Summary
Denne protokollen beskriver et sett med metoder for å identifisere den celle-type spesifikke funksjonell tilkobling av langtrekkende innganger fra fjerne hjernen områder ved hjelp optogenetic stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.
Abstract
Kjennskap til celle-type spesifikke Synaptic tilkobling er en avgjørende forutsetning for å forstå hjernen hele neuronal kretser. Den funksjonelle etterforskningen av langtrekkende forbindelser krever målrettede innspillinger av enkelt neurons kombinert med den spesifikke stimulering av identifiserte fjerne innganger. Dette er ofte vanskelig å oppnå med konvensjonelle og elektriske stimulering teknikker, fordi axons fra sammenfallende oppstrøms hjerneområder kan blander i målregionen. Den stereotaxic målretting av en bestemt hjerne regionen for virus-mediert uttrykk for lys-sensitive ion kanaler tillater selektiv stimulering av axons som stammer fra den regionen med lys. Intracerebrale stereotaxic injeksjoner kan brukes i godt avgrenset strukturer, slik som fremre thalamic kjerner, i tillegg til andre subkortikal eller kortikale områder i hele hjernen.
Beskrevet her er et sett av teknikker for presis stereotaxic injeksjon av viral vektorer uttrykker channelrhodopsin i musen hjernen, etterfulgt av photostimulation av axon terminaler i hjernen Slice forberedelse. Disse protokollene er enkel og vidt anvendelig. I kombinasjon med hel celle patch klemme opptak fra en postsynaptically koblet Nevron, photostimulation av axons tillater påvisning av funksjonelle Synaptic tilkoblinger, farmakologiske karakterisering, og evaluering av deres styrke. I tillegg kan biocytin fylling av den innspilte Nevron brukes for post-hoc morfologiske identifisering av postsynaptic Nevron.
Introduction
Definere tilkobling mellom hjernen regioner er nødvendig for å forstå nevrale kretser. Klassiske anatomiske tracing metoder tillate etablering interregionale tilkobling, og lesjon studier bidra til å forstå den hierarkiske organiseringen av informasjonsflyt. For eksempel, hjerne kretser for romlig orientering og hodet retning signalering innebære retningsbestemt flyt av informasjon fra thalamus til presubiculum. Dette har blitt demonstrert av lesjon studier av Antero-rygg thalamic kjerner (ADN) som forringer hodet retning signalet i nedstrøms rygg presubiculum, samt parahippocampal rutenettcelle signal1,2.
Den funksjonelle forbindelsen mellom hjerneområder er vanskeligere å etablere på et mobil-og subcellulære nivå. I hippocampus, en svært organisert anatomi gjør det mulig å undersøke Pathway-spesifikke Synaptic tilkoblinger ved hjelp av elektrisk simulering i stykket forberedelse. Stimulering elektroder plassert i stratum radiatum av CA1 kan brukes til å spesielt stimulere Schaffer sikkerhet innspill fra CA33. Stimulerende elektroder plassert i stratum lacunosum moleculare av CA1 vil aktivere perforant banen input til CA14,5. Elektrisk stimulering aktiverer signal utslipp fra axon terminaler; men aktiverer den neurons med somata nær stimulering området samt axons av passasjen. Det er derfor av begrenset bruk for å studere afferents fra definerte hjerneområder når fibrene i ulike regioner av opprinnelse blander i mål strukturen, som typisk er tilfellet i mektig.
Neurons kan også stimuleres med lys. Optiske metoder inkluderer photoactivation av bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-Foton laserskanning. Flere tett linjeavstand områder kan bli stimulert sekvensielt, uten mekaniske skader på vevet6. Dette har blitt brukt til å kartlegge Synaptic reseptorer samt aktivere individuelle neurons7. Selv om glutamat uncaging kan brukes til lokal krets analyse, tillater den ikke for spesifikk aktivering av langtrekkende innganger.
En metode for valg for etterforskning av langtrekkende tilkobling i neuronal kretser er bruken av virus-mediert channelrhodopsin uttrykk. Bruke in vivo stereotaxic injeksjoner som beskrevet her, kan uttrykket av lys-gated ion kanaler være målrettet og romlig begrenset til en ønsket hjerne regionen. På denne måten er channelrhodopsins effektive for kartlegging av eksitatoriske eller hemmende tilkobling fra en region til målet. Transfekterte axons terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne Slice forberedelse, og patch-klemme innspillinger som en lese-out tillate undersøkelse av funksjoner og sterke sider av spesifikke krets komponenter i hjernen8. Den optogenetic tilnærmingen kombinert med stereotaxic injeksjon av et virus tilbyr enestående spesifisitet og genetisk kontroll9. Stimulere med lys i tillegg gjør det mulig for både høy Temporal og romlig presisjon10,11.
Den presubiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen av hippocampus og para-hippocampus formasjon12,13. Det mottar viktig Synaptic innspill fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikal regioner14. Dermed er selektiv stimulering av thalamic axons terminaler i en presubicular skive ikke mulig med elektrisk stimulering eller glutamat uncaging. Beskrevet i denne protokollen er metoder for å bestemme funksjonell tilkobling mellom hjernen regioner (ADN og presubiculum) ved hjelp av presise stereotaxic injeksjoner av viral vektorer uttrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er photostimulation av axons terminaler med prosjektering neurons i deres målregion, kombinert med hele cellen patch-klemme innspillinger av post-Synaptic neurons i hjernen Slice forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med det europeiske fellesskaps rådsdirektiv (2010/63/EU) og godkjent av etikk komitéen i Paris Descartes-universitetet. Eksperimentator må innhente autorisasjon for prosedyren for å overholde lokale bestemmelser.
1. planlegging av eksperimentet
- Definer hjerne området som skal målrettes. Bestem stereotaxic koordinatene til injeksjonsstedet ved hjelp av en mus hjernen Atlas15. For den rette Antero-rygg thalamic kjernen (ADN) er koordinatene:-0,82 bakre, 0,75 lateral,-3,2 dybde (mm) i forhold til bregma. Koordinater må kanskje justeres for dyr i ulik alder, kjønn eller belastning.
- Bekreft og dokumentere nøyaktighet av koordinatene ved å injisere en fluorescerende Tracer (150 til 300 nL) Observer med et epifluorescence mikroskop i et pilot eksperiment (figur 1a, B).
- Definer typen virus som skal injiseres. Oppbevar viruset i 6 μL alikvoter ved-80 ° c som anbefalt av produsenten. Bring 1 alikvot plassert på isen til operasjonsstuen, for injeksjon av en til seks dyr på en gitt dag. Biosafety regelverk for bruk av AAV kan avhenge av landet eller institusjonen, og bruk av en PSM 2 hette kan være nødvendig.
Merk: Her bruker vi en AAV2/5 serotype uttrykker Chronos, en rask channelrhodospin-2 variant, smeltet til grønt fluorescerende protein under kontroll av Synapsin arrangøren: AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH.
2. Stereotaxic kirurgi
- Monter en stereotaxic ramme utstyrt med en pumpe holder på en stabil standard laboratoriebenk. Juster stereoscope slik at det blir klart å se sonen der dyrets hode vil bli plassert. Bruk en LED-lyskilde for belysning. Roter stereoscope bort for å få tilgang til pumpe holde ren, som ikke er nødvendig for de første trinnene i operasjonen.
- Installer en 10 μL Hamilton-sprøyte utstyrt med en 33 G skrå metall nål i pumpe holde ren. Test utstøting systemet med vann.
- Bedøve en 4-til 5-ukers gammel C57BL6-mus med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin hydrochloride og xylazine (henholdsvis 100 mg/kg og 10 mg/kg). Forbered en blanding av 1 mL ketamin og 0,5 mL xylazine i 8,5 mL 0,9% NaCl. Dette vil resultere i 10 mg/mL ketamin og 1 mg/mL xylazine i miksen. Av denne blandingen, Injiser intraperitonealt 10 μL per gram av dyrets kroppsvekt. Varighet av anestesi er ca 1 t.
- Kontroller at dyret er godt anesthetized med en tå knipe. Deretter trekker du ut tungen for å lette pusten. Barbere skallen hår.
- Injiser 20 μL av lidokain (4 mg/mL; 2 mg/kg) under huden på hodet for lokal bedøvelse og vent 5 min for effekten å begynne. For å unngå øyeskader på grunn av tørrhet, dekk øynene med aktuell øye salve.
- For å eksponere skallen, lage en rett kutt i hodebunnen med liten kirurgi saks. Plasser dyret i en stereotaxic ramme, sette inn øre linjene litt rostral til selve øret for å hvile på benet og trekke ned huden, noe som bør skape god tilgang til skallen. Stram til på plass. Monter nese stykket.
- Opprettholde kroppen av dyret horisontalt på nivået av hodet ved hjelp av en høyde-justert støtte. Plasser en varmepute under musen for å holde den i fysiologisk temperatur.
- Rengjør skallen ved å påføre 0,9% NaCl med en bomullspinne for å fjerne bløtvev fra benet. Bruk stereoscope for resten av operasjonen.
- Juster skallen slik at bregma-lambda aksen er nivå, flytte opp eller ned nesen og tennene stykke. Dette nødvendiggjør gjentakende målinger av bregma og Lamba, ettersom begge vil endre etter justering av nese nivået.
- Finn plasseringen av injeksjonsstedet på skallen. Juster injeksjonsnålen over injeksjonsstedet i henhold til bakre og midtre koordinater og Merk skallen med en disponibel nål. Beveg injeksjonsnålen oppover med 4 cm.
- Bruk en 0,5 mm Burr med en drill for å realisere en 1 mm diameter kraniotomi på merket, på en halv av maksimal hastighet. Tørk eventuelle blødninger med et papir vev.
- Tøm vannet som finnes i Hamilton-sprøyten for oppbevaring ved å mate den helt ut med pumpen. Bare nålen vil fortsatt være fylt med vann. Nålen vaskes mellom hver bruk med rent deionisert vann. Sterilisering er ikke nødvendig.
- Ta alikvot av virus det er å bli anvendt for denne dag. Sørg for at viral løsningen ikke er frosset lenger, men har forblitt avkjølt (nær 0 ° c, på is). Bare kort fjerne fra isen for å få 700 nL med en micropipette for små volumer. Sett dråpe på en 5 cm x 5 cm stykke para fin film. Unngå å lage bobler. Sett den resterende viral løsning tilbake på isen.
Merk: dråpe volumet skal være større enn det ønskede injeksjonsvolumet (700 nL for 200 nL injisert). Dette vil gi en sikkerhetsmargin i tilfelle noe av væsken går tapt under overføringen og gjør det mulig å utføre en liten test utstøting (trinn 2,16) før du fortsetter. - Plasser para fin filmen oppå kraniotomi. Stupe nålen i dråpe av viral løsning uten å endre Antero-bakre og lateral posisjon.
- Bruk "trekk"-funksjonen til pumpen for å fylle sprøyten med ca 500 nL av viral løsning kastes på para fin filmen. Gjør dette under visuell kontroll (stereoscope), se drop forsvinne, og pass på å ikke aspirer luft.
- Kontroller at sprøyten er riktig utfylt. Kontroller funksjonen til utløsings systemet ved å kjøre ned stempelet for å teste ut en liten dråpe væske på 50 nL under visuell kontroll. Tørk av drop.
- Sett nålen inn i hjernen til den valgte dybden, ved å dreie knotten kontrollere dorso-ventrale aksen av stereotaxic apparatet med klokken. Trykk på "Run"-knappen (hastighet 15 nL/min per volum på 150 nL injisert). Et lite volum (50-300 nL, avhengig av viruset som brukes) er langsomt utløst over 10 min med en automatisk pumpe.
- Vent 10 min etter injeksjonen for å unngå lekkasjer fra injeksjonsstedet. Deretter langsomt fjerne nålen over 3-5 min ved å dreie knotten kontrollere dorso-ventrale aksen mot klokken.
- Roter den vertikale delen av den stereotaxic rammen med sprøyten bort fra dyret. Vask nålen umiddelbart i rent destillert vann ved å fylle-tømme den flere ganger, for å unngå tilstopping. Oppbevar sprøyten fylt med vann.
- Fjern musen fra stereotaxic rammen. Sutur huden med 4-0 polyamid Sutur filament. Lag tre eller fire masker, bundet med 2-1-1 standard kirurgiske knop.
- Plasser musen i et oppvarmet bur til det helt våkner opp fra anestesi, og gi vann og gjennomvåt mat i en Petri parabolen plassert på bakken. Hvis varme kilden er under buret, bruker du et avstands gitter for å unngå overoppheting.
Merk: i henhold til lokale retningslinjer kan en enkelt dose med ketoprofen (2-5 mg/kg, subkutant) eller buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg, subkutant) påføres for å forebygge smerte. - Når Dyret er fullt våken, returnere det til sin hjemme buret og overvåke sin trivsel, spesielt på dagen etter injeksjon. Se etter tegn på smerte. Hvis noen atferdsendringer er observert, er dyret veies å overvåke sin kroppsvekt.
- Tiden for fullt uttrykk kan variere, avhengig av hvilket virus som brukes. Her tillater vi 3 uker for uttrykk for AAV5. Syn. Chronos-GFP.
3. løsninger for akutt skive opptak og fiksering
- Forbered lager løsninger på 10x konsentrert skjæring løsning (125 mM NaCl, 25 mM sukrose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mm NaH2PO4, og 2,5 mm D-glukose) og kunstig spinalvæske (ACSF) løsning (124 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 26 mm NaHCO3, 1 mm NaH2PO4 og 11 mm D-glukose) i rent deionisert vann før elektrofysiologi eksperimenter. Oppbevar disse løsningene ved 4 ° c i 1 L flasker uten CaCl2 og MgCl2.
- På dagen for eksperimentet, fortynne lager løsninger for skjæring løsning og ACSF 10x til et endelig volum på 0,5 L hver. Agitere med en magnetisk stirrer og oxygenize av bobler med 95%/5% O2/co2. Legg til divalent ioner for å oppnå endelige konsentrasjoner av 0,1 mM CaCl2 og 7 mm MgCl2 for skjære løsningen, og 2 mm CaCl2 og 2 mm MgCl2 for ACSF.
- Klargjør den kalium-gluconate-baserte pipette-løsningen til å inneholde: 135 mM K-gluconate, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mm MgATP, 0,4 mm Tris-GTP, 10 mm na2-phosphocreatine og 2,7 – 7.1 mm-biocytin for post-hoc-celle morfologi åpenbaring. Juster oppløsningen pH til 7,3 og OSMOLARITETSSYSTEM til 290 mOsm. Oppbevares 1 mL alikvoter ved-20 ° c.
- Forbered 0,1 M PBS ved å fortynne BupH PBS tørr-blanding pulver poser i 500 mL destillert vann, noe som resulterer i 0,1 M natrium fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- For å forberede 1 L av 4% PFA løsning, fortynne 111 mL 36% flytende PFA og 90 mL 10x PBS løsning i destillert vann.
- Forbered 30% sukrose løsning som inneholder 150 g av sukrose i 500 mL av 0,1 M PBS.
4. utarbeidelse av hjerne skiver
- Forbered benken plass med absorberende benk papir før
- Monter et drypp ca 1 m over benken for en tyngdekraft-matet. Fest en 24 G Butterfly nål.
- Omgi skjære kammeret til vibratome med is og oppbevar det i en fryser.
- Bedøve musen med intraperitoneal injeksjon av samme ketamin-xylazine blanding brukes til kirurgi. Vurdere fasen av anestesi ved å knipe tåen med tang. Når den er helt i hvilemodus, Injiser 100 μL av heparin (5000 U.I./mL) intraperitonealt.
- Fest dyret med tape på absorberende papir, liggende på ryggen. Åpne bryst buret ved å kutte ribbeina på venstre og høyre side med liten saks, fra membranen oppover. Hold bryst buret åpent ved hjelp av teip.
- Klem den synkende aorta med en hemostat og perfuse via venstre ventrikkel i hjertet med 4 ° c avkjølt og oksygenrikt (95%/5% O2/co2), skjæring løsningen gjennom den 24 G Butterfly nål. Etter 5 s, åpne høyre Atrium med liten saks.
- Etter 5 min. Når organene er ublodig, stopp Halshugge dyret med stor saks og immerge hodet inn i 4 ° c avkjølt og oksygenrikt skjære løsning i en Petri parabolen.
- For å trekke ut hjernen, kutt huden fra hals til nese, deretter del den siste ryggsøylen fra skallen med saks. Manuelt trekke huden og bruke små saks for å åpne skallen, klippe den langs midtlinjen, fra caudal til rostral, oppover til mellom øynene.
- Forsiktig fjerne parietal benet og caudal del av frontal bein med buet eller bein tang. Pakk hjernen med en liten avrundet slikkepott ved å sette instrumentet mellom hjernen og skallen gulvet, skjære olfactory pære, synsnerven og andre skallen nerver, og lillehjernen.
- Senk forsiktig hjernen i en iskald skjære løsning (4 ° c) i et beger. Plasser hjernen på filter papir for å forsiktig tørke kortikale overflate. Lim hjernen cortex-ned til prøven holderen av en vibratome, med den caudal siden mot bladet, for å kutte horisontale hjerne skiver.
- Fyll skjære kammeret med iskaldt oksygenrikt skjære løsning slik at hjernen er helt nedsenket. Lag et kutt på venstre halvkule (kontralateral til injisert side) for å unngå potensielle venstre-høyre tvetydighet på skiver.
FORSIKTIG: oxygenate alltid løsningen og Beskytt skiver mot lys eksponering. - Skjær 300 μm tykke skiver med vibratome, med en hastighet på 0,07 mm/s på 1 mm amplitude. På dette stadiet, anbefales det å kort sjekke Chronos-GFP uttrykk i thalamus ved hjelp av en fluorescerende lommelykt (440-460 NM) og tilsvarende filter briller (500 NM lang pass).
- Isoler den hippocampus regionen med en skalpell og overfør den til et kammer plassert i et beger fylt med bad-varmet (34 ° c), oksygenrikt (95%/5% O2/co2) ACSF.
- Etter 15 min, ta kammeret ut av oppvarmet vannbad og la skiver hvile ved romtemperatur, fortsatt oksygenert i minst 45 min til bruk.
5. hele cellen patch-klemme opptak
- Overfør forsiktig en hjerne skive som inneholder det hippocampus komplekset med en skreddersydd glass overførings pipette til Innspillings kammeret montert på et oppreist mikroskop. En overføring pipette er laget av en forkortet Pasteur pipette (indre diameter 6,5 mm) festet til en gummi pipette pære. Kontinuerlig perfuse opptaks kammeret (3 mL) med 34 ° c (varmet) ACSF boblet med 95%/5% O2/co2. Sett hastigheten på den peristaltisk pumpen til 2-3 mL/min.
- Undersøk kort Chronos-GFP uttrykk i axon terminaler i regionen av interesse med blå LED-belysning (470 NM) og observere med et 4X mål. GFP fluorescens er avbildet gjennom et passende utslipps filter, med et CCD kamera bilde som vises på en dataskjerm.
- Plasser en skive anker laget av en U-formet platina wire med tett mellomrom nylon strenger ("harpe") på stykket for å opprettholde den.
- Bytt til en 63x nedsenking objektiv og justere fokus. Sjekk for axons uttrykke Chronos-GFP og velge en pyramideformet Nevron for patch innspilling.
- Flytt målsettingen oppover.
- Trekk Pipetter med en brun-Flaming elektrode avtrekker fra Borosilikatglass glass. Avtrekker er satt til å produsere Pipetter med ca. 1 μm i spissdiameter. Fyll Pipetter med K-gluconate interne løsninger.
- Monter pipette i pipette holderen på hodet-scenen. Senk pipette i kammeret og finne spissen under målet. Pipette motstand bør være mellom 3-8 MΩ. Påfør et lett positivt trykk med en sprøyte for å se en membran av oppløsning utløp ut av pipette og gradvis senke pipette og objektiv til overflaten av stykket.
- Patch cellen i spenning-klemme konfigurasjon: tilnærming identifiserte Nevron og delikat trykk pipette spissen på Soma. Det positive trykket skal produsere en Dimple på membran overflaten. Slipp trykket for å lage en Giga-ohm forsegling (> 1 GΩ motstand). Når forseglet, sett holde spenningen til-65 mV. Bryt membranen med en skarp puls av negativt trykk: Dette oppnås ved å påføre sterk sug til et rør som er koblet til pipette holderen.
- Record i hele cellen nåværende klemme modus svarene av Nevron å hyperpolarizing og depolariserende gjeldende trinn (figur 2A).
Merk: denne protokollen vil bli brukt til å bestemme aktive og passive iboende egenskaper av cellen. Custom-skrevet MATLAB rutiner brukes for off-line analyse10,16. - Record i gjeldende-eller spenning-klemme postsynaptic svar på hele feltet 475 NM LED stimulering av afferente fibre uttrykker Chronos. Stimulere med tog på 10 stimuleringer av 2 MS varigheter ved 20 Hz (figur 2B, C). Lys intensiteten kan variere fra 0,1 – 2 mW.
Merk: lysstyrken ble målt med en digital håndholdt optisk strøm konsoll utstyrt med en PHOTODIODE sensor, plassert under målsettingen. Respons latencies på 2 – 4 MS er karakteristisk for en Monosynaptic forbindelse. - For å undersøke arten av Synaptic overføringen mellomlangt rekkende afferents og den innspilte Nevron, kan ulike farmakologiske midler brukes. Hvis du vil farmakologisk skille direkte, Monosynaptic svar fra indirekte svar via nettverks aktivering, legger du til 1 μM TTX og 100 μM 4-AP til ACSF.
Merk: Bath anvendelse av glutamat reseptor blokkere gjør det mulig å bestemme arten av signalstoffet som er utgitt og identiteten til postsynaptic reseptorer. For eksempel, AMPA type glutamat reseptorer vil bli blokkert av NBQX (10 μM) og NMDA reseptorer av APV (100 μM). Avhengig av formålet med studien, protokoller kan være unnfanget for å undersøke spenning avhengighet av Synaptic svar eller respons dynamikk over tid. - Vask med original ACSF løsning for å lappe en annen celle, eller overføre skive som inneholder en biocytin-fylt Nevron i et lite hetteglass fylt med 4% PFA.
- Etter over natten fiksering i 4% PFA, vask skive i 0,1 M PBS (2x i 5 min, 1x i 20 min).
- Oppbevares i 30% sukrose ved 4 ° c.
6. Biocytin åpenbaring
- Overfør de faste skiver som inneholder biocytin-fylte neurons på et glass blad i en dråpe 30% sukrose og utføre tre sykluser av frysing-tine: plassere bladet på tørr isen kastes i en Styrofoam boks for 1 min til dråper sukrose er helt frosset, deretter Trykk bladet mot håndflaten for å tine.
- Vask skive 3x i 0,1 M PBS (2x for 5 min, 1x for 1 t og 50 min), forsiktig opphisset. Må ikke overstige 2 t for den siste vasken.
- Pre-ruge stykket på RT for 2 t i opphisset buffer løsning som inneholder 2% melkepulver (0,4 g i 20 mL) for å mette ikke-spesifikke nettsteder og 0,5% Triton X100 (0,1 mL i 20 mL) for å permeabilize membraner i 0,1 M PBS.
- Ruge over natten ved 4 ° c i en løsning som inneholder 2% melkepulver, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 bøy (1/500), og DAPI (1/1000) i 0,1 M PBS, forsiktig opphisset.
- Vask skive tre ganger i 0,1 M PBS (2x i 5 min, 1x for 2 timer). Den siste vask kan vare lenger, opp til 4 h, for å redusere bakgrunns farging.
- Før montering av stykket, bruk en epifluorescence mikroskop ved 10x forstørrelse konfigurert til å observere Cy5 fluorescerende markører for å identifisere siden av stykket som inneholder den markerte cellen i et kammer fylt med PBS.
- Overfør stykket til et blad, celle-side opp, tørk den med et papir vev, og Monter den ved hjelp av høy motstand montering medium.
- Bruk et epifluorescence mikroskop med 10x forstørrelse i Cy5 og DAPI konfigurasjon for å undersøke celle kroppens plassering, og i GFP-konfigurasjon for å observere den markerte afferents, eller et konfokalmikroskopi mikroskop med høy oppløsning på 20x for detaljerte somatiske, axonal og dendrittiske morfologi (figur 2D, E). Filter innstillinger er beskrevet i materialfortegnelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåten som presenteres her ble brukt til å uttrykke en blå lysfølsom channelrhodopsin (Chronos) smeltet til GFP i Antero-rygg kjernen i thalamus (ADN), ved stereotaxic injeksjon av anterograd adeno-assosiert virus. De stereotaxic koordinatene ble bestemt i henhold til en mus hjernen Atlas og testet ved å injisere 200 nL av fluorescerende Tracer fluoro-Ruby. Dyret ble ofret 10 min etter injeksjonen, og hjernen ble ekstrahert og fiksert over natten. Koronale hjerne seksjoner var forberedt på å undersøke injeksjonsstedet, som var riktig plassert i og begrenset til ADN (figur 1A, B).
For å uttrykke Chronos-GFP i neurons av ADN, injisert vi 300 nL av AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH. tre uker etter injeksjonen, var akutte horisontale hjerne skiver forberedt. Figur 1 C viser en hjerne skive som inneholder thalamic injeksjonssted i høyre halvkule, med GFP uttrykk i grønt. Ved inspeksjon med en Epi-fluorescens mikroskop utstyrt med et 4X objektiv, GFP merket thalamic axons ble observert i presubiculum (figur 1C, D). Det ble bemerket at thalamic axons tett innervated de overfladiske lagene i og III av presubiculum (figur 1D).
Aktiviteten av presubicular neurons i lag III ble registrert i hele-celle patch-klemme konfigurasjon. Hyperpolarizing og depolariserende aktuelle skritt var anvendt stund innspillingen det hinne muligheter variasjoner (skikkelsen 2A). Data ble lagret på en datamaskin for senere offline analyse av aktive og passive membran egenskaper. Presubicular sjikt III hadde vanligvis et negativt hvile potensial nær-63 mV og krevde depolariserende gjeldende injeksjoner for å drive membran potensialet til å skyte terskelen. En fullstendig beskrivelse av deres iboende egenskaper har blitt publisert11.
Stimulere ADN axon terminaler uttrykker Chronos-GFP elicited eksitatoriske post-Synaptic potensialer (EPSPs) i presubicular lag III viktigste cellene i gjeldende klemme modus (figur 2B). Avhengig av lys intensitet, kan EPSPs nå handling potensiell terskel. Postsynaptic reaksjoner ble også observert i spennings-klemme-modus som eksitatoriske post-Synaptic strømninger (EPSCs) ble elicited (figur 2C). Utbruddet latencies av EPSCs fremkalt av lys stimuleringer var korte (median, 1,4 MS10), noe som indikerer en direkte Synaptic kontakt mellom thalamic axons og lag III presubicular neurons. Vedvarende EPSCs i TTX-4AP tilstand bekreftet dette Monosynaptic aktivering. Det er bemerkelsesverdig at disse cellene reagerte pålitelig på lys stimuleringer av afferente axons med et vanlig skyte mønster.
Figur 1 : Stereotaxic injeksjon i anterodorsal thalamic nucleus (ADN). (A) skjematisk fremstilling av injeksjonen. (B) bekreftelse på injeksjonsstedet med fluoro-Ruby i en koronale seksjon. Innfelt indikerer Antero-rygg og avstand fra bregma. (C) horisontal skive etter AAV-CHRONOS-GFP injeksjon i thalamus. Den axonal anslag til ipsilateral presubiculum bør bemerkes. Et snitt på venstre side av stykket (angitt med en svart trekant) markerer den kontralateral halvkule. (B, C) Scale bar 1 mm. (D) forstørret visning av innfelt i (C) med ADN anslag til presubicular overfladiske lag. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Presubicular lag III Nevron: indre egenskaper, respons på lys stimulering av thalamic afferents, og post-hoc åpenbaring av celle morfologi. (A) avfyring mønster og membran potensielle variasjoner av lag III Nevron for hyperpolarizing og depolariserende gjeldende trinn. (B, C) Svar av lag III Nevron til 2 MS lys stimuleringer (blå barer) av thalamic axons innspilt i (B) Current-Clamp og (C) spennings-klemme moduser. (D, E) Layer III pyramideformet Nevron (hvit, indikert av fylt gul trekant) omgitt av thalamic axons uttrykke Chronos-GFP (grønn) i presubicular overfladiske lag med DAPI farging (blå) i horisontal skive avbildet med et epifluorescence mikroskop ( D, Scale bar = 100 μm) og konfokalmikroskopi mikroskop ved høy forstørrelse (E, Scale bar = 50 μm). Cellen i (A) indikeres med fylte gule trekanter. Et sekund, delvis fylt Nevron er til stede i denne sektoren indikert med tomme gule trekanter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo viral injeksjon for å uttrykke lys-sensitive opsins i et definert hjerne område er en valg metode for optogenetic analyse av langtrekkende funksjonell tilkobling10,11,17,18. Stereotaxic injeksjoner tilbyr muligheten til å nøyaktig målrette et bestemt område av hjernen. Coexpression av en opsin med en fluorescerende reporter beleilig tillater evaluering av vellykket uttrykk og bekreftelse av nøyaktig injeksjonsstedet. Bruken av AAV serotype 2/5 vanligvis begrenser uttrykket til den målrettede hjernen regionen. På denne måten en begrenset befolkning på neurons er transfekterte, uttrykker lys-sensitive ion kanaler i deres celle organer og axon terminaler. I etterfølgende ex vivo Slice eksperimenter, er det mulig å stimulere disse axon terminaler med lyspulser direkte i deres målområdet, mens du leser ut vellykket Synaptic overføring via patch-klemme innspillingen av en post-synaptically koblet Nevron. Protokollen ovenfor er robust og praktisk, og noen tilleggsmerknader kan hjelpe til med å utføre vellykkede eksperimenter.
Ulike typer anestesi kan brukes. Beskrevet her er intraperitoneal injeksjon av en ketamin-xylazine kombinasjon som en lett-å-bruke, kortsiktig anestesi med praktisk analgesi19. Dybden og varigheten av anestesi kan variere til en viss grad. I noen tilfeller kan det være nødvendig å injisere en halv dose av ketamin-xylazine under protokollen. Isoflurane anestesi kan være et godt alternativ å indusere raskere og bedre kontroll dybden av anestesi. Koordinater for injeksjon nettsteder kan bestemmes ved hjelp av en mus hjernen Atlas. I praksis må koordinatene testes og justeres om nødvendig.
Rene arbeidsforhold er også viktige. Det anbefales å bruke en gangs verneutstyr, inkludert hansker, en Mob cap, og en lab coat. Ved posisjonering dyret i stereotaxic ramme, bør spesiell oppmerksomhet rettes mot komforten av dyret, som vil øke effektiviteten av anestesi. Kroppen av dyret skal være på linje med hodet og nakken. Det mest kritiske trinnet i posisjonering dyret og før kraniotomi er justering av bregma-lambda aksen. Spesielt når du målretter mot dype hjerne konstruksjoner, vil selv et lite avvik generere feil når du senker injeksjonsnålen inn i hjernen. I noen tilfeller kan man bevisst velge og beregne en skrå nål bane.
Injeksjonsvolumet er en avgjørende faktor for å oppnå nøyaktig lokaliserte opsin uttrykk. Et lite volum er ideelt å privilegium en tett begrenset transfeksjoner sone. Høyere volumer kan være nyttige for å dekke hele omfanget av et stort målområde. Hvis et stort område må dekkes, slik som septum18, kan det være nyttig å plassere flere små injeksjoner med en rekke nærliggende koordinater. Intervallet til ex vivo elektrofysiologisk opptaket er også kritisk. Det er nødvendig med en Minimumstid for fullt uttrykk. Stund 3 ukens gjøre inntrykk av å være en optimal forsinkelsen for disse eksperimenter11, det på krevd forsinkelsen kanskje variere avhenger på virus, dens serotype, og avstanden å det postsynaptic hjerne område.
Tilnærmingen er beskrevet her er enda kraftigere kombinert med injeksjoner i transgene dyr. Tidligere arbeid har utnyttet forskjellige muse linjer for undergrupper av GABAergic neurons, for å spesifikt målrette enten PV-eller SST-uttrykker interneurons for patch-klemme innspillinger20. Samtidig dobbel innspilling av nabostaten PV og pyramideformet neurons eller SST og pyramideformet neurons deretter tillater sammenligning av styrkene til langtrekkende innganger mellom to Nevron typer11. Dette gir resultater som er standardisert med hensyn til en Nevron type. Dette standardisering er spesielt viktig i tilfeller der uttrykket nivåer av opsins varierer mellom forskjellige dyr eller forskjellige skiver.
Slice helse er viktig for høykvalitets patch-Clamp innspillinger. Konstant oksygenering av skiver er avgjørende, og en langsom skjærehastighet betydelig forbedrer skive overflatekvalitet. En skive tykkelse på 300 μm bevarer, til en viss grad, microcircuit integritet i horisontale presubicular seksjoner, inkludert pyramideformet neurons med sine celle organer, dendrittiske og lokale axonal forgreninger, og lokale Synaptic tilkoblinger. Typen av lys-gated kanaler valgt å indusere aktivering av afferente fibre vil i stor grad påvirke stimulering parametere (varighet, lys intensitet). Chronos er en blå lysfølsom channelrhodopsin, og et bredt spekter av belysning bølgelengder kan brukes til aktivering (topp følsomhet rundt 500 NM, selv med minimal lys intensitet på 0,05 mW/mm2, også aktivert på 405 NM, og opp til 530 NM21 ). Videre har Chronos raske Kinetics egenskaper i forhold til klassisk ChR2, som muliggjør høy frekvens stimuleringer og pålitelig aktivering av langtrekkende anslag22. I kombinasjon med uttrykk for Chrimson, en rød-forskjøvet opsin variant, blir den uavhengige optiske eksitasjon av distinkte nevrale populasjoner gjennomførbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean Simonnet for deres hjelp i utviklingen av tidligere versjoner av stereotaxic injeksjon protokollen og marin Manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjelp. Dette arbeidet ble støttet av det franske departement for utdanning og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), og Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
