परिणाम है कि एक न्यूरॉन प्रकार के संबंध में मानकीकृत कर रहे हैं पैदावार. यह मानकीकरण उन मामलों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां ऑप्सिन का अभिव्यक्ति स्तर विभिन्न जानवरों या विभिन्न स्लाइसों के बीच भिन्न होता है.

स्लाइस स्वास्थ्य उच्च गुणवत्ता वाले पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है। स्लाइस के लगातार oxygenation महत्वपूर्ण है, और एक धीमी गति से काटने की गति काफी टुकड़ा सतह की गुणवत्ता में सुधार. 300 डिग्री मीटर की एक टुकड़ा मोटाई संरक्षित करता है, कुछ हद तक, क्षैतिज presubicular वर्गों में microcircuit अखंडता, उनके सेल निकायों के साथ पिरामिड न्यूरॉन्स सहित, डेन्ड्रिटिक और स्थानीय axonal असर, और स्थानीय synaptic कनेक्शन. प्रकाश gated चैनलों के प्रकार afferent फाइबर के सक्रियण प्रेरित करने के लिए चुना बहुत उत्तेजना मानकों को प्रभावित करेगा (duration, प्रकाश तीव्रता). Chronos एक नीले प्रकाश के प्रति संवेदनशील channelrhodopsin है, और रोशनी तरंगदैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (500 एनएम के आसपास पीक संवेदनशीलता, यहां तक कि 0.05 mW/mm2की न्यूनतम प्रकाश तीव्रता के साथ, यह भी 405 एनएम पर सक्रिय, और अप करने के लिए 530 एनएम21 ). इसके अलावा, Chronos शास्त्रीय ChR2 की तुलना में तेजी से गतिज गुण है, जो उच्च आवृत्ति उत्तेजनाओं और लंबी दूरी के अनुमानों के विश्वसनीय सक्रियण सक्षम बनाता है22. Chrimson की अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में, एक लाल स्थानांतरित opsin संस्करण, अलग तंत्रिका आबादी के स्वतंत्र ऑप्टिकल उत्तेजना संभव हो जाता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

हम तकनीकी मदद के लिए स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल और मारिन मैनुअल और Patrice Jegouzo के पिछले संस्करणों के विकास में उनकी मदद के लिए बर्ट्रेंड मैथन, एमजेडी नासर, ली-वेन हुआंग, और जीन साइमननेट को धन्यवाद देते हैं। यह काम शिक्षा और अनुसंधान के लिए फ्रांसीसी मंत्रालय (एल आर, एल एस), केंद्र राष्ट्रीय des Etudes Spatiales (एम. बी.), और Agence Nationale डे ला Recherche अनुदान ANR-18-CE92-0051-01 (डी एफ) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN - 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 - 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

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References

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माउस मस्तिष्क स्लाइस में लंबी-रेंज इनपुट के Optogenetic उत्तेजना के लिए Vivo Intracerebral Stereotaxic इंजेक्शन में
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Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).More

Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

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