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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Abstract

Bei allen Tieren bietet die angeborene Immunität eine sofortige und robuste Verteidigung gegen ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Humorale und zelluläre Immunantwort sind die Hauptzweige der angeborenen Immunität, und viele der Faktoren, die zur Regelung dieser Reaktionen sind evolutionär konserviert zwischen Wirbellosen und Säugetiere. Phagozytose, die zentraler Bestandteil der zellulären angeborenen Immunität erfolgt durch spezialisierte Zellen des Immunsystems. Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, entstanden als ein leistungsfähiges genetisches Modell, die molekularen Mechanismen und physiologischen Auswirkungen der Phagozytose in ganze Tiere zu untersuchen. Hier zeigen wir einen Injektion-basierte in-vivo Phagozytose Assay um die Partikel Aufnahme und Zerstörung von Blutkörperchen Drosophila , Hemocytes zu quantifizieren. Das Verfahren ermöglicht Forschern genau steuern die Partikelkonzentration und Dosis, macht es möglich, hoch reproduzierbare Ergebnisse in kürzester Zeit zu erhalten. Das Experiment ist quantitativ, einfach durchzuführen, und Bildschirm für Host Faktoren dieser Einfluss Erreger Anerkennung, Aufnahme und Abstand angewendet werden können.

Introduction

Angeborenen Immunabwehr bilden die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Keime. Diese Reaktionen können funktionell humorale und zelluläre angeborene Immunität unterteilt werden, die beide durch Keimbahn-kodierte Muster Anerkennung Rezeptoren (PRRs), die Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs)1Sinn vermittelt werden. Ein Großteil der Signalwege und Effektor Mechanismen der angeborenen Immunität sind bei Säugetieren und Wirbellose Tiere, wie z. B. der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans und der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster2konserviert. Die Fruchtfliege ist ein leistungsfähiges System Host Verteidigung gegen infektiöse Mikroorganismen3studieren entstanden. Drosophila ist genetisch gefügig, einfach und kostengünstig in Laboratorien, aufgezogen und hat eine kurze Generationszeit. Darüber hinaus weist der Fruchtfliege hoch effiziente Abwehr gegen ein Array von Mikroben, die Prüfung der Host Immunität gegen virale, bakterielle, Pilze oder parasitäre Erreger aktivieren.

Drosophila Immunologen haben historisch verwendet vorwärts genetischer Bildschirme, genomweiten RNA-vermittelte Interferenz (RNAi screening von Insekten Zelllinien und bereits vorhandene mutierte Fliege Stämme um angeborene Immunität – führt zu untersuchen) die Identifizierung und Charakterisierung der mehrere evolutionär konservierte humorale Immunsystem Wege4,5,6,7,8. Die angeborene humorale Immunantwort ist wohl, das beste gekennzeichnet Immunabwehr bei Fruchtfliegen. Nach Infektion führt die humorale Antwort zu die Produktion und die systemische Freisetzung von antimikrobiellen Peptid (AMP) Moleküle in die Hämolymphe, das Blut gleichwertig in Insekten. Verstärker sind von hoch konservierte Maut und Imd Signalwege produziert. Der Maut-Pfad ist homolog zu Säugetieren TLR/IL-1R-Rezeptor Signalgebung und der Imd-Pfad ist homolog zu Säugetieren Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha-Signalisierung. In Drosophila, Maut Signalisierung wird induziert durch Gram-positiven Bakterien, Pilze und Drosophila X Virus6,9,10 und Imd Signalisierung wird induziert durch gramnegative Bakterien11 ,12.

Zelluläre Immunität, bestehend aus Kapselung, Melanization und Phagozytose invasive Erreger durch spezialisierte Blutkörperchen genannt Hemocytes13durchgeführt. Es gibt drei Klassen von Hemocytes in der Taufliege: Kristall Zellen, Lamellocytes und Plasmatocytes13. Kristall-Zellen, die machen 5 % der zirkulierenden Hemocytes in Larven frei ProPhenoloxidase (d) Enzyme führt zu Melanization Erreger und Wirt Gewebe an Wunde Stellen. Lamellocytes, die normalerweise nicht in gesunden Embryonen oder Larven gefunden werden, sind adhärente Zellen, die Fremdkörper zu Kapseln. Diese Zellen induziert werden, beim Pupariation oder beim Fliegen Wespe Eier in die Larven hinterlegt sind. Phagocytic Plasmatocytes, die 95 % der zirkulierenden Hemocytes bei Larven und alle restlichen Hemocytes bei Erwachsenen ausmachen, spielen eine Rolle im Gewebe Umbau während der Entwicklung und vor allem dienen als die wichtigsten Effektor-Zelle von Drosophila zelluläre Immunität.

Phagozytose eine unmittelbare und entscheidende Linie der angeborenen Immunabwehr; Mikroben, die die Host epitheliale Barriere zu durchbrechen sind schnell verschlungen und eliminiert durch phagocytic Blutzellen (für eine umfassende Überprüfung der Zellbiologie der Phagozytose siehe Referenz 14). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn Keimbahn-codierte Mustererkennung Rezeptoren (PRRs) auf Hemocytes Erreger erkennen molekulare Muster (PAMPs) von Mikroben verbunden. Nach der Bindung an ihre Ziele, initiieren PRRs Signalisierung Kaskaden, die zur Bildung von Scheinfüßchen durch Aktin Zytoskelett Umgestaltung führen. Die Scheinfüßchen umgeben die Mikrobe, die anschließend verschlungen und in einer im Entstehen begriffenen Organell, das Phagosom verinnerlicht. Mikroben sind zerstört, als die Phagosom das Phagosom Reifung durchläuft wenn das Phagosom Opfer von in Richtung des Inneren der Hemocyte Menschenhandel ist und durch eine Reihe von Wechselwirkungen mit Lysosomen säuert. In Vitro und Zelle haben Studium der Biologie in Säugetierzellen Primary maßgeblich bei der Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die Phagozytose, wie Säugetier-Fc-Gamma-Rezeptor und C3b Rezeptoren15,16zu regulieren. Dennoch sind die Fähigkeit zum Ausführen von großen Bildschirmen oder in vivo Studien in Säugetier-Systeme beschränkt.

Hier präsentieren wir Ihnen einen in-vivo Assay für Phagozytose bei Erwachsenen Fruchtfliegen, basiert auf einem Verfahren erstmals im Labor von David Schneider in 200017. Das Schneider-Labor zeigte, dass festsitzende Hemocytes gruppierten entlang der Abdominal-dorsalen Gefäß leicht Polystyrol-Kügelchen und Bakterien phagozytieren. Um Phagozytose zu visualisieren, fliegen mit Gewebekulturen beschrifteten Partikel (z. B. E. Coli mit Fluorescein erfolgt (E. Coli -FITC) gekennzeichnet), injiziert sind für 30 Minuten zu Hemocytes Zeit, um die Partikel zu verschlingen inkubiert und dann mit Trypan blau, die die Fluoreszenz der Partikel nicht phagozytiertes während der Inkubationszeit stillt injiziert. Fliegen dorsalen Gefäße werden dann abgebildet mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop. Diese Samen-Papier mit ein relativ einfaches Experiment nachgewiesen, dass Hemocytes Bakterien phagozytieren und Latex Perlen, dass bakterielle Phagozytose durch die Injektion von Pre gehemmt werden können mit Latex Perlen fliegt und fliegt ohne zelluläre und humorale Immunantworten sind auch anfällig für E. Coli. Der Test in diesem Bericht vorgestellten baut auf der Arbeit von Schneider-Lab, in-vivo Phagozytose durch Messung der Fluoreszenzintensität von Partikeln durch dorsale Schiff verbundenen Hemocytes verschlungen zu quantifizieren.

Ähnlich wie bei dem Ansatz Säugetier-Systeme, Drosophila Genetiker ursprünglich verwendet genomweite in-vitro-RNAi-Bildschirme um zu identifizieren, die für die zelluläre Immunantwort18,19,20 erforderlich ,21,22,23. Jedoch ermöglichte die Entwicklung des Erwachsenen in-vivo Phagozytose Assays Follow-up-Experimente bereitwillig in ganze Tiere, so dass Forscher die biologischen überprüfen die Rolle der Faktoren, die in in-vitro-Studien durchgeführt werden. Dies war der Fall mit dem transmembrane Rezeptor Esser, die zunächst als ein bakterielle Rezeptor in einer RNAi-Bildschirm mit S224 Zellen identifiziert und dann später gezeigt, um Escherichia coli (E. Coli),, Enterococcus vermitteln Faecalis, und Staphylococcus Aureus (S. Aureus) Phagozytose in Erwachsene25.

Unser Labor beschäftigt die in-vivo Phagozytose Assay in vorwärts genetischer Bildschirme und genomweite Assoziationsstudien (unter Verwendung der Drosophila genetische Referenz Panel (DGRP)), um neuartige Gene zu identifizieren, die Phagozytose in Erwachsenen Hemocytes zu regulieren. Diese Studien führten bis hin zur Charakterisierung der Rezeptoren PGRP-SC1A und PGRP-SA26, die intrazelluläre Vesikel Handel Protein Rab1427, die Glutamat-Transporter Polyphem28und RNA-bindende Protein Fox-129.

Wir gehen davon aus, dass zukünftige Bildschirme unter Einbeziehung der in-vivo Phagozytose zur Identifizierung von zusätzlichen Gene führen könnte, die wichtig für die zelluläre Immunantwort bei Drosophilasind. Bildschirme mit vollständig sequenziert Inzuchtlinien, z. B. die DGRP oder die Drosophila synthetische Bevölkerung Ressource (DSPR), können natürliche Varianten die Phagozytose oder Hemocyte Entwicklung zu identifizieren. Darüber hinaus könnte die Technik angenommen in andere Arten von Drosophila oder verwendet, um Bildschirm neue Community-Ressourcen, wie z. B. die Sammlung von 250 Drosophila -Arten gepflegt durch die nationalen Drosophila Arten Lager Center (NDSSC ) an der Cornell University. Diese Experimente durchgeführt werden können mit Gewebekulturen beschriftet bakterielle oder Pilzinfektionen-Wand Bioparticles, die im Handel erhältlich sind oder können mit einer beliebigen Anzahl von bakterielle oder Pilzinfektionen Arten – vorausgesetzt, dass die Mikrobe fluoreszierenden Marker drückt durchgeführt werden .

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Protocol

1. bereiten Sie Fluorescein Partikel zur Injektion

  1. 10 mg im Handel erhältlichen, Hitze getötet Bakterien rekonstruieren Partikel mit Fluorescein gekennzeichnet (siehe Tabelle der Materialien) Lager Konzentration von 10 mg/mL durch Zugabe von 990 µL steriler 1 X PBS und 10 µL 50 mM Natriumazid. Vortex mischen.
    1. In Einweg-8 µL-Aliquots in 0,2 mL Röhrchen teilen und speichern in einer dunklen Box bei 4 ° C, Lichtempfindlichkeit verbunden zu minimieren.
      Hinweis: Konservierungsmittel Natriumazid ist optional und kann weggelassen werden, wenn Aktien 10 mg/mL mit 1 mL sterilen 1 X PBS vorgenommen werden regelmÄÑig und bei-20 ° c gelagert
  2. Eine 10 mL-Lösung 5 % Lebensmittelfarbe in 1 X PBS durch Mischen von 500 µL Spritze gefiltert grüne Lebensmittel Färbung und 9,5 mL sterilen 1 X PBS zu machen.
  3. Waschen Sie Partikel vor der Injektion, Natriumazid zu entfernen. Mix-42 µL steriler 1 x PBS und 8 µL von 10 mg/mL in einer 1,7 mL Tube. Zentrifugieren Sie bei max. Geschwindigkeit 2,5 min bei Raumtemperatur.
    1. Entfernen Sie den Überstand zu, fügen Sie 50 µL 1 x PBS und Zentrifuge mit max. Geschwindigkeit 2,5 min bei Raumtemperatur.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.3.1 2 X, für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.
    3. Verwerfen Sie nach der letzten Wäsche überstand und erneut aussetzen Sie Partikel bis 1,6 mg/mL in 50 µL 5 % Lebensmittelfarbe in 1 X PBS.
    4. Wickeln Sie das Rohr in Alufolie um vor Licht zu schützen. Lagerung bei 4 ° C, nach 1 Woche entsorgen.

2. bereiten Sie die Injektion Station und fliegen

  1. Vorbereiten der Injektion-Pad. Bis zu injizieren pad 4 Genotypen fliegen gleichzeitig Verwendung Labor Band eine rechteckige CO2 Fliege aufteilen in 4 Abschnitte. Bezeichnen Sie auf der Bank in der Nähe des Mikroskops Bereiche, die Fläschchen zu platzieren, wenn fliegen haben auf dem Pad (eine für jede Ecke des Pads) ausgekleidet.
  2. Fläschchen mit Alter abgestimmt, 4-7 Tage vorbereiten-alt, fliegen für die Injektion. Für jede Belastung zu prüfenden transfer 5 Rüden und 5 Hündinnen in ein frisches, beschrifteten Fläschchen des Gargutes fliegen und halten bei 25 ° C.
  3. Vorbereiten den pneumatischen Injektor (siehe Tabelle der Materialien) indem das Instrument auf einen 100 ms (kurze Bursts von Gas-Druck, die Flüssigkeit – ermöglicht die Lieferung von Sub-Nanoliter Bände zu vertreiben) TIMED -Modus.
  4. Bereiten Sie den Objektträger. Schneiden Sie 1,5-Zoll-Streifen Isolierband, in eine Schleife mit der klebenden Seite nach außen Falten Sie und legen Sie auf einen beschrifteten Objektträger.

3. bereiten Sie Glas Kapillare Nadeln

  1. Ziehen Sie Glas-Nadeln (dünne Wand Glaskapillaren) mit einer Nadel Abziehvorrichtung ab.
    1. Halten Sie die Nadel unter dem Mikroskop mit einem Mikrometer und brechen Sie den Tipp #5 feine Spitze Edelstahl Pinzette. 100 µm-Tipps sind ausreichend, um die Fliege Nagelhaut zu durchbohren, bei gleichzeitiger Minimierung der Verwundung.
    2. Messen Sie das Volumen der Flüssigkeit, die in jede Fliege injiziert wird. Laden Sie die Nadel mit sterilen 5 % Lebensmittelfarbe in 1 X PBS und vertreiben Sie die Flüssigkeit auf einen Tropfen von Mineralöl auf einer Bühne Mikrometer 0,01 mm.
      Hinweis: Wenn das flüssige Tröpfchen kugelförmig ist, ist das Volumen in Picoliters (Größe)3/1910 berechnet. 30 eine Nadel mit einem Durchmesser von 100 µm wird ausgeworfen ~ 2 nL in 100 ms.

(4) injizieren fliegen

  1. Pipette 10 µL von 1,6 mg/mL Partikel auf einem kleinen Platz des Parafilm.
    1. Ziehen Sie die Flüssigkeit in die Nadel und montieren in der Einspritzdüse (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Betäuben Sie fliegen mit CO2 zu und richten sie in ihrem ausgewiesenen Bereich auf das Flypad mit der ventralen Seite nach oben und die Köpfe auf der Vorderseite des Pads ausgerichtet. Fläschchen in den entsprechenden Bereichen auf der Bank Platz.
    3. Fliegen in der oberen Ecke des Bauches mit 5, 100 ms-Pumpen von Flüssigkeiten (~ 10 nL gesamt) zu injizieren.
    4. Übertragen Sie die injizierten fliegen auf die geeignetsten Fläschchen, notieren Sie sich die Zeit auf dem Fläschchen. Halten Sie bei 25 ° C.
  2. Laden Sie eine neue Nadel mit 0,4 % Trypan blau Lösung.
  3. Legen Sie die pneumatische Injektor auf GATED, ermöglicht einen konstanten Luftstrom um die Flüssigkeit aus der Nadel schieben.
  4. Fliegen zu betäuben, nachdem sie für 30 Minuten ausgeruht haben und Spritzen mit Trypan blau, bis der Bauch voll und aufgetrieben ist.
    Hinweis: Bei der Prüfung von Phagosom Reifung mit Partikeln beschriftet mit einem pH-Sensitive Farbstoff fliegen für 1 h ruhen lassen und nicht mit Trypan blau vor Montage fliegen injizieren.
  5. Montieren Sie fliegen auf Objektträger mit Isolierband, Bauchseite nach unten. Schieben Sie die Flügel auf die Seite der Fliege und sichern Sie sie auf das Band. Auch, schieben Sie vorsichtig den Kopf in die Band um sicherzustellen, dass die Fliege nicht verschoben werden.
  6. Sofort fahren Sie mit Schritt 5.

(5) Bildgebung fliegen

  1. Bild fliegt, eine zu einem Zeitpunkt, bei 25 X oder 32 X Vergrößerung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop angebracht, eine Digitalkamera und einen Computer (siehe Tabelle der Materialien). Konzentrieren Sie sich auf der dorsalen Gefäß der Fliege mit Computer-Software für die digitale Kamera.
  2. Notieren Sie die Belichtungszeit und Vergrößerung zwischen Experimente.
    Hinweis: Verlust des Genotypen eine potenzielle Fehlerquelle ist, wenn mehrere Stämme in einer einzigen Sitzung zu fotografieren. Um zu vermeiden, falsche Etikettierung fliegen, notieren Sie die Bildnummer des ersten und letzten fliegen Fotos für jeden Genotyp.

(6) zu quantifizieren und die Normalisierung der Fluoreszenz

  1. Öffnen Sie die Software, und öffnen Sie ein Bild zu einem Zeitpunkt.
    1. Messen der Fluoreszenzintensität des dorsalen Schiffes. Zeichnen Sie ein Polygon um den dorsalen Gefäß. Wählen Sie messen und zeichnen Sie der Fluoreszenzintensität innerhalb des Polygons auf.
    2. Die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu bestimmen. Kopieren Sie das erste Polygon und verschieben Sie sie in einen Bereich angrenzend an der dorsalen Gefäß der Fliege. Wählen Sie messen und aufzeichnen Fluoreszenzintensität von den Hintergrundbereich.
    3. Die dorsalen Gefäß Fluoreszenz durch die Hintergrundfluoreszenz zu normalisieren:
      Dorsalen Gefäß ÷ Hintergrund.
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche dorsalen Gefäß Fluoreszenzintensität alle fliegen in einem Stamm normalisiert.
    5. Wiederhole das Experiment 2 weitere Male.
    6. Verwendung ein Student der ungepaarten t-Test, um die mittlere relative Fluoreszenz-Intensitäten der Steuerung fliegen vergleichen und testen Sie fliegt aus den drei Experimenten. Berechnen der Effektgröße mit Hilfe der Formel: Cohens d = (M1- M2) ÷ SDgebündelt, wo M1 ist der Mittelwert der Genotyp 1 und M2 ist der Mittelwert der Genotyp 2 &
      SD gepoolte =Equation
      wo SD1 ist die Standardabweichung der Genotyp 1 und SD2 ist die Standardabweichung der Genotyp 2.

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Representative Results

Abbildung 1Azeigt eine schematische Darstellung des in-vivo Phagozytose Assays mit Fluorescein-markierten Partikeln. Fliegen sind berittene Bauchseite nach unten auf ein Stück Isolierband und die ersten beiden Segmente des Abdomens, wo der dorsale Gefäß befindet, ist deutlich sichtbar (Abb. 1 b). Hauptquellen der experimentellen Fehler entstehen bei der Injektion und imaging-Schritte des Verfahrens (Abbildung 1). Mit der gleichen Nadel mehrere fliegen zu injizieren kann dazu führen, dass mit Fliege Gewebe oder Partikel verstopft (oberen linken Bereich in Abbildung 1). Da Drosophila Auto-unter GLP Licht fluoresziert, werden fliegen mit einem verstopften Nadel injiziert fluoreszieren schwach aber fehlt die klare, punktförmige Fluoreszenz von Partikeln durch Hemocytes verinnerlicht. Eine weitere mögliche Quelle der experimentellen Fehler kann auftreten, während die Trypan blau-Injektionen. Dreißig Minuten nach der ersten Injektion mit Gewebekulturen gekennzeichnet Partikel erhalten fliegen eine zweite Injektion mit Trypan blau, das die Fluoreszenz des extrazellulären, UN-phagozytiertes Partikel stillt. Relativen Fluoreszenzintensität für jede Fliege ist die Fluoreszenz des dorsalen Gefäß durch dividiert, die von einem gleich großen angrenzenden Bereich auf dem Bauch. Fliegen, die nicht genug Trypan blau erhalten fluoreszieren hell während ihrer gesamten Unterleib (linken Bodenplatte der Abbildung 1). Diese helle Fluoreszenz kann das Verhältnis des dorsalen Schiffes auf Hintergrundfluoreszenz, damit Verringerung der wahre Fluoreszenz Intensitätsverhältnis des Tieres verringern. Schließlich fliegen sollte fotografiert werden zwar von CO2, immobilisiert als aktiv bewegen produzieren verschwommene Bilder fliegt, die nicht quantifiziert werden kann (oben und unten, Platten aus Abbildung 1rechts).

Zuker Collection ist ein Gremium von Ethyl Methanesulfonate (EMS) behandelt mit autosomal Mutationen fliegt. 31 ursprünglich als eine gemeinschaftliche Ressource im Jahr 2004 gegründet, wurden die Linien zur vorwärts- und genetische Bildschirme durchzuführen. Unser Labor identifiziert eine Linie von Zuker Auflistung, nicht in der Lage, gramnegative phagozytieren (E. Coli k-12-Stamm) und Gram-positiven Bakterien (S. Aureus Holz Stamm ohne Protein A) (Abbildung 2). Dieser Mutante, genannt Argus, zeigt fast keine dorsalen Gefäß-Fluoreszenz in der Phagozytose in-vivo-Test. Im Vergleich zu dem Zuker isogenen Hintergrund Stamm, Cn bw, Argus zeigt deutlich weniger Aufnahme von E. Coli (p-Wert = 0,019; Cohens d = 1,677) und S. Aureus (p-Wert = 0.0083; Cohens d = 1.672). ARGUS bakterielle Phagozytose ist auch deutlich beeinträchtigt, E. Coli (p-Wert = 0,045; Cohens d = 0.850) und S. Aureus (p-Wert = 0.0136; Cohens d = 1.422) im Vergleich zu anderen gemeinsamen Kontrolle Laborstamm, Kanton-S.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht und repräsentative Bilder von in-vivo Phagozytose Assay. A. schematische des in-vivo Phagozytose Assays mit Fluorescein-markierten Partikeln. Zwei Injektionen, 30 Minuten auseinander, werden visualisierte Partikel Anerkennung und Aufnahme von dorsalen Gefäß-assoziierten Blutkörperchen verwendet. B. weißes Licht Bild zeigt eine Fliege auf dem Band, mit deutlich sichtbaren vorderen Abdominalsegmente montiert. C. Beispiel in Vivo Phagozytose Bilder. (oben links) Eine Fliege mit einer verstopften Nadel injiziert hat keine Partikel Fluoreszenz. (unten links) Eine Fliege mit hohen extrazellulären Fluoreszenz wegen unzureichender Trypan Blau. (oben rechts) Ein Unbeweglichkeitseffekt fliegt mit keine extrazellulären Fluoreszenz – Idealbild. (unten rechts) Eine Fliege bewegen schafft wie CO2 Anästhesie nachlässt ein verschwommenes Bild. Maßstabsleiste, 0,2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Phagozytose von Bakterien in Mutant und Kontrolle fliegen. A. repräsentative Bilder von Phagozytose Bakterien beschriftet mit Fluorescein Farbstoff; E. Coli (Paneele) und S. Aureus (untere Verkleidungen). B. die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis von fliegt injiziert mit Fluorescein -E. Coli Partikel. C. die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis von fliegt injiziert mit Fluorescein -S. Aureus Partikel. n = 3 Experimente für jede Art von Bakterien, mit 6-8 fliegen pro Versuch. Fehler bars, ± SEM statistische Analyse = zwei-tailed t -Test. Maßstabsleiste, 0,2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Handelsübliche, Eindringmittel beschrifteten Partikel werden zur Phagozytose im Allgemeinen (0,2 µm Carboxylat-modifizierte Mikrosphären) oder Phagozytose von Mikroben (Eindringmittel beschriftet Hitze- oder chemisch tote Bakterien oder Hefe) zu beurteilen. Um Phagosom Reifung zu beurteilen, können Forscher wählen Sie Partikel beschriftet mit einem pH-Sensitive-Farbstoff, der fluoresziert, wenn der pH-Wert von neutral zu sauer, wie in der Phagolysosome abnimmt. Alternativ um die ersten Schritte der Phagozytose, Erreger Anerkennung und Aufnahme zu untersuchen, sollten Forscher wählen Partikel beschriftet mit fluoreszierenden Tags, die innerhalb und außerhalb der Zellen zu fluoreszieren.

Sorgfältig kontrollierte Versuchsbedingungen sind der Schlüssel um sicherzustellen, dass die in-vivo Phagozytose Assay reproduzierbar durchgeführt wird. Zunächst durchläuft Drosophila zellulären Immunoseneszenz32, also fliegen in das Experiment verwendet Alter abgestimmt, optimal in einem Bereich von 4-7 Tage alt sein sollte. Zweitens sollte der Zeitraum zwischen den Injektionen konsistent sein. Phagozytose tritt schnell, innerhalb weniger Minuten von der Wirtszelle spüren die Mikrobe-14. Im Laufe der nächsten Stunde findet Phagosom Reifung führt zur Versauerung der Phagosom und Zerstörung der verinnerlichten Mikrobe. Benennung einer eingestellten Intervalls zwischen den Injektionen warten experimentelle Variabilität reduziert und ermöglicht Vergleiche zwischen Stämmen und Experimente an verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Es wird empfohlen, warten 30 Minuten wenn mit Fluorescein Partikel und eine Stunde für die in-vivo Phagosom Reifung Assay mit Partikeln mit pH-Sensitive Leuchtstofffärbung beschriftet.

Mit der gleichen Nadel mehrere Stämme zu injizieren sorgt dafür, dass alle fliegen die gleiche Dosis von Partikeln erhalten und experimentelle Variabilität entstehen kann, wenn Glas Bruch Nadeln oder verstopft. So ist die Einrichtung der Injektion Station und fliegen im Vorfeld Schlüssel dafür, dass der Phagozytose in-vivo-Test schnell und effizient durchgeführt wird. Messen Sie vor Beginn des Experiments das Volumen der Flüssigkeit, die durch mehrere Nadeln vertrieben und behalten Sie eine Reihe von Nadeln gleicher Größe. So bricht eine Nadel zwischen den Injektionen, kann es sofort ersetzt werden. Darüber hinaus können verstopfte Nadeln führen zu falsch-negativen Ergebnissen, so dass es schwierig zu unterscheiden, deren Hemocytes Mikroben phagozytieren können, fliegen und fliegen, die nicht fluoreszierende Partikeln erhalten haben. Färben Sie Lösungen mit grüner Lebensmittelfarbe, machen Sie es leichter zu verfolgen, welche fliegen injiziert wurde und um Probleme mit verstopften Nadeln zu identifizieren. Im Idealfall das Experiment mehrere Male mit mindestens 6-8 fliegen pro Stamm in jedem Experiment durchgeführt werden sollte und die Ergebnisse von Experimenten verglichen, um Ausreißer zu identifizieren. Zu guter Letzt sollte genügend Trypan blau verabreicht werden, um die Fluoreszenz der extrazelluläre Partikel voll zu stillen, so dass die Hintergrundfluoreszenz zwischen fliegen (Abbildung 1) vergleichbar ist.

Beim Fliegen abbilden, sollte auch darauf geachtet werden, um klare, konsistente Bilder des dorsalen Schiffes zu erhalten. Schwarzes Isolierband wird verwendet, um einen dunklen Hintergrund erstellen und fliegen sollte montierten Bauchseite nach unten, mit ihren Flügeln und Köpfe auf der Klebeseite des Bandes befestigt. Wenn möglich, sollte fliegen immobilisierten unter CO2 bleiben, während Bilder getroffen werden. Schließlich, um die Möglichkeit der experimentellen Voreingenommenheit zu begrenzen, empfehlen wir, mit Hilfe einer verblindeten Versuchsaufbau; wo Vials und Stämme durch ein Forscher und das Experiment codiert sind ist durchgeführt und durch ein anderer Forscher quantifiziert.

Die in-vivo Phagozytose-Assay ist ein nützliches Instrument zur globalen Fehler in Phagozytose zu identifizieren. Es unterscheidet jedoch nicht zwischen Hemocyte Phagozytose Effizienz und Unterschiede in der Hemocyte Zahl oder Lage, aufgrund von altersbedingten Verfall oder Entwicklungsschäden. 32 im übrigen enthält das Verfahren nicht auf Unterschiede in der Größe oder phagocytic Kapazität der einzelnen Hemocytes Informationen. So, sobald fliegen mit reduzierten Phagozytose mit der Phagozytose in-vivo-Test identifiziert wurden, sollten Forscher Follow-up Studien durchführen vielleicht mit alternativen Partikel, um die Unterscheidung zwischen immunvermittelte Phagozytose Mängel und allgemeine phagocytic Mängel. Letztlich erfordert die Bestimmung der molekularen Mechanismen, die mutierte Stämme phagocytic Mängel zugrunde liegen Prüfung der Phagozytose in einzelne Hemocytes. Dies kann sein versierter verwenden, zum Beispiel, konfokale Mikroskopie, Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortier- oder magnetische Wulst Isolierung der Erwachsenen Hemocytes27,28,29,32,33 , 34.

Alles in allem, Drosophila erweist sich ein effektives Modell, angeborene Immunität mit lebenden Tieren zu studieren. Hier haben wir eine Übersicht über die in-vivo Phagozytose-Assay, eine Methode, um die globale Phagozytose und die zelluläre Immunantwort bei Erwachsenen fliegen lernen bereitgestellt. Das Verfahren kann angewendet werden für neue Gene auf dem Bildschirm, die möglicherweise wichtig für Host Verteidigung, Gene identifiziert in umfangreichen in-vitro-RNAi-Screens zu validieren, und weitere Mutanten mit defekten in die humorale, Darm- oder antivirale Immunantwort zu charakterisieren. Es kann ist leicht einzurichten und in kurzer Zeit eine große Menge an zuverlässigen Daten über mehrere Stämme von fliegen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Beth Gonzalez und Dr. Aprajita Garg für Unterstützung bei der Durchführung der Phagozytose in-vivo-Experimente. Ein NSF UMD ADVANCE Seed Grant und UMD NIH T32 Ausbildung Zuschüsse, Zelle und Molekularbiologie (CMB) und der Wirt-Pathogen Interaktionen (HPI) finanziert diese Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 146 Phagozytose Bakterien zelluläre Immunität Drosophila Melanogaster angeborenen Immunität Erwachsene
Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege <em>Drosophila Melanogaster</em>, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay
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Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

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