Summary
Denne protokol beskriver et sæt af metoder til at identificere celle typen specifik funktionel konnektivitet af langtrækkende input fra fjerntliggende hjerneområder ved hjælp af optogenetiske stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.
Abstract
Viden om celle-typespecifikke synaptiske tilslutningsmuligheder er en afgørende forudsætning for at forstå hjernen-dækkende neuronal kredsløb. Den funktionelle undersøgelse af langtrækkende forbindelser kræver målrettede optagelser af enkelt neuroner kombineret med den specifikke stimulering af identificerede fjerne indgange. Dette er ofte vanskeligt at opnå med konventionel og elektrisk stimulation teknikker, fordi axoner fra konvergerende opstrøms hjerneområder kan blande sig i målregionen. Den stereotaxiske målretning af en specifik hjerneregion for virus medieret ekspression af lysfølsomme Ionkanaler muliggør selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Intracerebral stereotaxiske injektioner kan anvendes i veldefinerede strukturer, såsom den forreste thalamic kerner, foruden andre subkortikale eller kortikale områder i hele hjernen.
Beskrevet her er et sæt af teknikker til præcis stereotaxisk injektion af virale vektorer udtrykker channelrhodopsin i muse hjernen, efterfulgt af foto stimulation af Axon terminaler i hjernen skive forberedelse. Disse protokoller er enkle og almindeligt anvendelige. I kombination med hel-celle patch clamp optagelse fra en postsynaptisk forbundet Neuron, foto stimulation af axoner tillader påvisning af funktionelle synaptiske forbindelser, farmakologisk karakterisering, og evaluering af deres styrke. Desuden kan biocytinel fyldning af den indspillede neuron anvendes til post-hoc morfologiske identifikation af den postsynaptiske neuron.
Introduction
Det er nødvendigt at definere konnektivitet mellem hjerneregioner for at forstå neurale kredsløb. Klassiske anatomiske sporingsmetoder gør det muligt at etablere interregionale tilslutningsmuligheder, og læsions undersøgelser er med til at forstå den hierarkiske organisering af informationsstrømmen. For eksempel, hjerne kredsløb for rumlig orientering og hovedretning signalering involverer den retningsbestemte strøm af oplysninger fra thalamus til formodbiculum. Dette er blevet påvist ved læsions studier af Antero-dorsale thalamic kerner (ADN), der nedbryder hovedretningen signal i nedstrøms dorsale formodbiculum, samt parahippocampale gittercelle signal1,2.
Den funktionelle konnektivitet mellem hjerneområder er vanskeligere at etablere på et cellulært og subcellulært niveau. I hippocampus, en meget organiseret anatomi gør det muligt at undersøge pathway-specifikke synaptiske forbindelser ved hjælp af elektrisk simulering i Skive forberedelse. Stimulerings elektroder placeret i Stratum radiatum af Carnot kan bruges til specifikt at stimulere Schaffer-sikkerhedsstillelse fra3. Stimulering af elektroder placeret i Stratum lacunosum moleulare af Carnot vil aktivere stien Path-indgangen til4,5. Elektrisk stimulation aktiverer neurotransmitter frigivelse fra Axon terminaler; men det aktiverer neuroner med somata nær stimulerings stedet samt axoner passage. Det er derfor af begrænset brug for at studere afferenter fra definerede hjerneområder, når fibre af forskellige regioner i oprindelse blander sig i målstrukturen, som det typisk er tilfældet i neocortex.
Neuroner kan også stimuleres med lys. Optiske metoder omfatter fotoaktivering af bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-foton Laserscanning. Flere tæt fordelt steder kan stimuleres sekventielt, uden mekaniske skader på vævet6. Dette er blevet brugt med succes til at kort synaptisk receptorer samt aktivere individuelle neuroner7. Mens glutamat-uncaging kan bruges til lokal kredsløbsanalyse, giver det ikke mulighed for specifik aktivering af langtrækkende indgange.
En metode til valg til undersøgelse af langtrækkende konnektivitet i neuronal kredsløb er brugen af virus-medieret channelrhodopsin udtryk. Brug in vivo stereotaxiske injektioner som beskrevet her, kan ekspression af lys-gated ion kanaler målrettes og rumligt begrænses til en ønsket hjerneregion. På denne måde, channelrhodopsins er effektive til kortlægning excitatoriske eller hæmmende tilslutningsmuligheder fra en region til sit mål. Transfected axoner terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne skive forberedelse, og patch-klemme optagelser som en læse-out tillade undersøgelse af de funktioner og styrker af specifikke kredsløb komponenter i hjernen8. Den optogenetiske tilgang kombineret med stereotaxisk injektion af en virus giver enestående specificitet og genetisk kontrol9. Stimulering med lys giver desuden mulighed for både høj tidsmæssig og rumlig præcision10,11.
Den formodbiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen af hippocampus og para-hippocampale dannelse12,13. Det modtager vigtige synaptiske input fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikale regioner14. Således er selektiv stimulering af thalamic axoner terminaler inden for en formodnings skive ikke mulig med elektrisk stimulation eller glutamat-ondning. Beskrevet i denne protokol er metoder til at bestemme funktionelle forbindelser mellem hjernen regioner (ADN og formodbiculum) ved hjælp af præcise stereotaksisk injektioner af virale vektorer udtrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er foto stimulation af axoner terminaler af projicerende neuroner i deres målregion, kombineret med hele cellen patch-clamp optagelser af post-Synaptic neuroner i hjernen skive forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med det europæiske rådsdirektiv (2010/63/EU) og godkendt af den etiske komité i Paris Descartes Universitet. Eksperimentatoren skal indhente tilladelse til proceduren for at overholde lokale regler.
1. planlægning af eksperimentet
- Definer det hjerne område, der skal målrettes. Bestem de stereotaxiske koordinater på injektionsstedet ved hjælp af en musehjerne Atlas15. For den rigtige Antero-dorsale thalamic Nucleus (ADN), koordinaterne er:-0,82 posterior, 0,75 lateral,-3,2 dybde (mm) i forhold til bregma. Det kan være nødvendigt at justere koordinaterne for dyr af forskellig alder, køn eller stamme.
- Bekræft og Dokumentér koordinaterne ved at injicere et fluorescerende Tracer (150 til 300 nL), der kan observeres med et epifluorescens mikroskop i et piloteksperiment (figur 1a, B).
- Definer den type virus, der skal injiceres. Virus opbevares i 6 μL aliquoter ved-80 °C som anbefalet af producenten. Bring 1 alikvot på is til operationsstuen, til injektion af et til seks dyr på en given dag. Biosikkerheds regler for brug af AAV kan afhænge af landet eller institutionen, og brugen af en PSM 2 hætte kan være påkrævet.
Bemærk: her bruger vi en AAV2/5 serotype udtrykker Chronos, en hurtig channelrhodospin-2 variant, smeltet til grøn fluorescerende protein under kontrol af Synapsin Promoter: AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH.
2. stereotaxisk kirurgi
- Installer en stereotaxisk ramme udstyret med en pumpe holder på en stabil standard laboratorie bænk. Juster Stereoskopet for tydeligt at se den zone, hvor dyrets hoved skal placeres. Brug en LED-lyskilde til belysning. Drej Stereoskopet væk for at få adgang til pumpe holderen, som ikke er nødvendig for de første trin af operationen.
- Installer en 10 μL Hamilton-sprøjte udstyret med en 33 G Affaset metal kanyle i pumpe holderen. Test udslyngning system med vand.
- Anesthetize en 4-til 5-ugers gamle C57BL6 mus med en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin hydrochlorid og xylazin (henholdsvis 100 mg/kg og 10 mg/kg). Tilbered en blanding af 1 mL ketamin og 0,5 mL xylazin i 8,5 mL 0,9% NaCl. Dette vil resultere i 10 mg/mL ketamin og 1 mg/mL xylazin i blandingen. Af denne blanding indsprøjtes intraperitonealt 10 μL pr. gram af dyrets legemsvægt. Varighed af anæstesi er omkring 1 h.
- Kontroller, at dyret er godt bedøvet med en tå knivspids. Træk derefter tungen ud for at lette vejrtrækningen. Barberer kranie håret.
- Injicer 20 μL lidocain hydrochlorid (4 mg/mL; 2 mg/kg) under huden af hovedet for Lokal anæstesi og vent 5 min for effekten til at begynde. For at undgå øjenskader på grund af tørhed, dække øjnene med aktuel oftalmologiske salve.
- At udsætte kraniet, skabe en lige skåret i hovedbunden med små kirurgi saks. Placer dyret i en stereotaxisk ramme, indsætte ørepuderne lidt rostral Columns til det faktiske øre til at hvile på knoglen og trække ned i huden, som skal skabe god adgang til kraniet. Spænd på plads. Installer næsestykket.
- Opretholde dyrets krop vandret på niveau med hovedet ved hjælp af en højde justeret støtte. Placer en varmepude under musen for at holde den ved fysiologisk temperatur.
- Rengør kraniet ved at påføre 0,9% NaCl med en vatpind for at fjerne blødt væv fra knoglen. Brug Stereoskopet til resten af operationen.
- Juster kraniet, så bregma-lambda-aksen er niveau, bevæger sig op eller ned næsen og tænder stykke. Dette nødvendiggør iterativ foranstaltninger af bregma og Lamba, da begge vil ændre sig efter justering af næse niveau.
- Find placeringen af injektionsstedet på kraniet. Justér kanylen over injektionsstedet i henhold til posterior og mediale koordinater, og Markér kraniet med en engangskanyle. Bevæg injektions nålen opad med 4 cm.
- Brug en 0,5 mm Burr med en boremaskine til at realisere en 1 mm diameter craniotomi på mærket, med halvdelen af maksimal hastighed. Svaber eventuel blødning med et papirvæv.
- Tøm vandet i Hamilton-sprøjten til opbevaring ved helt at skubbe det ud med pumpen. Kun nålen vil stadig være fyldt med vand. Nålen vaskes mellem hver brug med rent deioniseret vand. Sterilisering er ikke påkrævet.
- Tag den alikvot virus, der skal bruges til denne dag. Sørg for, at den virale opløsning ikke er frosset længere, men er forblevet afkølet (tæt på 0 °C, på is). Fjern kun kort fra isen for at få 700 nL med en mikropipette til små volumener. Indbetal faldet på et 5 cm x 5 cm stykke paraffin film. Undgå at skabe bobler. Sæt den resterende virale opløsning tilbage på isen.
Bemærk: dråbe volumen skal være større end den ønskede Injektionsvolumen (700 nL for 200 nL injiceret). Dette vil give en sikkerhedsmargin, hvis nogle af væsken går tabt under overførslen og gør det muligt at udføre en lille test udslyngning (trin 2,16), før du fortsætter. - Placer paraffin filmen oven på kraniotomi. Dyp nålen i dråbe af viral opløsning uden at ændre Antero-posterior og lateral position.
- Brug "træk"-funktionen af pumpen til at fylde sprøjten med ca. 500 nL af viral opløsning, som er anbragt på paraffin filmen. Gør dette under visuel kontrol (stereoskop), se faldet forsvinder, og sørg for ikke at aspirere luft.
- Sørg for, at sprøjten er korrekt udfyldt. Bekræft funktionen af udslyngning systemet ved at køre ned stemplet for at teste skubbe en lille dråbe væske på 50 nL under visuel kontrol. Aftør faldet.
- Stik nålen ind i hjernen til den valgte dybde ved at dreje på knappen, som styrer den dorso-ventrale akse i stereotaxiske apparater med uret. Tryk på knappen "Run" (hastighed 15 nL/min pr. volumen 150 nL injiceret). En lille mængde (50-300 nL, afhængigt af den anvendte virus) skubbes langsomt over 10 min med en automatisk pumpe.
- Vent 10 minutter efter injektionen for at undgå lækage fra injektionsstedet. Fjern derefter langsomt nålen over 3-5 min ved at dreje knappen, som styrer dorso-ventral aksen mod uret.
- Drej den lodrette del af den stereo taxiske ramme med sprøjten væk fra dyret. Nålen vaskes straks i rent destilleret vand ved at fylde den flere gange for at undgå tilstopning. Opbevar sprøjten fyldt med vand.
- Fjern musen fra den stereotaxiske ramme. Sutur huden med 4-0 polyamid sutur filament. Lav tre eller fire stiches, bundet med 2-1-1 standard kirurgiske knuder.
- Placer musen i et opvarmet bur, indtil det helt vågner op fra anæstesi, og give vand og gennemblødt mad i en Petri skål placeret på jorden. Hvis varmekilden er under buret, skal du bruge et spacer gitter for at undgå overophedning.
Bemærk: ifølge lokale retningslinjer, en enkelt dosis af ketoprofen (2-5 mg/kg, subkutant) eller buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, subkutant) kan anvendes til at forebygge smerter. - Når dyret er helt vågen, returnere det til sit hjem bur og overvåge dets velbefindende, især på dagen efter injektion. Tjek for tegn på smerte. Hvis der observeres en adfærdsændring, vejes dyret for at overvåge dets legemsvægt.
- Afhængigt af den anvendte virus kan tidspunktet for det fulde udtryk variere. Her tillader vi 3 uger til udtryk for AAV5. Syn. Chronos-GFP.
3. opløsninger til akut skive optagelser og fiksering
- Opforbered stamopløsninger af 10x koncentreret skære opløsning (125 mM NaCl, 25 mM saccharose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mm Nah2po4 og 2,5 mm D-glucose) og kunstig cerebrospinalvæske (Acsf) opløsning (124 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 26 mm NaHCO3, 1 mm Nah2po4 og 11 mm D-glucose) i rent deioniseret vand forud for Elektrofysiologi eksperimenter. Disse opløsninger opbevares ved 4 °C i 1 L flasker uden CaCl2 og mgcl2.
- På dagen for forsøget fortyndes stamopløsninger af skære opløsning og ACSF 10x til en endelig volumen på 0,5 L hver. Rystes med en magnetisk omrører og oxygenize ved boblende med 95%/5% O2/Co2. Tilsæt Divalente ioner for at opnå endelige koncentrationer på 0,1 mM CaCl2 og 7 mm mgcl2 for skære opløsningen og 2 mm CaCl2 og 2 mm mgcl2 for acsf.
- Den kaliumgluconatbaserede pipette opløsning skal fremstilles, så den indeholder: 135 mM K-gluconat, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2,4mm MgATP, 0,4 mm Tris-GTP, 10 mm na2-fosfokreatin og 2,7 – 7,1 mm biocytinel til post-hoc-celle morfologi åbenbaring. Juster opløsningen pH til 7,3 og osmolaritet til 290 mOsm. Opbevar 1 mL aliquoter ved-20 °C.
- Forbered 0,1 M PBS ved fortynding af BupH PBS-pulver poser i 500 mL destilleret vand, hvilket resulterer i 0,1 M natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- For at tilberede 1 liter 4% PFA opløsning fortyndes 111 mL 36% flydende PFA og 90 mL 10x PBS opløsning i destilleret vand.
- Der tilbereder 30% saccharose opløsning indeholdende 150 g saccharose i 500 mL 0,1 M PBS.
4. forberedelse af hjerne skiver
- Forbered bænk rummet med absorberende bænk papir før perfusion.
- Installer et drop omkring 1 m over bænken for tyngdekraften-fodret perfusion. Fastgør en 24 G Butterfly nål.
- Omgiv det skærende kammer af vibratome med is og opbevar det i en fryser.
- Bedøve musen med intraperitoneal injektion af den samme ketamin-xylazine blanding anvendes til kirurgi. Vurder den fase af anæstesi ved at klemme tåen med tang. Ved fuld søvn indsprøjtes 100 μL heparin (5000 U.I./mL) intraperitonealt.
- Fastgør dyret med klæbe tape på det absorberende papir, liggende på ryggen. Åbn brystkassen ved at skære ribbenene på venstre og højre side med en lille saks, fra mellem gulvet opad. Opretholde thorax bur åben ved hjælp af tape.
- Klemme den faldende aorta med en hemostat og perfuse via venstre ventrikel af hjertet med 4 °C afkølet og oxygeneret (95%/5% O2/Co2), skære opløsningen gennem 24 G Butterfly nål. Efter 5 s, åbne det rigtige atrium med lille saks.
- Efter 5 minutters perfusion, når organerne er blodløse, stoppe perfusion. Decapitate dyret med stor saks og imfusionere hovedet i 4 °C afkølet og oxygeneret skæring løsning i en Petri skål.
- At udtrække hjernen, klippe huden fra nakke til næse, derefter sektion den sidste ryghvirvler fra kraniet med saks. Træk huden manuelt og brug en lille saks til at åbne kraniet, skære det langs midterlinjen, fra hale til rostral, opad til mellem øjnene.
- Fjern forsigtigt parietal knogle og hale del af frontal knogle med buede eller knogle pincet. Uddrag hjernen med en lille afrundet spatel ved at indsætte instrumentet mellem hjernen og kranie gulvet, skæring af olfaktoriske pære, synsnerven og andre kranielle nerver, og cerebellum.
- Nedsænk forsigtigt hjernen i en iskold skære opløsning (4 °C) i et bægerglas. Placer hjernen på filtrerpapir til forsigtigt at tørre den kortikale overflade. Lim hjernebarken-ned til prøven indehaveren af en vibratome, med den caudale side mod bladet, for at skære horisontale hjerne skiver.
- Fyld skære kammeret med iskold oxygeneret skære opløsning, så hjernen er fuldt indflettet. Lav et snit på den venstre halvkugle (kontralateral til den injicerede side) for at undgå potentiel venstre-højre tvetydighed på skiver.
Forsigtig: ilter altid opløsningen og Beskyt skiver mod lys eksponering. - Skær 300 μm tykke skiver med vibratome, med en hastighed på 0,07 mm/s ved 1 mm amplitude. På dette stadium anbefales det at tjekke Chronos-GFP-udtrykket i thalamus kortvarigt ved hjælp af et fluorescerende lommelygte (440-460 nm) og tilsvarende filter briller (500 nm Long pass).
- Isoler hippocampus-regionen med en skalpel og overfør den til et kammer anbragt i et bægerglas fyldt med bad-varmet (34 °C), oxygeneret (95%/5% O2/Co2) acsf.
- Efter 15 min, tage kammeret ud af det opvarmede vandbad og lad skiver hvile ved stuetemperatur, stadig ilmeret i mindst 45 min indtil brug.
5. hel-celle patch-klemme optagelse
- Overfør forsigtigt en hjerne skive, der indeholder hippocampus-komplekset, med en specialfremstillet glas overførings pipette til optagelses kammeret monteret på et opretstående mikroskop. En overførings pipette er fremstillet af en forkortet Pasteur-pipette (indvendig diameter 6,5 mm), der er fastgjort til en gummi pipette. Konstant perfuse optage kammeret (3 mL) med 34 °C (opvarmet) ACSF bukkede med 95%/5% O2/Co2. Indstil hastigheden for den peristaltiske pumpe til 2-3 mL/min.
- Undersøg kort Chronos-GFP-ekspression i Axon-terminaler i interesseområdet med blå LED-belysning (470 nm), og Observer med et 4X-mål. GFP fluorescens visualiseres gennem et passende emissions filter med et CCD-kamera billede, der vises på en computerskærm.
- Placer et skive anker fremstillet af en U-formet platin tråd med stramt fordelte nylon strenge ("Harp") på skiven for at vedligeholde den.
- Skift til en 63x nedsænkning mål og justere fokus. Check for axoner udtrykker Chronos-gfp og vælge en pyramideformet Neuron til patch optagelse.
- Flyt målsætningen opad.
- Træk pipetter med en brun flammende elektrode aftrækker fra borosilikatglas. Pulleren er indstillet til at producere pipetter med ca. 1 μm i spids diameter. Fyld pipetterne med K-gluconat-baseret intern opløsning.
- Monter pipetten i pipette holderen på hovedstadiet. Sænk pipetten i kammeret og Find spidsen under målet. Pipette modstanden skal være mellem 3 – 8 MΩ. Påfør et let positivt tryk med en sprøjte for at se en kegle af opløsning udstrømning ud af pipetten og gradvist sænke pipetten og målet til overfladen af skiven.
- Patch cellen i spænding-klemme konfiguration: nærme den identificerede neuron og forsigtigt trykke pipettespidsen på Soma. Det positive tryk skal producere en Dimple på membranens overflade. Frigør trykket for at oprette en Giga-ohm-tætning (> 1 GΩ-modstand). Når den er forseglet, indstilles holde spændingen til-65 mV. Bryd membranen med en skarp impuls af negativt tryk: Dette opnås ved at anvende kraftig sugning på et rør, der er forbundet med pipette holderen.
- Optag i fuld-celle nuværende klemme tilstand svar af Neuron til hyperpolariserende og depolariserende aktuelle trin (figur 2A).
Bemærk: denne protokol vil blive brugt til at bestemme cellens aktive og passive iboende egenskaber. Custom-skrevne MATLAB rutiner bruges til off-line analyse10,16. - Record i nuværende-eller spænding-klemme postsynaptiske svar til hele feltet 475 nm LED stimulation af afferent fibre udtrykker Chronos. Stimulere med tog på 10 stimuleringer af 2 MS varigheder ved 20 Hz (figur 2B, C). Lysintensiteten kan variere fra 0,1 – 2 mW.
Bemærk: lysintensitet blev målt med en digital håndholdt optisk strøm konsol udstyret med en fotodiode sensor, placeret under målet. Respons-ventetid på 2 – 4 MS er karakteristisk for en mono synaptisk forbindelse. - For at undersøge arten af den synaptiske transmission mellem de langtrækkende afferenter og den indspillede Neuron, kan der anvendes forskellige farmakologiske midler. For at farmakologisk skelne direkte, monosynaptiske svar fra indirekte respons via netværksaktivering, tilsættes 1 μM TTX og 100 μM 4-AP til ACSF.
Bemærk: bad anvendelse af glutamat receptorblokkere gør det muligt at bestemme karakteren af den neurotransmitter, der frigives, og identiteten af postsynaptiske receptorer. For eksempel, AMPA type glutamat receptorer vil blive blokeret af NBQX (10 μM) og NMDA-receptorer af APV (100 μM). Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan protokoller være udtænkt til at undersøge spændings afhængighed af synaptiske svar eller respons dynamik over tid. - Vask med original ACSF-opløsning for at lappe en anden celle, eller Overfør den skive, der indeholder en biocytinfyldt Neuron, i et lille hætteglas fyldt med 4% PFA.
- Efter natten fiksering i 4% PFA, vask skive i 0,1 M PBS (2x for 5 min, 1x for 20 min).
- Opbevares i 30% saccharose ved 4 °C.
6. biocytin åbenbaring
- De faste skiver, der indeholder biocytinfyldte neuroner, overføres til et glas blad i et fald på 30% saccharose og udføres tre cyklusser med fryse optøning: Anbring klingen på tøris, der er anbragt i en Styrofoam æske i 1 min. indtil dråber saccharose er helt frosset, så Tryk kniven mod håndfladen for at tø.
- Vask udsnittet 3x i 0,1 M PBS (2x for 5 min, 1x for 1 h og 50 min), forsigtigt ophidslede. Må ikke overskride 2 h for den sidste vask.
- Pre-incubate skive ved RT for 2 h i agiteret bufferopløsning indeholdende 2% mælkepulver (0,4 g i 20 mL) til mægle ikke-specifikke steder og 0,5% Triton X100 (0,1 mL i 20 mL) at permeabilize membraner i 0,1 M PBS.
- Inkuber natten over ved 4 °C i en opløsning, der indeholder 2% mælkepulver, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 konjugat (1/500) og DAPI (1/1000) i 0,1 M PBS, forsigtigt ophidslede.
- Vask skiven tre gange i 0,1 M PBS (2x for 5 min, 1x for 2 h). Den sidste vask kan vare længere, op til 4 h, for at reducere baggrunds farvning.
- Før du monterer udsnittet, skal du bruge et epifluorescens mikroskop ved 10x forstørrelse konfigureret til at observere Cy5 fluorescerende markører for at identificere den side af skiven, der indeholder den markerede celle i et kammer fyldt med PBS.
- Overfør udsnittet til et blad, celle side op, tør det med et papirvæv, og Monter det ved hjælp af højresistans monterings medium.
- Brug et epifluorescens mikroskop ved 10x forstørrelse i Cy5 og DAPI-konfiguration til at undersøge cellens placering og i GFP-konfiguration for at observere de markerede afferenter eller et højopløsnings konfokale mikroskop ved 20x for detaljeret somatisk, axonal og dendritiske morfologi (figur 2D, E). Filter indstillinger er beskrevet i tabellen over materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den procedure, der præsenteres her, blev brugt til at udtrykke en blå lys-følsom channelrhodopsin (Chronos) smeltet til gfp i Antero-dorsal kernen af thalamus (ADN), ved stereotaxisk injektion af anterograd adeno-associeret virus. De stereotype koordinater blev bestemt i henhold til et muse-hjerne Atlas og afprøvet ved injektion af 200 nL fluorescerende Tracer fluoro-Ruby. Dyret blev ofret 10 min efter injektionen, og hjernen blev ekstraheret og fikseret natten over. Coronal Brain sektioner var parat til at undersøge injektionsstedet, som var korrekt placeret i og begrænset til ADN (figur 1A, B).
For at udtrykke Chronos-GFP i neuroner i ADN, injicerede vi 300 nL af AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH. tre uger efter injektionen blev der forberedt akutte horisontale hjerne skiver. Figur 1 C viser en hjerne skive, der indeholder det thalamiske injektionssted på den højre halvkugle, med gfp-udtryk i grønt. Ved inspektion med et EPI-fluorescens mikroskop, der er udstyret med et 4X-mål, blev GFP mærket thalamiske axoner observeret i formodbiculum (figur 1C, D). Det blev bemærket, at thalamic axoner tæt innerverede de overfladiske lag i og III af formodbiculum (figur 1D).
Aktiviteten af formodede neuroner i Layer III blev indspillet i hele cellen patch-clamp konfiguration. Hyperpolariserende og depolariserende aktuelle trin blev anvendt under registrering af membran potentielle variationer (figur 2A). Data blev lagret på en computer til senere offline analyse af aktive og passive membran egenskaber. Formodede lag III-hoved celler havde typisk et negativt hvile potentiale tæt på-63 mV og krævede depolariserende strøm injektioner for at drive membranpotentialet til fyring tærskel. En fuldstændig beskrivelse af deres iboende egenskaber er blevet offentliggjort11.
Stimulerende ADN Axon terminaler udtrykker Chronos-GFP fremkaldte excitatoriske post-synaptiske potentialer (EPSPs) i formodede lag III vigtigste celler i den aktuelle klemme tilstand (figur 2B). Afhængigt af lysintensiteten kan Epsp'erne nå en aktions potentiel tærskel. Postsynaptiske responser blev også observeret i spændings klemme tilstand som excitatoriske post synaptiske strømme (EPSCs) blev fremkaldt (figur 2C). Debut latencer af epscs fremkaldt af lette stimuleringer var korte (median, 1,4 MS10), hvilket indikerer en direkte synaptisk kontakt mellem thalamic axoner og lag III formodede neuroner. Vedvarende EPSCs i TTX-4AP tilstand bekræftet denne monosynaptic aktivering. Det er bemærkelsesværdigt, at disse celler reagerede pålideligt på de lette stimuleringer af afferent axoner med en regelmæssig fyring mønster.
Figur 1 : Stereotaxisk injektion i anterodorsal thalamic Nucleus (ADN). (A) skematisk gengivelse af injektionen. B) bekræftelse af injektionsstedet med fluoro-Ruby i en koronal sektion. Inset indikerer Antero-dorsale niveau og afstand fra bregma. (C) vandret skive efter AAV-Chronos-gfp injektion i thalamus. De axonal fremskrivninger til ipsilaterale formodbiculum skal bemærkes. Et snit på venstre side af skiven (indikeret med en sort trekant) markerer den kontralaterale halvkugle. (B, C) Skala bjælke 1 mm.d) forstørret visning af justerings i (C) med ADN-projektioner til de formodede overfladiske lag. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Formodede lag III neuron: iboende egenskaber, respons på let stimulation af thalamiske afferenter og post-hoc-åbenbaring af cellernes morfologi. (A) fyring mønster og membran potentielle variationer af lag III neuron for hyperpolariserende og depolariserende aktuelle trin. (B, C) Respons af lag III Neuron til 2 MS lette stimuleringer (blå stænger) af thalamic axoner registreret i (B) strøm klemmer og (C) spændings-clamp modes. (D, E) Lag III pyramideformet neuron (hvid, indikeret med udfyldt gul trekant) omgivet af thalamiske axoner, som udtrykker Chronos-GFP (grøn) i formodede overfladiske lag med DAPI-farvning (blå) i vandret skive med et epifluorescens mikroskop ( D, Scale bar = 100 μm) og konfokal mikroskop ved en høj forstørrelse (E, Scale bar = 50 μm). Cellen i (A) er angivet med udfyldte gule trekanter. En anden, delvist fyldt neuron er til stede i denne skive indikeret med tomme gule trekanter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo viral injektion til at udtrykke lysfølsomme opsynder i et defineret hjerne område er en valgmetode til optogenetiske analyse af langtrækkende funktionelle tilslutningsmuligheder10,11,17,18. Stereotaxiske injektioner giver mulighed for præcist at målrette et bestemt område af hjernen. Coexpression af en opsin med en fluorescerende reporter bekvemt gør det muligt at evaluere den vellykkede ekspression og bekræftelse af det præcise injektionssted. Brugen af AAV serotype 2/5 begrænser typisk ekspression til den målrettede hjerneregion. På denne måde, en begrænset population af neuroner er transfected, udtrykker lysfølsomme ion kanaler i deres celle organer og Axon terminaler. I efterfølgende ex vivo Slice eksperimenter, er det muligt at stimulere disse Axon terminaler med lys impulser direkte i deres mål område, mens læse ud vellykket synaptisk transmission via patch-klemme optagelse af en post-synaptisk forbundet neuron. Ovenstående protokol er robust og bekvem, og nogle ekstra noter kan hjælpe med at opnå vellykkede eksperimenter.
Forskellige typer af anæstesi kan anvendes. Beskrevet her er intraperitoneal injektion af en ketamin-xylazine kombination som en nem at bruge, kortsigtet anæstesi med bekvem analgesi19. Dybden og varigheden af anæstesi kan variere til en vis grad. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at injicere en anden halv dosis af ketamin-xylazine i løbet af protokollen. Isoflurane anæstesi kan være et godt alternativ til at inducere hurtigere og bedre kontrol dybden af anæstesi. Koordinater af injektionssteder kan bestemmes ved hjælp af en mus hjernen Atlas. I praksis skal koordinaterne testes og justeres, hvis det er nødvendigt.
Rene arbejdsforhold er også vigtige. Det anbefales at bruge engangs beskyttelsesudstyr, herunder handsker, en Mob Cap, og en lab frakke. Ved positionering af dyret i den stereotype ramme, bør der lægges særlig vægt på komforten af dyret, som i høj grad vil forbedre effektiviteten af anæstesi. Dyrets krop skal justeres med hovedet og halsen. Det mest kritiske trin i positionering af dyret og før kraniotomi er justering af bregma-lambda-aksen. Især når du målretter dybe hjernestrukturer, vil selv en lille afvigelse generere fejl, når du sænker injektions nålen ind i hjernen. I nogle tilfælde kan man bevidst vælge og beregne en skrå nål bane.
Injektionsvolumenet er en afgørende faktor for opnåelse af præcist lokaliseret opsin-ekspression. En lille volumen er ideel til at privilegium en stramt begrænset transfektering zone. Større mængder kan være nyttige til at dække det fulde omfang af et stort målområde. Hvis et stort område skal dækkes, såsom septum18, kan det være nyttigt at placere flere små injektioner med en række tilstødende koordinater. Intervallet indtil den elektrofysiologiske ex vivo-optagelse er også kritisk. Det er nødvendigt med et minimum af tid til fuld udfoldelse. Mens 3 uger synes at være en optimal forsinkelse for disse eksperimenter11, den nødvendige forsinkelse kan variere afhængigt af virus, dens serotype, og afstanden til den postsynaptiske hjerneregion.
Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, er endnu kraftigere, når den kombineres med injektioner i transgene dyr. Tidligere arbejde har udnyttet forskellige muse linjer for undertyper af GABAergic neuroner, for specifikt at målrette enten PV-eller SST-udtrykker interneuroner for patch-clamp optagelser20. Samtidige dobbelt optagelse af tilstødende PV og pyramide neuroner eller SST og pyramide neuroner derefter tillader sammenligning af styrker af langtrækkende indgange mellem to neuron typer11. Dette giver resultater, der er standardiseret med hensyn til en neuron type. Denne standardisering er særlig vigtig i tilfælde, hvor udtryks niveauerne af opsiner varierer mellem forskellige dyr eller forskellige skiver.
Slice sundhed er afgørende for høj kvalitet patch-clamp optagelser. Konstant iltning af skiver er afgørende, og en langsom skærehastighed betydeligt forbedrer skive overfladekvalitet. En skive tykkelse på 300 μm bevarer, til en vis grad, mikrokredsløb integritet i horisontale formodede sektioner, herunder pyramideformede neuroner med deres celle organer, dendritiske og lokale axonal forgreninger, og lokale synaptisk forbindelser. Typen af lys-gated kanaler valgt til at fremkalde aktivering af afferent fibre vil i høj grad påvirke stimulation parametre (varighed, lysintensitet). Chronos er en blå lys-følsom channelrhodopsin, og en bred vifte af belysning bølgelængder kan bruges til aktivering (peak følsomhed omkring 500 nm, selv med minimal lysintensitet på 0,05 mW/mm2, også aktiveret ved 405 nm, og op til 530 nm21 ). Desuden har Chronos hurtige kinetik egenskaber i forhold til klassisk ChR2, som muliggør højfrekvente stimuleringer og pålidelig aktivering af langtrækkende projektioner22. I kombination med udtrykket af Chrimson, en rød-forskudt opsin variant, den uafhængige optiske excitation af forskellige neurale populationer bliver gennemførlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bertrand Mathon, mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean simonnet for deres hjælp i udviklingen af tidligere versioner af stereotaksisk Injection Protocol og Marin manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjælp. Dette arbejde blev støttet af det franske ministerium for uddannelse og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) og Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
