In vivo Intracerebrale Stereotaxic injeksjoner for Optogenetic stimulering av langtrekkende innganger i mus Brain skiver

Målet med denne metoden er å identifisere den funksjonelle tilkoblingen av langtrekkende innganger fra fjerne hjerneregioner ved hjelp av fotostimulering i hjerneskiver. Den stereotoksiske målrettingen av en bestemt hjerneregion for ulike medierte uttrykk for lysfølsomme ionkanaler gjør det mulig å selektiv stimulering av aksoner som kommer fra den regionen med lys. Å demonstrere prosedyren vil være Louis Richevaux, en ph.d.-student fra gruppen min.

Før operasjonen, kontroller at dyret er godt bedøvet med en tåklem. Trekk forsiktig ut tungen for å lette pusten. Deretter barberer du kraniehåret.

Injiser 20 mikroliter lidokainhydroklorid under hodets hud for lokalbedøvelse og vent i fem minutter. For å avsløre skallen, gjør et kutt på hodebunnen. Deretter plasserer du dyret i en stereotoksisk ramme.

Sett inn ørestengene og hvil dem på beina litt rostral til ørene og trekk ned huden for å skape god tilgang til skallen. Stram ørestengene og monter nesestykket. Opprettholde dyrets kropp horisontalt og på nivået av hodet ved hjelp av en høydejustert støtte.

Plasser en varmepute under dyret for å holde den ved fysiologisk temperatur. Rengjør deretter skallen ved å påføre 0,9% natriumklorid med en bomullspinne for å fjerne bløtvev. Juster skallen slik at bregma lambda tilgangen er jevnet.

Deretter lokaliserer du injeksjonsstedet på skallen i henhold til bakre og mediale koordinater og plasserer injeksjonsnålen over den. Merk skallen med en engangsnål. Deretter flytter du injeksjonsnålen oppover med fire centimeter.

Ved hjelp av en 0,5 millimeter burr, lag en en millimeter diameter kraniotomi på merket ved den ene halvdelen av maksimal hastighet. Vattpinne med vev hvis det oppstår blødninger. Deretter tømmer du vannet i Hamilton-sprøyten for oppbevaring ved å fullstendig kaste det ut med en pumpe.

Bare nålen er fylt med vann. Tin virusløsningen som skal injiseres på is, fjern den kort fra isen og få 700 nanoliter av løsningen med en mikropipette. Deretter setter du en dråpe på et stykke parafinfilm.

Plasser parafinfilmen på toppen av kraniotomien. Stup nålen i dråpe viral oppløsning uten å endre anteroposterior og lateral posisjon. Etterpå bruker du pumpens uttaksfunksjon til å fylle sprøyten med ca. 500 nanoliter av virusoppløsningen på parafinfilmen.

Utfør denne prosedyren under stereoskopet, se dråpen forsvinne, og sørg for ikke å aspirere luft. Kontroller at sprøyten er riktig fylt. Test utstøtingssystemet ved å kjøre ned stempelet for å teste ut en liten væskedråpe.

Deretter setter du nålen inn i hjernen til den valgte dybden. Trykk på løpeknappen for injeksjon. Deretter trekker du langsomt kanylen over tre til fem minutter.

Vask umiddelbart nålen i rent destillert vann ved å fylle tømming flere ganger for å unngå tilstopping. Etterpå fjerner du dyret fra stereotoksisk ramme. Sutur huden og lag tre eller fire masker bundet med 2-1-1 standard kirurgiske knuter.

For å trekke ut hjernen, gjør et kutt på huden fra nakken til nesen, og del deretter de siste ryggvirvlene fra skallen med saks. Trekk inn huden og kutt skallen langs midtlinjen fra caudal til rostral retning. Fjern forsiktig parietalbenet og den kaudale delen av frontalbenet.

Trekk ut hjernen med en liten avrundet slikkepott ved å sette den inn mellom hjernen og kranialgulvet, og snitte olfaktorisk pære, optisk nerve og andre kraniale nerver og lillehjernen. Senk forsiktig hjernen ned i iskald skjæreløsning. Deretter overfører du hjernen til et filterpapir og tørker forsiktig den kortikale overflaten.

Lim hjernebarken til prøveholderen av en vibratom med den kaudale siden vendt mot bladet for å kutte horisontale hjerneskiver. Fyll deretter skjærekammeret med iskald oksygenert skjæreløsning slik at hjernen er helt immerged. Seksjon 300 mikrometer tykke skiver med vibratom med en hastighet på 07 millimeter per sekund ved en millimeter amplitude.

På dette stadiet anbefales det å kort sjekke Chronos-GFP-uttrykket i thalamus ved hjelp av en fluorescerende lommelykt og tilsvarende filterbriller. For å utføre helcellede patch-clamp opptak, forsiktig overføre en hjerneskive som inneholder hippocampal kompleks til opptakskammeret. Kontinuerlig perfuse opptakskammeret med 34 grader Celsius ACSF bobler med karbagen på to til tre milliliter per minutt.

Undersøk kort Chronos-GFP-uttrykk i axonterminaler i interesseområdet med blå LED-belysning ved 4X-forstørrelse. Bytt til et 63X nedsenkingsmål og juster fokuset. Se etter aksoner som uttrykker Chronos-GFP og velg en pyramide neuron for patch opptak.

Deretter fyller du en pipette med kaliumglukotbasert intern løsning. Monter den i pipetteholderen på hodetrinnet. Patch cellen i spenning klemme konfigurasjon.

Nærmer deg det identifiserte nevronen og trykk pipettespissen delikat på soma. Det positive trykket skal produsere en dimple på membranoverflaten. Slipp deretter trykket for å lage en gigoOm-forsegling.

Når den er forseglet, setter du holdespenningen til minus 65 millivolt. Bryt membranen med en skarp puls av negativt trykk. Registrer nevronens svar på hyperpolarisering og depolariserende nåværende trinn i helcellestrøm klemmemodus.

Ta opp i strøm- eller spenningsklemme postsynaptiske responser på 475 nanometer LED helfeltsstimulering av afferentfibre som uttrykker Chronos. Stimulere med tog av ti stimuleringer på to millisekund varighet på 20 hertz. Aktiviteten til presubicular nevroner i lag tre som svar på hyperpolarizing og depolarizing gjeldende trinn ble registrert i hele cellen patch-clamp konfigurasjon.

Stimulerende ADN axon terminaler som uttrykker Chronos-GFP fremkalte excitatory post-synaptic potensialer i presubicular lag tre hovedceller i gjeldende klemmemodus. Avhengig av lysintensiteten kan EPSP-ene nå handlingspotensialets terskel. Postsynaptiske responser ble også observert i spenningsklemmemodus, da eksitatoriske postsynaptiske strømmer ble fremkalt.

Vist her er et lag tre pyramide neuron omgitt av thalamus aksoner uttrykker Chronos-GFP i presubicular overfladiske lag med DAPI farging avbildet med en epifluorescence mikroskop. Og dette bildet ble tatt med en høyere forstørrelse med et konfokal mikroskop. Forsiktig utjevning av bregma langs aksen i å utføre piloteksperimenter med en fluorescerende tracer er avgjørende for å forbedre presisjonen til stereotoksisk injeksjon.

Denne prosedyren kan også brukes til å undersøke konvergerende projeksjoner fra forskjellige områder ved å injisere på to generative scene følsomme for to forskjellige bølgelengder. Utviklingen av denne teknikken har tillatt presis anatomisk og funksjonell kretsanalyse mellom fjerne hjerneregioner på en celletype spesifikk måte.