In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver

Formålet med denne metode er at identificere den funktionelle tilslutning af langtrækkende input fra fjerne hjerneregioner ved hjælp af fotostimulation i hjerneskiver. Den stereotaxiske målretning af en bestemt hjerneregion for forskellige medierede udtryk for lysfølsomme ionkanaler giver mulighed for selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Demonstration af proceduren vil være Louis Richevaux, en ph.d.-studerende fra min gruppe.

Før operationen, kontrollere, at dyret er godt bedøvet med en tå knivspids. Træk forsigtigt tungen ud for at lette vejrtrækningen. Barber derefter kraniehåret.

Injicer 20 mikroliter lidocainhydrorid under hovedets hud til lokalbedøvelse og vent fem minutter. At afsløre kraniet, lave et snit på hovedbunden. Derefter placere dyret i en stereotaxic ramme.

Sæt ørestængerne og hvile dem på knoglerne lidt rostral til ørerne og træk ned huden for at skabe god adgang til kraniet. Stram ørestængerne og monter næsestykket. Vedligehold dyrets krop vandret og på hovedets niveau ved hjælp af en højdejusteret støtte.

Placer en varmepude under dyret for at holde det på fysiologisk temperatur. Rengør derefter kraniet ved at anvende 0,9% natriumchlorid med en vatpind for at fjerne blødt væv. Juster kraniet, så bregma lambda adgang er jævnet med nivelleret.

Derefter skal du finde injektionsstedet på kraniet i henhold til de bageste og mediale koordinater og placere injektionsnålen over den. Marker kraniet med en engangsnål. Flyt derefter injektionsnålen opad med fire centimeter.

Ved hjælp af en 0,5 millimeter grat, skabe en en millimeter diameter kraniotomi på mærket på den ene halvdel af den maksimale hastighed. Podning med et væv, hvis der opstår blødning. Dernæst tømme vandet i Hamilton sprøjten til opbevaring ved helt at skubbe det med en pumpe.

Kun nålen er fyldt med vand. Optø den virale opløsning, der skal injiceres på is, derefter kort fjerne det fra isen og få 700 nanoliters af opløsningen med en mikropipette. Dernæst deponere en dråbe på et stykke paraffin film.

Placer paraffinfilmen oven på kraniotomien. nålen i dråben af viral opløsning uden at ændre anteroposterior og lateral position. Derefter skal du bruge pumpens trækfunktion til at fylde sprøjten med ca. 500 nanoliter af den virale opløsning på paraffinfilmen.

Udfør denne procedure under stereoscope, se dråben forsvinde, og sørg for ikke at aspirere nogen luft. Sørg for, at sprøjten er fyldt korrekt. Test udslyngningssystemet ved at køre stemplet ned for at teste skubbe en lille dråbe væske ud.

Derefter sættes nålen ind i hjernen til den valgte dybde. Tryk på kørselsknappen for injektion. Træk derefter langsomt nålen over tre til fem minutter tilbage.

Vask straks nålen i rent destilleret vand ved at tømme den flere gange for at undgå tilstopning. Derefter skal du fjerne dyret fra stereotaxic rammen. Sutur huden og gøre tre eller fire sting bundet med 2-1-1 standard kirurgiske knob.

At udtrække hjernen, lave et snit på huden fra hals til næse, derefter afsnit den sidste ryghvirvler fra kraniet med en saks. Træk huden tilbage og skær kraniet langs midterlinjen fra hale til rostral retning. Fjern forsigtigt parietal knoglen og caudal del af frontal knoglen.

Uddrag hjernen med en lille afrundet spatel ved at indsætte den mellem hjernen og kraniegulvet, der udsniter olfaktoriske pære, synsnerven, og andre kranienerver og lillehjernen. Nedsænk forsigtigt hjernen i iskold skæreopløsning. Derefter overføres hjernen til et filterpapir og tør forsigtigt den kortikale overflade.

Lim hjernebarken til prøveholderen af en vibratom med halesiden mod bladet for at skære vandrette hjerneskiver. Dernæst fylde skærekammeret med iskold iltet skæreopløsning, så hjernen er helt nedsænket. Sektion 300 mikrometer tykke skiver med vibratom ved en hastighed på 07 millimeter per sekund på en millimeter amplitude.

På dette stadium anbefales det kort at kontrollere Chronos-GFP-udtrykket i thalamus ved hjælp af en fluorescerende lommelygte og tilhørende filterbriller. For at udføre helcellespatch-clamp optagelse, forsigtigt overføre en hjerne skive, der indeholder hippocampal kompleks til optagelsen kammer. Kontinuerligt gennemgå optagelse kammer med 34 grader Celsius ACSF boblede med carbogen på to til tre milliliter i minuttet.

Undersøg kort Chronos-GFP-udtrykket i axonterminaler i interesseområdet med blå LED-belysning ved 4X-forstørrelse. Skift til en 63X nedsænkningsmålsætning, og juster fokus. Kontroller for axoner udtrykke Chronos-GFP og vælge en pyramideformet neuron for patch optagelse.

Dernæst fylde en pipette med kalium gluconat baseret intern løsning. Monter den i pipetteholderen på hovedscenen. Lappe cellen i spænding klemme konfiguration.

Indflyvning den identificerede neuron og forsigtigt trykke pipette spidsen på soma. Det positive tryk skal give en smilehul på membranoverfladen. Slip derefter trykket for at skabe en gigoOm-forsegling.

Når den er forseglet, indstilles holdespændingen til minus 65 millivolt. Bryd membranen med en skarp puls af undertryk. Optag neuronens reaktioner på hyperpolarisering og depolarisering af aktuelle trin i helcellestrømskletilstand.

Optag i strøm eller spænding klemme postsynaptiske reaktioner på 475 nanometer LED hele felt stimulation af afferent fibre udtrykke Chronos. Stimulere med tog af ti stimulationer af to millisekund varighed på 20 hertz. Aktiviteten af præubkulære neuroner i lag tre som reaktion på hyperpolarisering og depolarisering af aktuelle trin blev registreret i hele celle patch-clamp konfiguration.

Stimulering adn axon terminaler udtrykke Chronos-GFP fremkaldte excitatoriske post-synaptiske potentialer i præubicular lag tre vigtigste celler i den nuværende klemme tilstand. Afhængigt af lysintensiteten kan EPSP’erne nå en potentiel tærskelværdi for indsatsen. Post-synaptiske reaktioner blev også observeret i spænding klemme mode, som excitatoriske post-synaptiske strømme blev fremkaldt.

Vist her er et lag tre pyramideformede neuron omgivet af thalamic axoner udtrykke Chronos-GFP i præubkulære overfladiske lag med DAPI farvning afbildet med en epifluorescens mikroskop. Og dette billede blev taget ved en højere forstørrelse med et konfokal mikroskop. Omhyggelig nivellering af bregma langs aksen i udførelsen af pilotforsøg med en fluorescerende sporstof er afgørende for at forbedre præcisionen af den stereotaxiske injektion.

Denne procedure kan også bruges til at undersøge konvergerende fremskrivninger fra forskellige områder ved at injicere på to generative scene følsomme over for to forskellige bølgelængder. Udviklingen af denne teknik har gjort det muligt præcis anatomisk og funktionel kredsløbsanalyse mellem fjerne hjerneregioner på en celletypespecifik måde.