Summary
Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.
Abstract
Bütün hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık patojenler geniş bir yelpazede karşı acil ve sağlam bir savunma sağlar. Humoral ve hücresel immün yanıt-e doğru doğuştan gelen bağışıklık ana dallar ve birçok bu yanıtları düzenleyen etkenler örümceklerle omurgasızlar ve memeliler arasında korunmuş. Fagositoz, Merkezi bileşeni hücresel doğuştan gelen bağışıklık, bağışıklık sisteminin özel kan hücreleri tarafından yapılır. Meyve sineği Drosophila melanogaster, moleküler mekanizmaları ve fagositoz bütün hayvanlarda fizyolojik etkilerini araştırmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada parçacık alımı ve imha Drosophila kan hücreleri, hemocytes tarafından ölçmek için bir enjeksiyon tabanlı içinde vivo fagositoz tahlil göstermektedir. Yordamı araştırmacılar tam parçacık konsantrasyonu ve doz, son derece tekrarlanabilir sonuçlar kısa bir miktarda elde etmek mümkün hale kontrolü sağlar. Deneme nicel, gerçekleştirmek, kolay ve ana faktörler için ekran o etkisi patojen tanıma, alımı ve izni için uygulanabilir.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık savunma patojenik mikroplar karşı savunma ilk satırı oluşturur. Bu yanıtları ikisi de moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili1anlamda germline kodlanmış desen tanıma reseptörleri tarafından (PRRs) aracılı humoral ve hücresel doğuştan gelen bağışıklık işlevsel olarak ayrılabilir. Memeliler ve omurgasızlar, Yuvarlak solucanlar, Caenorhabditis elegans ve meyve sineği Drosophila melanogaster2gibi birçok sinyal yollar ve doğuştan gelen bağışıklık efektör mekanizmaları korunmuş. Meyve sineği bulaşıcı mikroorganizmaların3karşı ana savunma eğitim için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila kolay ve ucuz laboratuvarlarda, yetiştirilen genetik olarak uysal ve kısa oluşturma süresi vardır. Ayrıca, meyve sineği mikroplar, ana bilgisayar dokunulmazlık viral, bakteriyel, mantar veya parazit patojenlere karşı incelenmesi etkinleştirme bir dizi karşı son derece etkili savunma sergiler.
Drosophila immunologists tarihsel olarak ileri genetik ekranlar, böcek hücre satırları filtreleme ve doğuştan gelen bağışıklık-önde gelen incelemek için sinek mutant suşları önceden varolan genom çapında RNA-aracılı girişim (RNAi) kullanılan kimlik ve karakterizasyonu birkaç örümceklerle korunmuş humoral bağışıklık yolları4,5,6,7,8. Humoral doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, tartışmalı, en iyi meyve sinekleri bağışıklık savunma ile karakterizedir. Enfeksiyon, humoral yanıt üretim ve antimikrobiyal peptid sistemik sürümü (AMP) molekülleri içine hemolymph, kan içinde böcekler eşdeğer yol açar. Amper son derece korunmuş otoyol ve yolları sinyal IMD tarafından üretilmektedir. Toll yolu, sinyal memeli için homolog TLR/IL-1R reseptör ve IMD yolu memeli tümör nekrozis faktör-Alfa sinyal için homolog. Drosophila, otoyol sinyal gram-pozitif bakteriler, mantarlar ve Drosophila X virus6,9,10 tarafından indüklenen olduğu ve IMD sinyal Ayagin Gram-negatif bakteriler11 tarafından indüklenen ,12.
Hücresel bağışıklık, kapsülleme, melanization ve fagositoz invaziv patojenlerin oluşan özel kan hemocytes13denilen hücreler tarafından yürütülmektedir. Hemocytes meyve sineği içinde üç sınıf vardır: Kristal hücreleri, lamellocytes ve plasmatocytes13. Larva dolaşımdaki hemocytes % 5 makyaj, kristal hücrelerin patojenler ve ana bilgisayar doku yara sitelerdeki melanization önde gelen proPhenoloxidase (proPO) enzimler serbest bırakın. Normalde sağlıklı embriyo veya larva bulunmayan, Lamellocytes yabancı nesneler kapsülleyen yapisan hücrelerdir. Bu hücreler üzerine pupariation veya parasitizing arı yumurta larva yatırılan zaman indüklenir. Larva hemocytes ve tüm kalan hemocytes erişkinlerde dolaşan % 95 makyaj, fagositik plasmatocytes geliştirme sırasında remodeling doku bir rol oynamaktadır ve özellikle, Drosophila hücresel bağışıklık ana efektör hücresi olarak hizmet vermektedir.
Fagositoz bir acil ve çok önemli savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık; ana bilgisayar epitel bariyeri mikroplar hızlı bir şekilde sardı ve fagositik kan hücreleri tarafından elimine (hücre biyolojisi fagositoz, kapsamlı bir inceleme için bkz: başvuru 14). Germline kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) hemocytes tarihinde patojen tanıması mikroplar moleküler desenleri (PAMPs) ilişkili zaman bu işlemi başlatılır. Bir kez hedeflerine bağlı, PRRs aktin sitoiskeleti remodeling aracılığıyla pseudopods oluşumu neden sinyal cascades başlatın. Pseudopods hangi daha sonra sardı ve doğmakta olan organel, phagosome içselleştirilmiş mikrop, surround. Phagosome hemocyte iç doğru insan ticareti ve etkileşimleri organellerin ile bir dizi acidifies phagosome phagosome olgunlaşma süreci uğrar gibi mikropların yok edilir. Vitro ve hücre memeli Primer hücre biyolojisi çalışmalarında ve fagositoz, memeli Fc-gama reseptör ve C3b reseptörleri15,16gibi düzenleyen faktörler karakterize vesile olmuştur. Yine de, büyük ölçekli ekranları veya içinde vivo çalışmalar yürütme yeteneğini memeli sistemlerinde sınırlıdır.
Burada içinde vivo bir tahlil için ilk David Schneider laboratuvarda 200017tarafından tanıtılan bir yordam temel fagositoz yetişkin meyve sinekleri içinde mevcut. Schneider laboratuvar sesil hemocytes karın sırt gemi kolayca kümelenmiş polistren boncuk ve bakteri phagocytose gösterdi. Fagositoz görselleştirmek için sinekler (örneğin floresein isothiocyanate ile (E. coli -FITC) etiketli E. coli ), fluorescently etiketli parçacıkları ile enjekte edilir parçacıkları, yutmak için hemocytes zaman izin vermek 30 dakika boyunca inkübe ve sonra Kuluçka döneminde değil fagosite parçacıklar Floresans quenches trypan mavi, enjekte. Sinek dorsal damarları sonra ters bir floresan mikroskop kullanarak yansıma. Seminal bu kağıt hemocytes bakteri phagocytose ve lateks boncuklar, bu bakteri fagositoz önceden enjekte edilerek inhibe olabilir gösterdi nispeten basit bir deney kullanarak lateks boncuk ile gider ve bu hem hücresel ve humoral olmadan uçar bağışıklık yanıtı bile E. coliiçin açıktır. Bu raporda sunulan tahlil içinde vivo fagositoz dorsal gemi ilişkili hemocytes tarafından yuttu parçacıklar floresan yoğunluğu ölçme ölçmek için Schneider laboratuvar çalışmalarını kurar.
Benzer şekilde yaklaşım memeli sistemlerinde alınan, Drosophila genetikçileri başlangıçta genom genelinde kullanılan tüp bebek RNAi ekranlar hücresel immün yanıt18,19için,20 gerekli genlerin tanımlamak için ,21,22,23. Ancak, Yetişkin içinde vivo fagositoz tahlil gelişimi izleme denemeleri kolayca böylece biyolojik doğrulamak için araştırmacılar içinde vitro çalışmalarda tespit faktörler rol izin tüm hayvanlarda gerçekleştirilebilmesi etkin. Böyle transmembran reseptör yiyen, ilk24 S2 kullanarak bir RNAi ekranında bakteriyel bir reseptör hücreleri olarak tanımlanan ve Escherichia coli (e.coli), enterokok arabuluculuk için daha sonra gösterilen olduğu faecalistir, ve Staphylococcus aureus (S. aureus) fagositoz yetişkin25.
Laboratuarımızın içinde vivo fagositoz tahlil ileri genetik ekranlar ve genom çapında dernek çalışmaları ( Drosophila genetik başvuru Masası (DGRP) kullanarak) Yetişkin hemocytes fagositoz düzenleyen yeni genlerin tanımlamak için istihdam. Bu çalışmalar için karakterizasyonu reseptörleri PGRP-SC1A ve PGRP-SA26, protein Rab1427, Glutamat ışınlama Polyphemus28ve RNA-bağlayıcı protein Fox-129kaçakçılığı hücre içi vezikül yol açtı.
Biz gelecekte ekranlar içinde vivo fagositoz birleşmeyle Drosophilahücresel bağışıklık yanıtında için önemli ek genler tanımlaması yol açabileceğini tahmin. DGRP veya Drosophila sentetik nüfus kaynak (DSPR), gibi tam olarak sıralı doğuştan hatlarını kullanarak ekranlar fagositoz ya da hemocyte geliştirme etkileyen doğal türevleri tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, teknik Drosophila diğer türler içinde kabul veya olabilir ekran yeni topluluk kaynaklarına, ulusal Drosophila tür stok Merkezi (NDSSC tarafından tutulan 250 Drosophila türler topluluğu gibi kullanılan ) Cornell'de. Bu deneyler ticari olarak kullanılabilir fluorescently etiketli bakteri veya duvar mantar bioparticles kullanarak yürütülen olabilir veya bakteriyel veya mantar türleri-mikrop floresan işaretleri ifade sağlanan herhangi bir sayıda kullanarak yapılamaz .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. floresein parçacıklar enjeksiyon için hazırlayın
- Piyasada bulunan, ısı-öldürüldü bakterilerin 10 mg sulandırmak floresein ile etiketli parçacıklar ( Tablo malzemelerigörmek) 990 µL steril 1 x PBS ve 10 µL 50 mM sodyum azid ekleyerek 10 mg/mL stok bir konsantrasyon için. Girdap karıştırmak için.
- Tek kullanımlık 8 µL aliquots 0.2 mL tüpler içine bölmek ve 4 ° C'de ışık ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için karanlık bir kutu içinde saklayın.
Not: Sodyum azid koruyucu isteğe bağlıdır ve 10 mg/mL hisse senetleri 1 mL steril 1 x PBS ile yapılırsa atlanabilir bölünmemeli ve saklı-20 ° C'de
- Tek kullanımlık 8 µL aliquots 0.2 mL tüpler içine bölmek ve 4 ° C'de ışık ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için karanlık bir kutu içinde saklayın.
- 10 mL solüsyon 500 µL filtre şırınga yeşil gıda renklendirme ve 9.5 mL steril 1 x PBS karıştırarak 1 x PBS boyama %5 yiyeceklerin olun.
- Parçacıklar enjeksiyon sodyum azid kaldırmak için önce yıkayın. Mix 42 µL steril 1 x PBS ve 10 mg/ml 1.7 mL tüp içinde 8 µL. Oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak, oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda 50 µL 1 x PBS ve santrifüj ekleyin.
- 1.3 1.3.1 aygıtlarından 3 yıkama olmak üzere toplam 2 x.
- Son yıkama sonra süpernatant atın ve parçacıklar 1.6 mg/ml 1 x PBS boyama % 5 yiyecek 50 µL yeniden askıya.
- Tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo şal. 4 ° C'de depolayın, 1 hafta sonra atın.
2. istasyonu ve sinekler hazırlamak
- Enjeksiyon pad hazırlayın. Aynı zamanda, bir dikdörtgen CO2 sinek bölmek için kullanım laboratuvar bant Sineklerin Tanrısı 4 genotip 4 bölüme yastık kadar enjekte için. Mikroskop yakındaki bankta bir kez sinekler panelindeki (bir yastık her köşesinde) dizilmiş şişeleri yer alanları belirleyin.
- Şişeleri yaş eşlemeli, 4-7 gün hazırlamak-enjeksiyon için eski, sinekler. Test edilecek her zorlanma için 5 ve 5 erkek hazır sinek gıda taze, etiketli şişe aktarmak ve 25 ° C'de tutmak
- Pnömatik enjektör hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) araç 100 ms (kısa patlamaları sınırdışı sub-nanoliter birimleri teslimini sağlayan sıvı-gaz basıncı) zamanlı moduna ayarlayarak.
- Mikroskop slaytlar hazırlayın. Elektrik bandı 1.5-inç şeritler kesip, yapışkanlı yüzü bir döngü içine katlayın ve etiketli mikroskop slayt yerleştirin.
3. cam kapiller iğneler hazırlayın
- Bir iğne çektirmenin kullanarak cam iğneler (ince duvar cam kılcal) çek.
- İğneyi mikroskop altında bir mikrometre ile tutun ve İpucu #5 para cezası nokta paslanmaz çelik cımbız kullanma kesin. 100 µm ipuçları sinek 's kütikül yaralama en aza indirerek delmek yeterlidir.
- Her sinek enjekte sıvı hacmi ölçmek. İğne steril % 5 Gıda 1 x PBS boyama yükleyin ve sıvı mineral yağ 0,01 mm sahne mikrometre üzerinde bir damla üstüne çıkarmak.
Not: sıvı damlacık küresel ise, picoliters birimindeki (boyut)3/1910 hesaplanır. 30 -ecek dışarı atmak bir iğne ile 100 µm çapı ~ 2 nL 100 ms.
4. enjekte sinekler
- Parafilm küçük bir kare üzerine 1.6 mg/mL parçacıkların 10 µL pipet.
- Sıvı iğne çekin ve mount enjektör meme ( Tablo malzemelerigörmek).
- CO2 sinekli anestezi ve ventral tarafı yukarı ve belgili tanımlık yastık önüne doğru odaklı başkanları ile flypad üzerinde onların belirli alanda sıraya girin. Şişeleri tezgah üzerinde karşılık gelen alanlar yerleştirin.
- Karın üst köşesinde sinekler sıvı (~ 10 nL toplam) 5, 100 ms pompaları ile enjekte.
- Enjekte sinekler için uygun şişeleri aktarmak, şişe üzerinde zaman unutmayın. 25 ° C'de tutmak
- Yeni bir iğne % 0,4 ile yük Trypan mavi çözüm.
- Pnömatik enjektör hava sıvı iğne dışarı itmek için sürekli bir akış sağlayan geçişli, ayarlayın.
- Onlar için 30 dk dinlenmiş sonra sinekler anestezi ve karın tam ve şişmiş olana Trypan mavi ile enjekte.
Not: phagosome olgunlaşma ile pH duyarlı boya etiketli parçacıkları ile incelerken, sinekler için 1 h dinlenmek izin ve trypan montaj sinekler daha önce mavi ile enjekte değil. - Mount mikroskop kaymak ile elektrik bandı, ventral taraftan uçar. Kanatları anında tarafındaki bastırın ve onları teybe güvenli. Ayrıca, anında hareket emin olmak için teyp baş yavaşça itin.
- Hemen adım 5'e taşıyın.
5. görüntüleme uçar
- Görüntü uçar, tek bir seferde, 25 x veya 32 x büyütme ( Tablo malzemelerigörmek) bir dijital fotoğraf makinesi ve bilgisayar bağlı bir ters floresan mikroskop kullanarak. Dijital fotoğraf makinesi için bilgisayar yazılımı kullanarak anında dorsal gemi odaklanmak.
- Çekim hızı ve büyütme deneyler arasında kaydedin.
Not: genotip mefhumunu kaybetme bir potansiyel hata birden fazla suşları tek bir oturuşta çekerken kaynağıdır. Sinekler mislabeling önlemek için ilk ve son uç fotoğraf her genotip için görüntü sayısını not edin.
6. miktarının ve floresan normalleştirme
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve bir anda bir resim açın.
- Dorsal gemi Floresans yoğunluğunu ölçmek. Dorsal geminin bir çokgen çizer. Ölçü birimi seçin ve floresan yoğunluğu çokgen içinde kaydedin.
- Arka plan floresan yoğunluğu belirlemek. İlk çokgen kopyalama ve taşıma bir alana anında dorsal gemiye bitişik. Ölçü ve kayıt floresan yoğunluğu arka plan alanını seçin.
- Dorsal gemi floresan arka plan Floresans tarafından normalize:
Dorsal gemi ÷ arka plan. - Ortalama bir yük tüm sinekli dorsal gemi floresan yoğunluğu normalleştirilmiş hesaplayın.
- 2 kez daha denemeyi tekrarlamak.
- Kullanım bir öğrenci unpaired t-test ortalama göreli Floresans yoğunluklarda kontrol uçar karşılaştırın ve test için üç deneylerden uçar. Formülü kullanarak etkisi boyutu Hesapla: Cohen'in d nerede M1 genotip 1 ortalaması ve M2 genotip 2 ortalaması (M1- M2) ÷ SDhavuza alınan, = &
SD havuza alınan =
Burada SD1 genotip 1 standart sapmasıdır ve SD2 genotip 2 standart sapmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluoresein etiketli parçacıkları kullanma içinde vivo fagositoz testin bir şematik şekil 1Aile gösterilir. Sinekler takılı ventral yan aşağı Elektrik bandı bir parçası üzerinde ve dorsal gemi konumlandırıldığı, karın, ilk iki kesimi açıkça görülebilir (şekil 1B). Anahtar kaynakları deneysel hata enjeksiyon ve yordamın (şekil 1 c) adımını Imaging ortaya. Birden çok sinekler enjekte etmek için aynı iğneyi kullanarak sinek doku veya parçacıkları ile tıkanmış hale için neden olabilir (üst sol paneldeki şekil 1 c). Drosophila auto fluoresces-GFP ışık altında çünkü, tıkanmış bir iğneyle enjekte sinekler hafifçe bulabilsem ama açık, punctate floresan hemocytes tarafından içselleştirilmiş parçacıkların yoksundur. Deneysel hatanın bir başka olası kaynağını Trypan mavi enjeksiyonlar sırasında oluşabilir. Otuz dakika sonra ilk enjeksiyon fluorescently etiketli parçacıkları ile ikinci bir enjeksiyon Trypan mavi, hücre dışı, un fagosite parçacıklar Floresans quenches sinekler alırsınız. Göreli floresan yoğunluğu her sinek dorsal gemi Floresans Bu karın üzerinde eşit büyüklükte bir bitişik alana bölünerek hesaplanır. Yapmak değil almak yeterli Trypan mavi sinek parlak onların tüm karın ( şekil 1 calt sol paneli) bulabilsem. Bu parlak Floresans böylece hayvan doğru floresan yoğunluğu oranında azalan arka plan floresan için dorsal gemi oranını azaltabilir. Aktif taşıma sayılabilir olamaz üretmek bulanık görüntüleri sinekler gibi sonunda, sinekler CO2tarafından immobilize Imia çekildi (üst ve alt, şekil 1 cpanelleri değil).
Tedavi etil methanesulfonate (EMS) oluşan bir panel ile otozomal mutasyonlar uçar Zuker koleksiyonudur. 31 ilk olarak 2004 yılında bir topluluk kaynak olarak kurulan, satırları ileriye ve geriye doğru genetik ekranlar taşımak için kullanılmıştır. Ayagin Gram-negatif phagocytose edemiyor Zuker koleksiyonundan bir çizgi laboratuarımıza tespit (E. coli K-12 zorlanma) ve gram-pozitif bakteriler (S. aureus ahşap zorlanma protein A) (Şekil 2). Argus, denilen bu mutant hemen hemen hiçbir dorsal gemi Floresans içinde vivo fagositoz assay olarak gösterir. Zuker isogenic arka plan zorlanma için karşılaştırıldığında cn bw, argus gösterir önemli ölçüde daha az alımını E. coli (p-değeri = 0,019; Cohen'in d = 1,677) ve S. aureus (p-değeri = 0.0083; Cohen'in d 1.672 =). Bakteriyel fagositoz da önemli ölçüde Argus engelliler, E. coli (p-değeri = 0,045; Cohen'in d = 0.850) ve S. aureus (p-değeri = 0.0136; Cohen'in d 1.422 =) başka bir ortak laboratuvar kontrol soy için Canton-S. karşılaştırıldığında
Şekil 1: Genel bakış ve içinde vivo fagositoz testin temsilcisi görüntüler. A. fluoresein etiketli parçacıkları kullanma içinde vivo fagositoz testin şematik. İki enjeksiyon, 30 dakika uzaklıkta, görüntülenmeyecektir parçacık tanıma ve alımı için dorsal gemi ilişkili kan hücreleri tarafından kullanılır. B. beyaz ışık görüntü teyp, açıkça görünür ön karın parçalarla monte bir sinek gösterilen. C.örnek vivo fagositoz görüntüler. (sol üst) Tıkanmış bir iğneyle enjekte bir sinek yok parçacık Floresans vardır. (sol alt) Yüksek hücre dışı Floresans nedeniyle yetersiz trypan mavi. bir sinek (sağ üst) Hiçbir hücre dışı floresan-ideal görüntü ile bir immobilize sinek. (sağ alt) CO2 anestezi etkisi geçiyor gibi hareketli bir sinek bulanık bir görüntü oluşturur. Ölçek çubuğu, 0.2 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Fagositoz mutant ve denetim bakterilerin uçar. A. fluoresein boya ile; etiketli fagositoz bakterileri temsilcisi görüntüleri E. coli (üst panelleri) ve S. aureus (alt paneller). B. floresan yoğunluğu oranı enjekte floresein -E. coli parçacıklar ile uçar. C. floresan yoğunluğu oranı enjekte floresein -S. aureus parçacıklar ile uçar. n = 3 deney deney başına 6-8 sinekler ile bakteri, her türünün. Hata çubukları, ± SEM istatistiksel analiz iki kuyruklu t -testi =. Ölçek çubuğu, 0.2 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Piyasada bulunan, fluorescently etiketli parçacıklar fagositoz genel (0.2 µm karboksilat-modified mikroküreler) veya fagositoz mikroplar (fluorescently etiketli ısı - veya kimyasal olarak öldürdü bakteri veya Maya) değerlendirmek için kullanılır. Phagosome olgunlaşma değerlendirmek için araştırmacılar pH nötr asidik olduğu gibi phagolysosome inerse fluoresces pH duyarlı boya ile etiketli parçacıklar seçebilirsiniz. Alternatif olarak, fagositoz, patojen tanıma ve alımı ilk adımları incelemek için araştırmacılar içinde ve hücre dışında bulabilsem floresan etiketlerle etiketlenmiş parçacıklar seçmeniz gerekir.
Dikkatle kontrollü deneysel koşullar içinde vivo fagositoz tahlil tekrarlanabilir bir şekilde yürütülen emin olmak için anahtar vardır. İlk olarak, bu nedenle deneyde kullanılan sinekler yaş-eşleşen, en iyi şekilde 4-7 gün eski bir aralık içinde olmalıdır Drosophila hücresel immunosenescence32, uğrar. İkinci olarak, enjeksiyon dönemini tutarlı olması gerekir. Fagositoz hızla, mikrop14algılama konak hücre dakika içinde oluşur. Bir saat içinde phagosome olgunlaşma gerçekleşir, phagosome asitleştirme ve içselleştirilmiş mikrop imha yol. Enjeksiyonları arasında beklemek için belirlenen bir aralıkta tanımlayarak deneysel değişkenliği azaltır ve suşları ve farklı günlerde yapılan deneylerde arasında yapılacak karşılaştırma sağlar. Öneririz ne zaman floresein parçacıklar ve bir saat içinde vivo phagosome olgunlaşma tahlil parçacıkları kullanma için kullanarak etiketli pH duyarlı floresan boya ile otuz dakikadır bekliyorum.
Birden fazla suşları enjekte etmek için aynı iğneyi kullanarak sağlar tüm sinekler parçacıkları aynı doz almak ve deneysel değişkenlik cam ara iğneler Eğer çıkabilir veya tıkanmış olur. Yani, istasyonu ve sinekler önceden ayarlama içinde vivo fagositoz tahlil hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilir sağlanması için anahtardır. Deney başlamadan birkaç iğne tarafından ihraç sıvı hacmi ölçmek ve iğneler aynı boyutta bir dizi korumak. Bir iğne iğne kırılırsa, bu nedenle hemen değiştirilmesi. Ayrıca, tıkanmış iğneler zor olan hemocytes mikroplar phagocytose edemiyoruz sinekler ve floresan parçacıklar almadı sinekler arasında ayrım yapmadan yanlış negatif sonuçlar neden olabilir. Yeşil gıda boyası ile yapılan çözümleri boya, sinekler enjekte izlemek ve tıkanmış iğnelerle sorunları tanımlamak için kolaylaştırmak. İdeal olarak, deneme zorlanma her denemede başına en az 6-8 sinekler ile birden çok kez, gerçekleştirilmesi gereken ve aykırı tanımlamak için deney sonuçları karşılaştırılır. Son olarak, yeterli Trypan mavi arka plan Floresans sinekler (şekil 1 c) arasında karşılaştırılabilir olması tam olarak hücre dışı parçacıklar Floresans gidermek için yönetilmesi.
Ne zaman sinekler Imaging, ayrıca dorsal gemi açık, tutarlı görüntüleri elde etmek için özen gösterilmelidir. Siyah Elektrik bandı karanlık bir arka plan oluşturmak için kullanılır ve sinekler takılı ventral aşağı, kendi kanatları ve yapışkanlı bant kenarına güvenli başkanları ile iyi olur. Mümkünse, görüntüleri alındı ise sinekler CO2 altında immobilize kalması gerekir. Son olarak, deneysel önyargı olasılığı sınırlamak için kör bir deneysel Kur kullanmanızı öneririz; şişeleri ve suşların bir araştırmacı ve deneme tarafından kodlanmış nerede yürütülen ve başka bir araştırmacı tarafından sayılabilir.
İçinde vivo fagositoz tahlil fagositoz genel hataları tanımlamak için yararlı bir araçtır. Ancak, bu hemocyte fagositoz verimlilik ve hemocyte numarası ya da konumu, yaşa bağlı düşüş veya gelişimsel kusurlar nedeniyle farklılıkları ayırt etmez. 32 bunların yanında yordam bilgileri ilgili boyutu ya da bireysel hemocytes fagositik kapasite farklılıkları sağlamaz. Bir kez sinekler azaltılmış fagositoz ile içinde vivo fagositoz tahlil kullanarak tespit edilmiştir, böylece, araştırmacılar İzleme çalışmaları belki bağışıklık ile ilgili fagositoz kusurları arasında ayırımcılık için alternatif parçacıklar, kullanarak devam etmem gerektiğini ve genel fagositik kusurları. Sonuçta, mutant suşları fagositik kusur altında yatan moleküler mekanizmaları belirleyen fagositoz bir sınav içinde tek hemocytes gerektirir. Bu olabilir başarılı, örneğin kullanarak, confocal mikroskobu, Floresans aktif hücre sıralama veya manyetik boncuk yalıtım yetişkin hemocytes27,28,29,32,33 , 34.
Genel olarak, Drosophila Canlı hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık eğitim için etkili bir model olduğu ispatlanmıştır. Burada biz bir bakış içinde vivo fagositoz tahlil, küresel fagositoz ve yetişkin sinekler hücresel bağışıklık yanıtında çalışmaya bir yöntem sağladı. Yordamı uygulanabilir ana savunma için önemli olabilir yeni genler için ekran için büyük ölçekli tüp bebek RNAi perde içinde tanımlanan genlerin doğrulamak ve daha da mutantlar, gut veya antiviral humoral bağışıklık yanıtı kusurları ile karakterize. Kurulum için kolay ve güvenilir veri büyük miktarda sinekler birden fazla suşları hakkında kısa bir miktarda yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Beth Gonzalez ve Dr Aprajita Garg içinde vivo fagositoz deneyleri yürüten destek için teşekkür ederiz. Bir UBV UMD önceden tohum Grant ve UMD NIH T32 eğitim hibeler, hücre ve moleküler biyoloji (SPK) ve ana bilgisayar-patojen etkileşimleri (HPI), bu eser finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
- De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
- Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
- Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
- Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
- Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
- Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
- Meister, M., Lagueux, M.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
- Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
- Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
- Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
- Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
- Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
- Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
- Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
- Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
- Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
- Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
- Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).
