Summary
Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.
Abstract
Bij alle dieren biedt aangeboren immuniteit een onmiddellijke en robuuste verdediging tegen een breed spectrum aan pathogenen. Humorale en cellulaire immuunresponsen zijn de belangrijkste takken van aangeboren immuniteit, en veel van de regulering van deze reacties factoren evolutionair tussen ongewervelden en zoogdieren zijn bewaard. Fagocytose, de centrale component van cellulaire aangeboren immuniteit, wordt uitgevoerd door gespecialiseerde bloed cellen van het immuunsysteem. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een krachtige genetisch model om de moleculaire mechanismen en de fysiologische effecten van fagocytose in hele dieren te onderzoeken. Hier laten we zien een in vivo fagocytose injectie gebaseerde bepaling om te kwantificeren van de particle opname en vernietiging door de cellen van het bloed van de Drosophila , hemocytes. De procedure kan onderzoekers te regelen het deeltje concentratie en dosis, waardoor het kan zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen in een korte hoeveelheid tijd precies. Het experiment is kwantitatieve, gemakkelijk uit te voeren, en kunnen worden toegepast om te screenen op gastheer factoren die invloed pathogen erkenning, opname en goedkeuring.
Introduction
Aangeboren immuun afweer vormen de eerste lijn van verdediging tegen pathogene microben. Deze reacties kunnen functioneel worden onderverdeeld in humorale en cellulaire aangeboren immuniteit, die beide worden gemedieerd door germline-gecodeerde patroon erkenning receptoren (PRRs) die zin pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs)1. Veel van de signaalroutes en effector mechanismen van aangeboren immuniteit zijn bewaard in zoogdieren en ongewervelden, zoals de nematode, Caenorhabditis elegans, en de fruitvlieg, Drosophila melanogaster2. De fruitvlieg heeft ontpopt als een krachtig systeem te bestuderen host verdediging tegen infectieuze micro-organismen3. Drosophila is genetisch hanteerbare, gemakkelijk en goedkoop een ziek rund opgefokt in laboratoria, en heeft een korte generatietijd. Bovendien vertoont de fruitvlieg hoogefficiënte verdedigingen tegen een array van microben, waardoor het onderzoek van de immuniteit van de gastheer tegen virale, bacteriële, schimmel of parasitische ziekteverwekkers.
Drosophila immunologen hebben historisch gebruikt voorwaartse genetische schermen, genoom-brede RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) screening van insecten cellijnen, en reeds bestaande mutant vliegen stammen te onderzoeken van aangeboren immuniteit – leidt tot de identificatie en karakterisering van verschillende evolutionair geconserveerde humorale immune trajecten4,5,6,7,8. De humorale ingeboren immune reactie is, misschien wel, de beste gekenmerkt immuunsysteem verdediging in fruitvliegjes. Na infectie leidt de humorale respons op de productie en de systemische release van antimicrobiële peptide (AMP) moleculen in de Hemolymfe, het bloed gelijk bij insecten. Versterkers zijn geproduceerd door zeer geconserveerde tol en Imd signalering trajecten. De tol-traject is homoloog aan zoogdieren TLR/IL-1R receptor signalering en de Imd-traject is homoloog aan zoogdieren Tumornecrosefactor-alfa signalering. In Drosophila, tol signalering wordt geïnduceerd door gram-positieve bacteriën, schimmels en Drosophila X virus6,9,10 en Imd signalering wordt veroorzaakt door gramnegatieve bacteriën11 ,12.
Cellulaire immuniteit, samengesteld uit inkapselen, melanization en fagocytose van invasieve pathogenen, uitgevoerd door gespecialiseerde bloedcellen genaamd hemocytes13. Er zijn drie klassen van hemocytes in de fruitvlieg: crystal cellen, lamellocytes en plasmatocytes13. Crystal cellen, die make-up van 5% van het circulerende hemocytes in larven, vrij proPhenoloxidase (tot) enzymen leidt tot de melanization van pathogenen en host weefsels op wond sites. Lamellocytes, die niet normaal te in gezonde embryo's of larven vinden, zijn Adherente cellen die vreemde voorwerpen kapselen. Deze cellen worden veroorzaakt bij pupariation of bij parasitizing wasp eieren worden afgezet in de larven. Fagocytische plasmatocytes, die 95 procent van de circulerende hemocytes in larven en alle overige hemocytes bij volwassenen, een rol spelen in de weefsel remodeling tijdens de ontwikkeling en, met name, dienen als de belangrijkste effector cel van Drosophila cellulaire immuniteit.
Fagocytose een onmiddellijke en cruciale lijn van het aangeboren immuunsysteem verdediging; microben die inbreuk op de host epitheliale barrière zijn snel overspoeld en geëlimineerd door fagocytische cellen van het bloed (zie referentie 14voor een algehele herziening van de celbiologie van fagocytose). Dit proces wordt gestart wanneer germline-gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRRs) op hemocytes herkennen pathogen moleculaire patronen (PAMPs) van microben verbonden. Eenmaal gebonden aan hun doelstellingen, initiëren PRRs signalering cascades die tot de vorming van pseudopods via het remodelleren van actine cytoskelet leiden. De pseudopods rondom de microbe, die vervolgens overspoeld en geïnternaliseerd in een ontluikende organel, de phagosome. Microben zijn vernietigd zoals de phagosome het proces van rijping van de phagosome ondergaat wanneer de phagosome is verhandeld naar de binnenzijde van de hemocyte en door middel van een reeks interacties met lysosomen verzuurt. In vitro en cel zijn biologie onderzoek bij zoogdiercellen primaire instrumentale bij de identificatie en karakterisering van de factoren die fagocytose, zoals de zoogdieren Fc-gamma receptor en C3b receptoren15,16 regelengeweest. Echter de mogelijkheid grote schermen of in vivo onderzoek uit te voeren zijn beperkt in zoogdieren systemen.
Hier presenteren we een in vivo assay voor fagocytose in volwassen fruitvliegen, die is gebaseerd op een procedure voor het eerst geïntroduceerd door het laboratorium van David Schneider in 200017. Het Schneider-lab bleek dat sessiele hemocytes geclusterd langs de buik dorsale vaartuig gemakkelijk phagocytose polystyreen kralen en bacteriën. Om te visualiseren fagocytose, vliegen worden geïnjecteerd met fluorescently geëtiketteerde deeltjes (zoals E. coli aangeduid met fluoresceïne-isothiocyanaat (E. coli -FITC)), gedurende 30 minuten tot de hemocytes tijd te verzwelgen de deeltjes, geïncubeerd en vervolgens ingespoten met trypan blauw, die de fluorescentie van deeltjes niet phagocytosed tijdens de incubatieperiode lest. Vliegen dorsale schepen zijn dan beeld met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop. Deze baanbrekende papier, met behulp van een relatief eenvoudig experiment, aangetoond dat hemocytes phagocytose bacteriën en latex kralen, dat bacteriële fagocytose kunnen worden geremd door het injecteren van vooraf vliegt met latex kralen, en dat zonder zowel cellulaire en humorale vliegt immuunresponsen zijn gevoelig zelfs voor E. coli. De bepaling in dit verslag gepresenteerde bouwt voort op het werk van de Schneider-lab te kwantificeren in vivo fagocytose door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van deeltjes opgeslokt door dorsale schip verbonden hemocytes.
Vergelijkbaar met de aanpak van zoogdieren systemen, Drosophila genetici aanvankelijk gebruikt genoom-brede in vitro RNAi schermen ter identificatie van genen die nodig zijn voor de cellulaire immuunrespons18,19,20 ,21,22,23. Echter de ontwikkeling van de volwassen in vivo fagocytose assay ingeschakeld follow-up experimenten gemakkelijk in hele dieren, waardoor onderzoekers om te controleren of de biologische de rol van factoren geïdentificeerd in in vitro onderzoek uit te voeren. Dit was het geval met de transmembrane receptor Eater, die werd voor het eerst geïdentificeerd als een bacteriële receptor in een RNAi-scherm met behulp van S224 cellen en vervolgens later getoond te bemiddelen van Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, en Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytose in volwassenen25.
Onze lab gebruikt de bepaling van de in vivo fagocytose in voorwaartse genetische schermen en genoom-brede vereniging studies (met behulp van de Drosophila genetische referentie paneel (DGRP)) om nieuwe genen die fagocytose in volwassen hemocytes regelen te identificeren. Deze studie leidde tot de karakterisering van de receptoren PGRP-SC1A en PGRP-SA26, de intracellulaire vesikel handel van proteïne Rab1427, glutamaat vervoerder Polyphemus28en RNA-bindende eiwit Fox-129.
Wij verwachten dat toekomstige schermen nemen de in vivo fagocytose kunnen leiden tot de identificatie van extra genen die belangrijk voor de cellulaire immuunrespons in Drosophila zijn. Schermen met behulp van gesequenced ingeteeldestammen, zoals de DGRP of de Drosophila synthetische bevolking Resource (DSPR), kunnen het identificeren van natuurlijke varianten op het gebied van fagocytose of hemocyte ontwikkeling. Bovendien, de techniek kon worden aangenomen bij andere diersoorten Drosophila of gebruikt voor scherm nieuwe communautaire middelen, zoals de collectie van 250 Drosophila soorten onderhouden door de nationale Drosophila soorten voorraad Center (NDSSC ) op Cornell. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescently-geëtiketteerden bacteriële of schimmel-muur bioparticles die commercieel beschikbaar zijn of kunnen worden uitgevoerd met behulp van een willekeurig aantal bacteriële of schimmel soorten – geboden dat de microbe spreekt fluorescente markeringen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepareer fluoresceïne deeltjes injectie
- Reconstrueren van 10 mg van verkrijgbare, warmte-gedood bacteriën deeltjes aangeduid met fluoresceïne (Zie Tabel van materialen) tot een voorraad concentratie van 10 mg/mL door 990 µL steriele 1 x PBS en 10 µL 50 mM natriumazide toe te voegen. Vortex te mengen.
- Verdelen in eenmalig gebruik 8 µL aliquots in 0,2 mL buizen en bewaar in een donkere kast bij 4 ° C tot het minimaliseren van de bijbehorende lichtgevoeligheid.
Opmerking: Natriumazide conserveermiddel is optioneel en kan worden weggelaten als 10 mg/mL voorraden zijn gemaakt met 1 mL steriele 1 x PBS, aliquoted, en opgeslagen bij-20 ° C.
- Verdelen in eenmalig gebruik 8 µL aliquots in 0,2 mL buizen en bewaar in een donkere kast bij 4 ° C tot het minimaliseren van de bijbehorende lichtgevoeligheid.
- Maak een 10 mL oplossing van 5% voedsel kleuren in 1 x PBS door het mengen van 500 µL spuit gefilterd groen voedsel kleurplaten en 9.5 mL steriele 1 x PBS.
- Wassen deeltjes vóór injectie te verwijderen van natriumazide. Mix-42 µL steriele 1 x PBS en 8 µL van 10 mg/mL in een 1,7 mL-buis. Centrifugeer bij max snelheid gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen, voeg 50 µL 1 x PBS en centrifuge op max snelheid gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 1.3 en 1.3.1 2 x, voor een totaal van 3 wasbeurten.
- Na de definitieve wash, verwijder het supernatant en resuspendeer deeltjes tot 1,6 mg/mL in 50 µL van 5% voedsel kleuren in 1 x PBS.
- De buis wikkel in aluminiumfolie te beschermen tegen licht. Bewaren bij 4 ° C, na 1 week negeren.
2. voorbereiding van de injectie station en vliegen
- De injectie pad voor te bereiden. Te injecteren maximaal 4 genotypen van vliegen op hetzelfde moment, gebruik laboratorium tape te verdelen een rechthoekige CO2 vlieg zeem in 4 delen. Op de Bank in de buurt van de Microscoop, aanwijzing van gebieden te plaatsen van de flesjes zodra vliegen hebben zijn opgesteld op het pad (één voor elke hoek van de pad).
- Bereiden van flesjes van leeftijd-matched, 4-7 dagen-oud, vliegen voor injectie. Voor elke soort te worden getest, 5 reutjes en 5 teefjes overboeken naar een frisse, gelabelde flacon van bereid voedsel van de vliegen en houden bij 25 ° C.
- Voorbereiden van de pneumatische injector (Zie Tabel van materialen) door het instrument op een 100 ms (korte uitbarstingen van gasdruk tot uitzetting van de vloeistof – waardoor de levering van sub-nanoliter volumes) tijdmode .
- De Microscoop dia's voor te bereiden. 1.5-inch stroken van elektrische tape knippen, vouwen in een lus met de klevende kant naar buiten en plaats op een gelabelde microscoopglaasje.
3. voorbereiding van de glazen capillaire naalden
- Glas naalden (dunne wand glazen capillairen) met behulp van een naald trekker trek.
- Houd de naald onder de microscoop met een micrometer en breken de tip #5 fijne punt RVS pincet gebruiken. 100 µm tips zijn voldoende te doorboren van de vlieg cuticula terwijl het minimaliseren van de verwonding.
- Het meten van de hoeveelheid vloeistof die zal worden geïnjecteerd in elke vliegen. Laad de naald met steriele 5% voedsel kleuren in 1 x PBS en uitzetting van de vloeistof op een daling van minerale olie op een 0,01 mm fase micrometer.
Opmerking: Als de vloeibare druppel bolvormig is, het volume in de picoliters wordt berekend als (grootte)3/1910. 30 een naald met een diameter van 100 µm zal uitwerpen ~ 2 nL in 100 ms.
4. Injecteer vliegen
- Pipetteer 10 µL van 1,6 mg/mL deeltjes op een pleintje van parafilm.
- Trek de vloeistof in de naald en monteren in de injector mondstuk (Zie Tabel van materialen).
- Anesthetize vliegen met CO2 en ze line-up in hun aangewezen gebied op de flypad, met de ventrale zijde omhoog en de hoofden gericht naar de voorkant van het pad. Plaats flesjes in de desbetreffende oppervlakten op de Bank.
- Vliegen op de bovenste hoek van de buik injecteren met 5, 100 ms pompen van vloeibare (~ 10 nL totaal).
- De geïnjecteerde vliegen aan de juiste flesjes overdragen, Let op de tijd op de flacon. Houden bij 25 ° C.
- Een nieuwe naald met 0,4% laden Trypan blauwe oplossing.
- Stel de pneumatische injector op GATED, waardoor een constante stroom van lucht te duwen de vloeistof uit de naald.
- Anesthetize vliegen nadat ze hebben 30 min rusten en injecteren met Trypan blauw totdat de buik vol en opgezwollen is.
Opmerking: Bij de behandeling van phagosome rijping met deeltjes aangeduid met een pH-gevoelige kleurstof, laten vliegen om uit te rusten voor 1 h en doen niet injecteren met trypan blauwe vóór montage vliegen. - Mount vliegt op Microscoop dia's met elektrische tape, ventrale zijde naar beneden. Druk op de vleugels aan de kant van de vlieg en hen veilig naar de tape. Ook duw voorzichtig het hoofd in de tape om ervoor te zorgen dat de vliegen niet zal verplaatsen.
- Ga onmiddellijk door naar stap 5.
5. beeldvorming vliegt
- Afbeelding vliegt, één tegelijk, op 25 x of 32 x vergroting met behulp van een omgekeerde fluorescentie Microscoop aangesloten op een digitale camera en de computer (Zie Tabel van materialen). Focus op het dorsale vaartuig van het vliegen met behulp van computersoftware voor de digitale camera.
- Noteer de belichtingstijd en vergroting tussen experimenten.
Opmerking: Losing track van genotypen is een potentiële bron van de fout bij het fotograferen van meerdere stammen in een enkele vergadering. Om te voorkomen dat vliegen beleidseenheden, noteer het nummer van de afbeelding van de eerste en laatste vliegen foto voor elk genotype.
6. kwantificeren en normaliseren van de fluorescentie
- Open de software en één afbeelding tegelijk geopend.
- Meet de intensiteit van de fluorescentie van de dorsale vaartuig. Een veelhoekige hotspot tekenen rond het dorsale vaartuig. Selecteer maatregel en de intensiteit van de fluorescentie binnen de veelhoek opnemen.
- Het bepalen van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond. De eerste veelhoek kopiëren en verplaatsen naar een gebied grenzend aan het dorsale vaartuig van de vlieg. Maatregel en de intensiteit van de fluorescentie van de record van het achtergrondgebied selecteren
- Normaliseren van de fluorescentie van de dorsale vaartuig door de fluorescentie van de achtergrond:
Dorsal vaartuig ÷ achtergrond. - Bereken dat het gemiddelde genormaliseerde dorsale vaartuig intensiteit van de fluorescentie van alle vliegen in een stam.
- Herhaal het experiment 2 vaker.
- Gebruik een Student de ongepaarde t-test vergelijken de gemiddelde relatieve fluorescentie intensiteiten van controle vliegen en testen vliegt van de drie experimenten. Bereken de grootte van de effect met behulp van de formule: Cohen d = (M1- M2) ÷ SDgepoolde, waar M1 is het gemiddelde van genotype 1 en M2 is het gemiddelde van genotype 2 &
SD gebundelde =
waar SD1 is de standaarddeviatie van genotype 1 en SD2 is de standaarddeviatie van genotype 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van de bepaling van de in vivo fagocytose met behulp van fluoresce¨ une-geëtiketteerden deeltjes wordt weergegeven in figuur 1A. Vliegen zijn gemonteerd ventrale zijde naar beneden op een stuk van elektrische tape en de eerste twee segmenten van de buik, waar het dorsale schip zich bevindt, is duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Belangrijke bronnen van experimentele fout ontstaan op de injectie en de beeldvorming van de stappen van de procedure (Figuur 1 c). Met behulp van de dezelfde naald te injecteren van meerdere vliegen kan daardoor verstopt raken met vliegen weefsel of deeltjes (bovenste linker paneel in Figuur 1 c). Omdat Drosophila auto-onder GFP licht fluoresceert, zal vliegen geïnjecteerd met een verstopte naald fluoresceren flauw maar gebrek aan de duidelijke, punctate fluorescentie van deeltjes geïnternaliseerd door hemocytes. Een andere mogelijke bron van experimentele fout kan optreden tijdens de Trypan Blue-injecties. Dertig minuten na de eerste injectie met fluorescently-geëtiketteerden deeltjes, krijgen vliegen een tweede injectie met Trypan blauw, dat de fluorescentie van extracellulaire, un-phagocytosed deeltjes lest. Relatieve fluorescentie intensiteit voor elke fly wordt berekend door de fluorescentie van de dorsale vaartuig door een even grote aangrenzende gebied op de buik. Vliegen die niet genoeg blauw Trypan krijgen lichten helder gedurende hun hele buik (onderkant linker paneel van Figuur 1 c). Deze heldere fluorescentie kan verminderen de verhouding van het dorsale schip tot achtergrond fluorescentie, dus het verminderen van de ware fluorescentie intensiteit verhouding van het dier. Ten slotte vliegen moeten worden gefotografeerd terwijl geïmmobiliseerd door CO2, als actief bewegen vliegt produceren wazige beelden die niet kunnen worden gekwantificeerd (boven en onder, rechts panelen van Figuur 1 c).
De Zuker-collectie is een panel van ethyl methanesulfonate (EMS) behandeld vliegt met autosomaal mutaties. 31 oorspronkelijk opgericht als een gemeenschap resource in 2004, werden de lijnen gebruikt voor het uitvoeren van forward en reverse genetische schermen. Onze lab geïdentificeerd een lijn uit de Zuker-collectie die niet kan phagocytose gram-negatieve bacteriën (E. coli K-12 stam) en gram-positieve bacteriën (S. aureus hout stam zonder EiwitA) (Figuur 2). Deze mutant, genaamd argus, toont bijna geen dorsale vaartuig fluorescentie in de analyse van in vivo fagocytose. In vergelijking met de stam van de isogene achtergrond Zuker cn bw, argus toont aanzienlijk minder verbreiding van E. coli (p-waarde = 0.019; Cohen d = 1.677) en S. aureus (p-waarde = 0.0083; Cohen d = 1.672). Argus bacteriële fagocytose is ook aanzienlijk verminderde, E. coli (p-waarde = 0.045; Cohen d = 0.850) en S. aureus (p-waarde = 0.0136; Cohen d = 1.422) in vergelijking met een ander gemeenschappelijk laboratorium controlestam, Canton-S.
Figuur 1: Overzicht en representatieve beelden van in vivo fagocytose assay. A. schematische van de bepaling van de in vivo fagocytose met behulp van fluoresce¨ une-geëtiketteerden deeltjes. Twee injecties, 30 minuten uit elkaar, worden gebruikt om gevisualiseerde deeltje erkenning en opname door de dorsale vaartuig-geassocieerde bloedcellen. B. wit licht beeld tonen van een vlieg gemonteerd op band, met duidelijk zichtbare anterior abdominale segmenten. C. voorbeeld in vivo fagocytose beelden. (links bovenaan) Een vlieg geïnjecteerd met een verstopte naald heeft geen deeltje fluorescentie. (linker benedenhoek) Een vlieg met hoge extracellulaire fluorescentie vanwege onvoldoende trypan blauwe. (rechts boven) Een immobilize vliegen met geen extracellulaire fluorescentie-ideaalbeeld. (rechtsonder) Een vlieg verplaatsen creëert zoals CO2 verdoving slijt af een onscherp beeld. Schaal bar, 0.2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Fagocytose van bacteriën in de mutant en controle vliegen. A. representatieve beelden van fagocytose bacteriën gemarkeerd met kleurstof fluoresceïne; E. coli (bovenste panelen) en S. aureus (onderste panelen). B. de fluorescentie intensiteit verhouding tussen vliegt ingespoten met fluoresceïne -E. coli deeltjes. C. de fluorescentie intensiteit verhouding tussen vliegt ingespoten met fluoresceïne -S. aureus deeltjes. n = 3 experimenten voor elk type van bacteriën, met 6-8 vliegen per experiment. Foutbalken, ± SEM. statistische analyse = tweezijdige t -test. Schaal bar, 0.2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verkrijgbare, fluorescently geëtiketteerde deeltjes worden gebruikt voor het beoordelen van fagocytose in het algemeen (0,2 µm carboxylaat gemodificeerde microbolletjes) of fagocytose van microben (fluorescently-geëtiketteerden warmte - of chemisch gedode bacteriën of gist). Om te beoordelen phagosome rijping, kunnen onderzoekers selecteren deeltjes aangeduid met een pH-gevoelige kleurstof die fluoresceert als pH van neutrale tot zure, zoals in de phagolysosome afneemt. U kunt ook te onderzoeken van de eerste stappen van fagocytose, pathogen erkenning en opname, moeten onderzoekers kiezen deeltjes die zijn gelabeld met de fluorescerende labels die binnen en buiten de cellen lichten.
Zorgvuldig gecontroleerde experimentele omstandigheden zijn de sleutel om dat de fagocytose in vivo bepaling is uitgevoerd op een reproduceerbare wijze. Eerst ondergaat Drosophila cellulaire immunosenescence32, dus vliegen gebruikt in het experiment leeftijd-matched, optimaal binnen een bereik van 4-7 dagen oud moet. Ten tweede, de periode tussen injecties moeten verenigbaar zijn. Fagocytose gebeurt snel, binnen enkele minuten van de gastheercel sensing de microbe14. Over het komende uur worden uitgezonden plaatsvindt phagosome rijping, wat leidt tot de verzuring van de phagosome en de vernietiging van de verinnerlijkte microbe. Aanwijzing van een ingestelde interval wachttijd tussen injecties vermindert experimentele variabiliteit en maakt vergelijkingen worden gemaakt tussen stammen en experimenten uitgevoerd op verschillende dagen. Het is raadzaam wacht dertig minuten wanneer met behulp van fluoresce¨ une deeltjes en één uur voor de in vivo phagosome rijping assay met behulp van deeltjes aangeduid met pH-gevoelige fluorescente kleurstof.
Met behulp van de dezelfde naald te injecteren van meerdere stammen zorgt ervoor dat alle vliegen dezelfde dosisniveaus van deeltjes ontvangen en experimentele variabiliteit zich voordoen kan als glas verder breinld zonder knop pauze of verstopt raken. Dus, het opzetten van de injectie station en vliegen vooraf is noodzakelijk om te garanderen dat de in vivo fagocytose assay snel en efficiënt wordt uitgevoerd. Voordat u het experiment start, meten van de hoeveelheid vloeistof uitgezet door verschillende naalden en behouden van een set van naalden van dezelfde grootte. Dus, als een naald tussen injecties breekt, het kan direct vervangen worden. Verstopte naalden kunnen bovendien leiden tot vals-negatieve resultaten, waardoor het moeilijk te onderscheiden tussen vliegen waarvan hemocytes niet in staat zijn om phagocytose van microben en vliegen die geen fluorescerende deeltjes. Kleurstof oplossingen gemaakt met groene voedselkleuring, gemakkelijker bijhouden welke vliegen zijn ingespoten en identificeren van problemen met verstopte naalden. In het ideale geval het experiment moet worden uitgevoerd meerdere keren, met ten minste 6-8 vliegen per stam in elk experiment, en de resultaten van experimenten in vergelijking met het identificeren van uitschieters. Tot slot moet genoeg Trypan blauw worden toegediend om de fluorescentie van extracellulaire deeltjes volledig te doven zodat de achtergrond fluorescentie vergelijkbaar tussen vliegen (Figuur 1 c is).
Wanneer imaging vliegen, moet ook worden gezorgd om heldere, consistente beelden van het dorsale schip. Zwarte isolatietape is gebruikt voor het maken van een donkere achtergrond en vliegen moet gemonteerde ventrale zijde omlaag, met hun vleugels en hoofden bevestigd aan de zelfklevende kant van de band. Indien mogelijk, moeten vliegen blijven geïmmobiliseerdet onder CO2 terwijl images zijn geschoten. Tot slot, als u wilt beperken de mogelijkheid van experimentele bias, raden we een geblindeerde experimentele opzet; waar flesjes en stammen zijn gecodeerd door een onderzoeker en het experiment is uitgevoerd en gekwantificeerd volgens een andere onderzoeker.
De in vivo fagocytose assay is een nuttig instrument om wereldwijde gebreken in fagocytose identificeren. Het maakt echter geen onderscheid tussen de hemocyte fagocytose efficiëntie en verschillen in hemocyte-nummer of locatie, als gevolg van de daling van de leeftijdsgebonden of developmental gebreken. 32 voorts de procedure levert geen informatie over de verschillen in de grootte of de fagocytische capaciteit van individuele hemocytes. Dus, zodra vliegen met verminderde fagocytose zijn geïdentificeerd met behulp van de in vivo fagocytose assay, onderzoekers moeten follow-up studies verrichten, misschien met behulp van alternatieve deeltjes, om te discrimineren tussen de immuun-gerelateerde fagocytose gebreken en algemene fagocytische gebreken. Uiteindelijk, bepaling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fagocytische gebreken in gemuteerde stammen vereist een bestudering van fagocytose in één hemocytes. Dit kan worden bereikt met behulp van, bijvoorbeeld, confocal microscopie, fluorescentie geactiveerd cel sorteren of magnetische kraal isolatie van volwassen hemocytes27,28,29,32,33 , 34.
Over het geheel genomen heeft Drosophila bewezen een effectieve model om te studeren van aangeboren immuniteit in levende dieren. Wij hebben hier een overzicht van de in vivo fagocytose assay, een methode om te studeren de globale fagocytose en de cellulaire immuunrespons in volwassen vliegen verstrekt. De procedure kan worden toegepast om te screenen op nieuwe genen die belangrijk zijn voor de verdediging van de gastheer kunnen zijn, genen geïdentificeerd in grootschalige in vitro RNAi schermen te valideren en verder karakteriseren mutanten met gebreken in de humorale, gut of antivirale immuunrespons. Het is gemakkelijk aan opstelling en een grote hoeveelheid van betrouwbare gegevens over meerdere stammen van vliegen in een korte hoeveelheid tijd kan opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Beth Gonzalez en Dr. Aprajita Garg voor steun bij de uitvoering van de in vivo fagocytose experimenten. Een NSF UMD vooraf zaad Grant en UMD NIH T32 opleiding subsidies, cel en moleculaire biologie (CMB) en de gastheer-pathogeen interacties (HPI), gefinancierd dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
- De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
- Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
- Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
- Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
- Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
- Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
- Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
- Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
- Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
- Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
- Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
- Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
- Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
- Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
- Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
- Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
- Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
- Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).
