Summary
Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.
Abstract
Kennis van cel-type specifieke synaptische connectiviteit is een cruciale voorwaarde voor het begrijpen van de hersenen-brede neuronale circuits. Het functionele onderzoek van lange-afstands verbindingen vereist gerichte opnames van enkelvoudige neuronen gecombineerd met de specifieke stimulatie van geïdentificeerde verre ingangen. Dit is vaak moeilijk te bereiken met conventionele en elektrische stimulatie technieken, omdat axonen van het convergeren van upstream hersengebieden kunnen intermengen in de doelregio. De stereotaxic targeting van een specifiek hersengebied voor de virus gemedieerde expressie van lichtgevoelige ionenkanalen maakt selectieve stimulatie mogelijk van axonen afkomstig uit die regio met licht. Intracerebrale stereotaxic injecties kunnen worden gebruikt in goed afgebakende structuren, zoals de anterieure thalamische kernen, naast andere subcorticale of corticale gebieden in de hersenen.
Hier beschreven is een reeks technieken voor precieze stereotaxic injectie van virale vectoren die channelrhodopsin uitdrukken in de muis hersenen, gevolgd door foto stimulatie van Axon terminals in de voorbereiding van de hersen slice. Deze protocollen zijn eenvoudig en breed toepasbaar. In combinatie met whole-Cell Patch clamp opname van een postsynaptisch verbonden neuron, maakt foto stimulatie van axonen het mogelijk om functionele synaptische verbindingen, farmacologische karakterisering en evaluatie van hun kracht te detecteren. Bovendien kan biocytine vulling van het opgenomen neuron worden gebruikt voor post-hoc morfologische identificatie van het postsynaptische neuron.
Introduction
Definiëren van connectiviteit tussen hersen regio's is nodig om te begrijpen van neurale circuits. Klassieke anatomische traceer methoden maken het mogelijk om interregionale connectiviteit te creëren, en laesie studies helpen om de hiërarchische organisatie van informatiestromen te begrijpen. Bijvoorbeeld, hersencircuits voor ruimtelijke oriëntatie en hoofdrichting signalering betrekken de directionele stroom van informatie van de thalamus naar de presubiculum. Dit is aangetoond door laesie studies van Antero-dorsale thalame kernen (ADN) die het hoofd richtings signaal in de downstream dorsale presubiculum degraderen, evenals de parahippocampal grid Cell Signal1,2.
De functionele connectiviteit tussen hersengebieden is moeilijker vast te stellen op een cellulair en subcellulair niveau. In de Hippocampus maakt een zeer georganiseerde anatomie het mogelijk om pathway-specifieke synaptische verbindingen te onderzoeken met behulp van elektrische simulatie in de segment voorbereiding. Stimulatie elektroden geplaatst in stratum radiatum van CA1 kunnen worden gebruikt om specifiek Schaffer onderpand input van CA33te stimuleren. Stimulerende elektroden geplaatst in stratum lacunosum moleculare van Ca1 zal de perforant pad ingang naar Ca14,5activeren. Elektrische stimulatie activeert de neurotransmitter-afgifte van Axon-terminals; echter, het activeert neuronen met somata in de buurt van de stimulatie plaats, evenals axonen van passage. Het is daarom van beperkte toepassing voor het bestuderen van afferents uit afgebakende hersengebieden wanneer vezels van verschillende regio's van oorsprong elkaar mengen in de doel structuur, zoals meestal het geval is in de neocortex.
Neuronen kunnen ook worden gestimuleerd met licht. Optische methoden omvatten de fotoactivering van gekooide glutamaat, die kan worden gecombineerd met een-of twee-Photon Laser Scanning. Meerdere dicht verdeelde plaatsen kunnen opeenvolgend worden gestimuleerd, zonder mechanische beschadiging van het weefsel6. Dit is met succes gebruikt voor het toewijzen van synaptische receptoren evenals activeren individuele neuronen7. Terwijl glutamaat uncaging kan worden gebruikt voor lokale circuit analyse, het is niet toegestaan voor specifieke activering van lange-bereik ingangen.
Een methode van keuze voor het onderzoek van lange afstand connectiviteit in neuronale circuits is het gebruik van virus-gemedieerde channelrhodopsin expressie. Met behulp van in vivo stereotaxic injecties zoals hier beschreven, de uitdrukking van licht-gated ionenkanalen kunnen worden gericht en ruimtelijk beperkt tot een gewenste hersenregio. Op deze manier, channelrhodopsins zijn effectief voor het in kaart brengen van excitatory of remmende connectiviteit van de ene regio naar het doelwit. Getransfeerde axonen terminals kunnen met licht worden gestimuleerd in een hersen segment voorbereiding, en patch-klem opnames als een read-out laten onderzoek toe van de functies en sterktes van specifieke circuit componenten in de hersenen8. De optogenetische benadering gecombineerd met stereotaxic injectie van een virus biedt ongekende specificiteit en genetische controle9. Stimulerend met licht zorgt bovendien voor zowel hoge temporele als ruimtelijke precisie10,11.
De presubiculum is een corticale structuur van zes lagen bij de overgang van de hippocampus en de para-hippocampal formatie12,13. Het ontvangt belangrijke synaptische input van het ADN11 maar ook uit verschillende andere corticale en subcorticale regio's14. Zo is de selectieve stimulatie van thalame axonen terminals binnen een presubicular slice niet mogelijk met elektrische stimulatie of glutamaat uncaging. Beschreven in dit protocol zijn methoden om te bepalen van de functionele connectiviteit tussen hersengebieden (ADN en presubiculum) met behulp van precieze stereotaxic injecties van virale vectoren uitdrukken van licht-gated kanalen. Ook beschreven is de foto stimulatie van axonen terminals van het projecteren van neuronen in hun doelregio, in combinatie met whole-Cell Patch-clamp opnames van post synaptische neuronen in de hersenen slice voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap (2010/63/EU) en goedgekeurd door de ethische commissie van de Paris Descartes University. De experimenteerder moet een autorisatie krijgen voor de procedure om te voldoen aan de lokale voorschriften.
1. planning van het experiment
- Definieer het hersengebied dat moet worden getarget. Bepaal de stereotaxic coördinaten van de injectieplaats met behulp van een muis hersenen Atlas15. Voor de rechter Antero-dorsal thalamische Nucleus (ADN) zijn de coördinaten:-0,82 posterior, 0,75 laterale,-3,2 diepte (mm) ten opzichte van bregma. Coördinaten moeten mogelijk aangepast worden voor dieren van verschillende leeftijd, geslacht of stam.
- Bevestig en Documenteer de ijzeren van de coördinaten door een fluorescerende Tracer (150 tot 300 nl) te injecteren met een epifluorescentie Microscoop in een proef experiment (Figuur 1a, B).
- Definieer het type virus dat moet worden geïnjecteerd. Bewaar het virus in 6 μL aliquots bij-80 °C, zoals aanbevolen door de producent. Breng 1 aliquot op het ijs naar de operatiekamer, voor injectie van één tot zes dieren op een bepaalde dag. De bioveiligheidsvoorschriften voor het gebruik van AAV kunnen afhankelijk zijn van het land of de instelling, en het gebruik van een PSM 2-afzuigkap kan vereist zijn.
Let op: hier gebruiken we een AAV2/5 serotype dat Chronos uitdrukt, een snelle channelrhodospin-2 variant, samengesmolten tot groene fluorescerende eiwitten onder controle van de Synapsin Promoter: AAV5. SYN. Chronos-GFP. WPRE. bGH.
2. stereotaxic chirurgie
- Installeer een stereotaxic frame uitgerust met een pomp houder op een stabiele standaard laboratorium Bank. Pas de stereoscoop aan om de zone waar het hoofd van het dier wordt geplaatst duidelijk te zien. Gebruik een LED-lichtbron voor verlichting. Draai de stereoscoop weg om toegang te krijgen tot de pomp houder, die niet nodig is voor de eerste stappen van de operatie.
- Installeer een 10 μL Hamilton injectiespuit uitgerust met een 33 G afgeschuurd metalen naald in de pomp houder. Test het ejectiesysteem met water.
- Anesthetiseer een 4-tot 5 weken oude C57BL6 muis met een intraperitoneale injectie van een mix van ketamine hydrochloride en xylazine (respectievelijk 100 mg/kg en 10 mg/kg). Bereid een mengsel van 1 mL ketamine en 0,5 mL xylazine in 8,5 mL 0,9% NaCl. Dit zal resulteren in 10 mg/mL ketamine en 1 mg/mL xylazine in de mix. Van deze mix injecteert u intraperitoneaal 10 μL per gram lichaamsgewicht van het dier. Duur van de anesthesie is ongeveer 1 uur.
- Controleer of het dier goed verdoiliseerd is met een teen pinch. Trek vervolgens de tong uit om de ademhaling te vergemakkelijken. Scheer het craniale haar.
- Injecteer 20 μL lidocaïne waterstofchloride (4 mg/mL; 2 mg/kg) onder de huid van het hoofd voor plaatselijke verdoving en wacht 5 minuten tot het effect begint. Om oogletsel te voorkomen als gevolg van droogheid, bedekken de ogen met topische oogzalf.
- Om de schedel bloot te leggen, maak een rechte snede in de hoofdhuid met kleine chirurgie schaar. Plaats het dier in een stereotaxsch kader, breng de oorstangen lichtjes rostrale migratoire aan op het eigenlijke oor om op het bot te rusten en trek de huid aan, die een goede toegang tot de schedel zou moeten creëren. Op zijn plaats vastdraaien. Installeer het neusstuk.
- Houd het lichaam van het dier horizontaal op het niveau van het hoofd met behulp van een in hoogte aangepaste ondersteuning. Plaats een verwarmingspad onder de muis om het op fysiologische temperatuur te houden.
- Reinig de schedel door 0,9% NaCl met een wattenstaafje toe te passen om zacht weefsel uit het bot te verwijderen. Gebruik de stereoscoop voor de rest van de operatie.
- Pas de schedel aan zodat de bregma-Lambda-as niveau is, omhoog of omlaag in de neus en het tanden stuk beweegt. Dit vereist iteratieve maatregelen van bregma en Lamba, omdat beide zullen veranderen na aanpassing van het neus niveau.
- Zoek de locatie van de injectieplaats op de schedel. Stel de injectienaald boven de injectieplaats in volgens posterieure en mediale coördinaten en markeer de schedel met een wegwerp naald. Beweeg de injectienaald omhoog met 4 cm.
- Gebruik een 0,5 mm Burr met een boor om een 1 mm diameter craniotomie op het merk te realiseren, met een halve maximale snelheid. Swab uiteindelijke bloeding met een papieren weefsel.
- Leeg het water dat zich in de Hamilton-spuit bevindt voor opslag door het volledig uit te werpen met de pomp. Alleen de naald wordt nog gevuld met water. De naald wordt gewassen tussen elk gebruik met zuiver gedeïoniseerd water. Sterilisatie is niet vereist.
- Neem de hoeveelheid virus die voor deze dag moet worden gebruikt. Zorg ervoor dat de virale oplossing niet meer bevroren is, maar wel gekoeld is gebleven (dicht bij 0 °C, op ijs). Haal slechts kort uit het ijs om 700 nL te verkrijgen met een micro pipet voor kleine volumes. Stort de druppel op een stukje paraffine folie van 5 cm x 5 cm. Vermijd het maken van bubbels. Zet de overgebleven virale oplossing weer op ijs.
Opmerking: het druppel volume moet groter zijn dan het gewenste injectievolume (700 nL voor 200 nL geïnjecteerd). Dit geeft een veiligheidsmarge voor het geval een deel van de vloeistof tijdens de overdracht verloren gaat en maakt het mogelijk een kleine test ejectie uit te voeren (stap 2,16) voordat u verdergaat. - Plaats de paraffine folie bovenop de craniotomie. Dompel de naald in de druppel virale oplossing zonder de Antero-posterior en laterale positie te veranderen.
- Gebruik de functie "terugtrekken" van de pomp om de spuit te vullen met ongeveer 500 nL virale oplossing op de paraffine folie. Doe dit onder visuele controle (stereoscoop), kijk hoe de druppel verdwijnt en zorg ervoor dat u geen lucht aspireren.
- Zorg ervoor dat de spuit correct is gevuld. Controleer de werking van het ejectiesysteem door de zuiger af te rijden om een kleine druppel vloeistof van 50 nL onder visuele controle uit te werpen. Veeg de druppel af.
- Steek de naald in de hersenen tot de gekozen diepte, door de knop te draaien die de dorso-ventrale as van het stereotaxsch apparaat met de klok mee bestuurt. Druk op de knop "uitvoeren" (snelheid 15 nL/min per volume van 150 nL geïnjecteerd). Een klein volume (50-300 nL, afhankelijk van het gebruikte virus) wordt langzaam over 10 minuten uitgeworpen met een automatische pomp.
- Wacht 10 minuten na de injectie om lekkage van de injectieplaats te voorkomen. Verwijder vervolgens langzaam de naald over 3-5 min door de knop te draaien die de dorso-ventrale as tegen de klok in bestuurt.
- Draai het verticale deel van het stereotaxsche frame met de spuit uit de buurt van het dier. Was de naald onmiddellijk in schoon gedestilleerd water door deze meerdere malen te vullen, om verstopping te voorkomen. Bewaar de spuit gevuld met water.
- Verwijder de muis uit het stereotaxic frame. Hecht aan de huid met 4-0 polyamide hechtdraad. Maak drie of vier stiches, vastgebonden met 2-1-1 standaard chirurgische knopen.
- Plaats de muis in een verwarmde kooi totdat deze volledig wakker wordt van anesthesie, en geef water en geweekt voedsel in een Petri schaaltje op de grond. Als de warmtebron zich onder de kooi bevindt, gebruik dan een spacer grid om oververhitting te voorkomen.
Opmerking: volgens de lokale richtlijnen kan een enkelvoudige dosis ketoprofen (2-5 mg/kg, subcutaan) of buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg, subcutaan) worden toegepast om pijn te voorkomen. - Wanneer het dier volledig wakker is, terug te keren naar zijn huis kooi en bewaken van het welzijn, met name op de dag na de injectie. Controleer op tekenen van pijn. Als een gedragswijziging wordt waargenomen, wordt het dier gewogen om zijn lichaamsgewicht te bewaken.
- Afhankelijk van het gebruikte virus kan de tijd voor volledige expressie variëren. Hier staan we 3 weken toe voor uitdrukking van AAV5. SYN. Chronos-GFP.
3. oplossingen voor acute segment opnames en fixatie
- Bereid stockoplossingen van 10x geconcentreerde snij oplossing (125 mM NaCl, 25 mM sucrose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mm Nah2po4 en 2,5 mm D-glucose) en kunstmatige CEREBROSPINALE vloeistof (Acsf) oplossing (124 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 26 mm NaHCO3, 1 mm Nah2po4 en 11 mm D-glucose) in zuiver gedeïoniseerd water voorafgaand aan elektrofysiologie experimenten. Bewaar deze oplossingen bij 4 °C in flessen van 1 L zonder CaCl2 en MgCl2.
- Verdun op de dag van het experiment de stamoplossingen van de snij oplossing en de ACSF 10x tot een eindvolume van 0,5 L per stuk. Agitate met een magnetische roerder en oxygenize door te borrelen met 95%/5% O2/co2. Voeg divalente ionen toe om de eindconcentraties van 0,1 mM CaCl2 en 7 mm MgCl2 voor de snij oplossing te verkrijgen, en 2 mm CACL2 en 2 mm MgCl2 voor acsf.
- Bereid de op kalium-gluconaat gebaseerde pipet oplossing voor: 135 mM K-gluconaat, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mm MgATP, 0,4 mm tris-GTP, 10 mm na2-fosfocreatine en 2,7 – 7,1 mm biocytine voor post-hoc-cel morfologie openbaring. Stel de pH van de oplossing in op 7,3 en osmolariteit tot 290 mOsm. Bewaar 1 mL aliquots bij-20 °C.
- Maak 0,1 M PBS met een verdunning van de BupH PBS droge Meng poeder zakjes in 500 mL gedistilleerd water, resulterend in 0,1 M natriumfosfaat, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- Om 1 L van 4% PFA oplossing te bereiden, Verdun 111 mL 36% vloeibare PFA en 90 mL van 10x PBS oplossing in gedistilleerd water.
- Bereid 30% sacharoseoplossing met 150 g sucrose in 500 mL 0,1 M PBS.
4. bereiding van hersen schijfjes
- Bereid de tafelruimte met absorberend Bank papier voor perfusie.
- Installeer een druppelinfuus ongeveer 1 m boven de Bank voor de zwaartekracht perfusie. Bevestig een vlindernaald van 24 G.
- Rond de snij kamer van de vibratome met ijs en bewaar deze in een vriezer.
- Anesthetiseer de muis met intraperitoneale injectie van hetzelfde ketamine-xylazine mengsel dat wordt gebruikt voor chirurgie. Evalueer het stadium van de anesthesie door de teen met een tang te knijpen. Injecteer bij volle slaap 100 μL heparine (5000 I.E./mL) intraperitoneaal.
- Bevestig het dier met plakband op het absorberende papier, liggend op zijn rug. Open de thoracale kooi door de ribben aan de linker-en rechterkant te snijden met een kleine schaar, vanaf het diafragma naar boven. Houd de thoracische kooi open met behulp van plakband.
- Klem de aflopend aorta met een hemostat en parfuseren via de linker ventrikel van het hart met 4 °C gekoeld en zuurstof zuur (95%/5% O2/co2), het snijden van de oplossing door de 24 G vlindernaald. Open na 5 s het rechter atrium met een kleine schaar.
- Na 5 minuten van perfusie, wanneer de organen zijn bloodless, stop de perfusie. Onthapitate het dier met grote schaar en dompel het hoofd in 4 °C gekoelde en zuurstofrijke snij oplossing in een Petri schaaltje.
- Om de hersenen te extraheren, snijd de huid van nek naar neus, dan sectie de laatste wervels uit de schedel met een schaar. Trek de huid handmatig in en gebruik een kleine schaar om de schedel te openen, langs de middenlijn te snijden, van caudal tot rostral, naar boven tussen de ogen.
- Verwijder voorzichtig het pariëtale bot en het caudale deel van het frontale bot met gebogen of bot Tang. Extract de hersenen met een kleine afgeronde spatel door het inbrengen van het instrument tussen de hersenen en de schedel vloer, snijden de olfactorische bol, oogzenuw en andere hersenzenuwen, en cerebellum.
- Dompel de hersenen zachtjes in de ijskoude snij oplossing (4 °C) in een bekerglas. Plaats de hersenen op filtreerpapier om het corticale oppervlak zachtjes te drogen. Lijm de hersen cortex-down aan de preparaathouder van een vibratome, met de caudale kant naar het blad gericht, om horizontale hersen segmenten te snijden.
- Vul de snij kamer met ijskoude zuurstof snijdende oplossing zodat de hersenen volledig worden ondergedompeld. Maak een snede op de linker hemisfeer (contralateraal aan de geïnjecteerde zijde) om mogelijke links-rechts ambiguïteit op plakjes te voorkomen.
Let op: altijd de oplossing zuurstofhoudende verbinding en segmenten beschermen tegen blootstelling aan licht. - Snijd 300 μm dikke plakjes met de vibratome, met een snelheid van 0,07 mm/s bij 1 mm amplitude. In dit stadium, is het raadzaam om kort te controleren de Chronos-GFP expressie in de thalamus met behulp van een fluorescerende zaklamp (440-460 nm) en bijbehorende filter bril (500 nm lange pas).
- Isoleer de hippocampal regio met een scalpel en breng deze over naar een kamer in een bekerglas gevuld met bad-opgewarmd (34 °c), zuurstofrijk (95%/5% O2/co2) acsf.
- Neem na 15 minuten de kamer uit het verwarmde waterbad en laat de plakjes op kamertemperatuur rusten, nog steeds gedurende ten minste 45 min tot het gebruik.
5. whole-Cell patch-klem opname
- Breng voorzichtig een hersen segment over met het hippocampal complex met een pipet op maat van een glazen Transfer naar de opname kamer die op een rechtopstaande Microscoop is aangebracht. Een pipet voor overdracht is gemaakt van een verkorte Pasteur-Pipet (inwendige diameter 6,5 mm) die is bevestigd aan een rubberen pipet. Parfumeerde de opname kamer (3 mL) continu met 34 °C (opgewarmd) ACSF met 95%/5% O2/co2. Stel de snelheid van de peristaltische pomp in op 2-3 mL/min.
- Bekijk kort de Chronos-GFP-uitdrukking in axon-terminals in de regio van belang met blauwe LED-verlichting (470 nm) en observeer met een 4x-doelstelling. GFP fluorescentie wordt gevisualiseerd door middel van een geschikte emissie filter, met een CCD camerabeeld weergegeven op een computerscherm.
- Plaats een segment anker gemaakt van een U-vormige platina draad met strak verdeelde nylon snaren ("harp") op het segment om het te onderhouden.
- Verander naar een 63x Onderdompelings doelstelling en pas de scherpstelling aan. Controleer op axonen die Chronos-GFP uitdrukken en kies een piramidevormige neuron voor het opnemen van de patch.
- Verplaats de doelstelling naar boven.
- Trek pipetten met een bruin-Vlamende elektrode trekker van borosilicaatglas. De trekker is ingesteld om pipetten te produceren met ongeveer 1 μm in de tipdiameter. Vul de pipetten met de op K-gluconate gebaseerde interne oplossing.
- Monteer de pipet in de pipet houder op het hoofdpodium. Verlaag de pipet in de kamer en vind de punt onder het doel. De pipet weerstand moet tussen de 3 – 8 MΩ liggen. Breng een licht positieve druk met een spuit aan om een kegel van de oplossing uit de pipet te halen en de pipet en de doelstelling geleidelijk te verlagen tot aan het oppervlak van het segment.
- Patch de cel in voltage-clamp configuratie: Benader het geïdentificeerde neuron en druk voorzichtig de pipetpunt op het SOMA. De positieve druk moet een Dimple op het membraanoppervlak produceren. Laat de druk los om een Giga-Ohm zegel te maken (> 1 GΩ weerstand). Eenmaal verzegeld, stelt u de vasthoud spanning in op-65 mV. Breek het membraan met een scherpe puls van negatieve druk: dit wordt bereikt door sterke zuigkracht toe te passen op een buis die is aangesloten op de pipet houder.
- Opnemen in de stroomtang van de hele cel de reacties van het neuron op hyperpolariserende en depolariserende stroom stappen (Figuur 2A).
Opmerking: dit protocol wordt gebruikt om de actieve en passieve intrinsieke eigenschappen van de cel te bepalen. Op maat gemaakte MATLAB-routines worden gebruikt voor off-line analyse10,16. - Opnemen in stroom-of spannings klem postsynaptische responsen op hele veld 475 nm LED stimulatie van afferente vezels die Chronos uitdrukken. Stimuleer met treinen van 10 stimulaties van 2 MS-duur bij 20 Hz (Figuur 2B, C). De lichtintensiteit kan variëren van 0,1 – 2 mW.
Opmerking: de lichtintensiteit werd gemeten met een digitale handheld optische Power console uitgerust met een fotodiode sensor, gepositioneerd onder de doelstelling. Respons latenties van 2 – 4 MS zijn kenmerkend voor een monosynaptische verbinding. - Om de aard van de synaptische transmissie tussen de lange-afstand afferents en het opgenomen neuron te onderzoeken, kunnen verschillende farmacologische agentia worden gebruikt. Voor het farmacologisch onderscheid tussen directe, monosynaptische responsen van indirecte responsen via netwerk activatie, voeg 1 μM TTX en 100 μM 4-AP toe aan de ACSF.
Opmerking: Bad toepassing van glutamaat receptor blokkers maakt het mogelijk om te bepalen van de aard van de neurotransmitter die wordt vrijgegeven en de identiteit van postsynaptisch receptoren. Bijvoorbeeld, AMPA type glutamaat receptoren zal worden geblokkeerd door NBQX (10 μM) en NMDA-receptoren door APV (100 μM). Afhankelijk van het doel van de studie, kunnen protocollen worden bedacht om de spannings afhankelijkheid van synaptische responsen of respons dynamiek na verloop van tijd te onderzoeken. - Was met de originele ACSF oplossing om een andere cel te patchen, of breng het segment met een biocytine gevuld neuron over in een kleine injectieflacon gevuld met 4% PFA.
- Na overnachting fixatie in 4% PFA, was het segment in 0,1 M PBS (2x voor 5 min, 1x voor 20 min).
- Bewaren in 30% sucrose bij 4 °C.
6. biocytine openbaring
- Breng de vaste schijfjes met biocytin-gevulde neuronen over in een glas blad in een druppel van 30% sucrose en voer drie cycli Vries ontdooien uit: plaats het blad gedurende 1 minuut op droogijs in een piepschuim doos totdat druppels sucrose volledig bevroren zijn, Druk het mesje tegen de handpalm om te ontdooien.
- Was de slice 3x in 0,1 M PBS (2x voor 5 min, 1x voor 1 h en 50 min), zachtjes geagiteerd. Niet overschrijden 2 h voor de laatste wassen.
- Pre-incuberen het segment bij RT voor 2 uur in een geagiteerde Bufferoplossing met 2% melkpoeder (0,4 g in 20 mL) om niet-specifieke plaatsen te verzadigen en 0,5% Triton X100 (0,1 mL in 20 mL) om de membranen in 0,1 M PBS te permeiseren.
- Inbroed 's nachts bij 4 °C in een oplossing met 2% melkpoeder, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 conjugaat (1/500), en DAPI (1/1000) in 0,1 M PBS, zachtjes geagiteerd.
- Was het schijfje driemaal in 0,1 M PBS (2x voor 5 min, 1x voor 2 uur). De laatste wassing kan langer duren, tot 4 uur, om achtergrondkleuring te verminderen.
- Voordat u het segment gaat monteren, gebruikt u een epifluorescentie Microscoop met een 10x vergroting die is geconfigureerd om Cy5 fluorescerende markers te observeren om de zijkant van het segment te identificeren dat de gemarkeerde cel bevat in een kamer gevuld met PBS.
- Breng het segment op een blad, de cel naar boven, droog het met een papier weefsel en monteer het met behulp van een hoog-weerstand bevestigings medium.
- Gebruik een epifluorescentie Microscoop met een 10x vergroting in Cy5 en DAPI-configuratie om de locatie van het cellichaam te onderzoeken, en in GFP-configuratie om de gemarkeerde afferents te observeren, of een confocale Microscoop met hoge resolutie bij 20x voor gedetailleerde somatische, axonale en dendritische morfologie (Figuur 2D, E). Filter instellingen worden gedetailleerd beschreven in de tabel met materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde procedure werd gebruikt om een blauw lichtgevoelige channelrhodopsin (Chronos) gesmolten naar GFP in de Antero-dorsal kern van de thalamus (ADN), door stereotaxic injectie van anterograde adeno-geassocieerde virus uit te drukken. De stereotaxic coördinaten werden bepaald volgens een muis hersen Atlas en getest door het injecteren van 200 nL van fluorescerende Tracer fluoro-ruby. Het dier werd geofferd 10 min na de injectie, en de hersenen werd geëxtraheerd en gefixeerd 's nachts. Coronale hersen secties waren bereid om de injectieplaats te onderzoeken, die correct werd geplaatst en beperkt tot de ADN (Figuur 1A, B).
Om Chronos-GFP uit te drukken in neuronen van ADN, hebben we 300 nL van AAV5 geïnjecteerd. SYN. Chronos-GFP. WPRE. bGH. drie weken na de injectie werden acute horizontale hersen schijfjes bereid. Figuur 1 C toont een hersen segment met de injectieplaats thalame in de rechter hemisfeer, met GFP-uitdrukking in het groen. Bij inspectie met een epi-fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een 4x-doelstelling, werden in de presubiculum een GFP met het opschrift thalamische axonen waargenomen (Figuur 1C, D). Er werd opgemerkt dat thalame axonen dichtbevolkte de oppervlakkige lagen I en III van de presubiculum (Figuur 1D).
De activiteit van presubiculaire neuronen in Layer III werd opgenomen in de hele-cel Patch-clamp configuratie. Hyperpolariserende en depolariserende huidige stappen werden toegepast tijdens het opnemen van de membraanpotentiaal variaties (Figuur 2A). Gegevens zijn opgeslagen op een computer voor latere offline analyse van actieve en passieve membraan eigenschappen. Presubicular Layer III hoofd cellen bezat doorgaans een negatief rust potentieel dicht bij-63 mV en vereiste depolariserende stroom injecties om de membraanpotentiaal naar de schiet drempel te stimuleren. Er is een volledige beschrijving van hun intrinsieke eigenschappen gepubliceerd11.
Het stimuleren van ADN axon terminals die Chronos-GFP uitlokken, prikkelende post synaptic mogelijkheden (EPSPS) in presubicular Layer III hoofd cellen in stroomtang modus (Figuur 2B). Afhankelijk van de lichtintensiteit kan de EPSPs de actiedrempel bereiken. Postsynaptische responsen werden ook waargenomen in voltage-clamp modus als excitatory post synaptische stromingen (EPSCs) werden opgewekt (Figuur 2C). Begin latenties van EPSCs opgeroepen door lichte stimulaties waren kort (mediaan, 1,4 MS10), wat duidt op een directe synaptische contact tussen thalame axonen en Layer III presubiculaire neuronen. Permanente EPSCs in TTX-4AP voorwaarde bevestigd deze monosynaptic activering. Het is opmerkelijk dat deze cellen betrouwbaar reageerden op de licht stimulaties van afferente axonen met een regelmatig vuur patroon.
Figuur 1 : Stereotaxic injectie in de anterodorsale thalamische Nucleus (ADN). A) schematische weergave van de injectie. B) bevestiging van de injectieplaats met fluoro-ruby in een coronale sectie. Inset geeft Antero-dorsale niveau en de afstand van bregma aan. C) horizontaal segment na Aav-Chronos-GFP-injectie in de thalamus. De axonale projecties van de ipsilaterale presubiculum dienen te worden genoteerd. Een incisie aan de linkerzijde van het segment (aangegeven door een zwarte driehoek) markeert de contralaterale hemisfeer. (B, C) Schaalbalk 1 mm.D) vergrote weergave van de inzet in (C) met de ADN-projecties op de presubiculaire oppervlakkige lagen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Presubicular Layer III neuron: intrinsieke eigenschappen, reactie op licht stimulatie van thalame afferents, en post-hoc openbaring van celmorfologie. A) ontstekings patroon en membraanpotentiaal variaties van laag III-neuron voor hyperpolariserende en depolariserende stroom stappen. (B, C) Reacties van Layer III neuron naar 2 MS licht stimulaties (blauwe staven) van thalame axonen opgenomen in (B) stroom-Clamp en (C) voltage-clamp modi. (D, E) Layer III piramidale neuron (wit, aangegeven door gevulde gele driehoek) omgeven door thalame axonen die Chronos-GFP (groen) in presubiculaire oppervlakkige lagen uitdrukken met DAPI-kleuring (blauw) in horizontale segment afbeelding met een epifluorescentie-Microscoop ( D, schaalbalk = 100 μm) en confocale Microscoop bij een hoge vergroting (E, schaalbalk = 50 μm). De cel in (a) wordt aangeduid met gevulde gele driehoeken. Een tweede, gedeeltelijk gevuld neuron is aanwezig in dit segment aangegeven met lege gele driehoeken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo virale injectie om lichtgevoelige opsins in een gedefinieerd hersengebied te uiten, is een keuze methode voor de optogenetische analyse van functionele connectiviteit met lange afstand10,11,17,18. Stereotaxic injecties bieden de mogelijkheid om precies te richten op een specifiek gebied van de hersenen. De coexpressie van een opsin met een fluorescerende reporter maakt een gunstige evaluatie mogelijk van de succesvolle expressie en bevestiging van de precieze injectieplaats. Het gebruik van AAV serotype 2/5 beperkt meestal expressie tot de beoogde hersenregio. Op deze manier wordt een beperkte populatie van neuronen getransfunteerd, waarbij lichtgevoelige ionenkanalen in hun cellichamen en Axon-terminals worden uitgesproken. In latere ex vivo slice experimenten, is het mogelijk om deze axon terminals met lichtpulsen direct in hun doelgebied te stimuleren, terwijl het uitlezen van de succesvolle synaptische transmissie via patch-klem opname van een post-Synaptisch verbonden neuron. Het bovenstaande protocol is robuust en handig, en sommige aanvullende opmerkingen kunnen de prestaties van geslaagde experimenten helpen.
Er kunnen verschillende soorten anesthesie worden gebruikt. Hier beschreven is de intraperitoneale injectie van een ketamine-xylazine combinatie als een gemakkelijk te gebruiken, kortdurende anesthesie met handige analgesie19. De diepte en duur van de anesthesie kan tot op zekere hoogte variëren. In sommige gevallen kan het nodig zijn om tijdens het protocol nog een halve dosis ketamine-xylazine te injecteren. Isoflurane anesthesie kan een goed alternatief voor het opwekken van sneller en beter controle van de diepte van de anesthesie. Coördinaten van de injectieplaatsen kunnen worden bepaald met behulp van een muis hersenen Atlas. In de praktijk moeten coördinaten worden getest en aangepast, indien nodig.
Schone werkomstandigheden zijn ook belangrijk. Het wordt aanbevolen om wegwerp beschermende kleding te gebruiken, inclusief handschoenen, een Mob-dop en een Labcoat. Bij het positioneren van het dier in de stereotaxic frame, speciale aandacht moet worden besteed aan het comfort van het dier, die zal sterk verbeteren van de efficiëntie van de anesthesie. Het lichaam van het dier moet worden uitgelijnd met het hoofd en de nek. De meest kritieke stap in het positioneren van het dier en voor craniotomie is aanpassing van de bregma-Lambda-as. Vooral bij het targeten van diepe hersenstructuren, zal zelfs een kleine afwijking fouten genereren bij het verlagen van de injectienaald in de hersenen. In sommige gevallen kan men bewust kiezen en een schuin naald traject berekenen.
Het injectievolume is een bepalende factor voor het verkrijgen van nauwkeurig gelokaliseerde opsin-expressie. Een klein volume is ideaal voor het privilege van een strak beperkte transfectie zone. Hogere volumes kunnen nuttig zijn om de volledige omvang van een groot doelgebied te dekken. Als een groot gebied moet worden bedekt, zoals het septum18, kan het nuttig zijn om verschillende kleine injecties te plaatsen met een reeks naburige coördinaten. Het interval tot de ex vivo elektrofysiologische opname is ook van cruciaal belang. Een minimale tijd voor volledige uitdrukking is noodzakelijk. Terwijl 3 weken lijken te zijn een optimale vertraging voor deze experimenten11, de nodige vertraging kan variëren afhankelijk van het virus, het serotype, en de afstand tot de postsynaptisch hersenregio.
De hier beschreven aanpak is nog krachtiger in combinatie met injecties in transgene dieren. Vorige werk heeft uitgebuit verschillende muis lijnen voor subtypen van GABAergic neuronen, om specifiek te richten op ofwel PV-of SST-uitdrukken van interneuronen voor patch-klem opnames20. Gelijktijdige dubbele opname van naburige PV en piramidale neuronen of SST en piramidale neuronen dan maakt vergelijking van de sterktes van lange afstand ingangen tussen twee neuron types11. Dit levert resultaten die zijn gestandaardiseerd met betrekking tot één neuron type. Deze standaardisatie is vooral belangrijk in gevallen waarin de uitdrukkings niveaus van opsins variëren tussen verschillende dieren of verschillende segmenten.
Slice Health is essentieel voor kwalitatief hoogwaardige Patch-clamp opnames. Constante oxygenatie van de plakjes is cruciaal, en een langzame snijsnelheid verbetert aanzienlijk de kwaliteit van het snijoppervlak. Een snijdikte van 300 μm behoudt, tot op zekere hoogte, de integriteit van het micro circuit in horizontale presubiculaire secties, waaronder piramidale neuronen met hun cellichamen, dendritische en lokale axonale vertakkingen, en lokale synaptische verbindingen. Het type van licht-gated kanalen gekozen om activering van afferente vezels induceren zal sterk beïnvloeden de stimulatie parameters (duur, lichtintensiteit). Chronos is een blauw lichtgevoelige channelrhodopsin, en een breed scala aan verlichtings golflengten kan worden gebruikt voor activering (piek gevoeligheid rond 500 nm, zelfs met minimale lichtintensiteit van 0,05 mW/mm2, ook geactiveerd bij 405 nm, en tot 530 nm21 ). Bovendien heeft Chronos snelle kinetiek-eigenschappen in vergelijking met de klassieke ChR2, die hoge frequentie-stimulaties en betrouwbare activering van lange-termijn projecties mogelijk maakt22. In combinatie met de uitdrukking van Chrimson, een rood verplaatste opsin variant, wordt de onafhankelijke optische excitatie van verschillende neurale populaties haalbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We bedanken Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang en Jean Simonnet voor hun hulp bij de ontwikkeling van eerdere versies van het stereotaxic Injection protocol en Marin Manuel en Patrice Jegouzo voor technische hulp. Dit werk werd gesteund door het Franse Ministerie van onderwijs en onderzoek (L. R., L. S.), Centre National des Etudes spatiales (M. B.), en Agence nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
