Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Этот протокол описывает в естественных условиях фагоцитоза assay в взрослых Drosophila melanogaster для количественного определения фагоцитарной признание и распродажа микробной инфекции.

Abstract

У всех животных врожденного иммунитета обеспечивает немедленное и надежное обороны против широкого спектра патогенных микроорганизмов. Гуморальный и клеточный иммунный ответ являются основными отраслями врожденного иммунитета, и многие факторы, регулирующие эти ответы эволюционно консервируют между беспозвоночных и млекопитающих. Фагоцитоз, центральный компонент клеточной врожденного иммунитета, осуществляется специализированными кровяных клеток иммунной системы. Плодовой мушки Drosophila melanogaster, стала мощным генетических модель для изучения молекулярных механизмов и физиологические последствия фагоцитоза в целом животных. Здесь мы показываем на основе инъекции в естественных условиях фагоцитоза assay для количественного определения поглощения частиц и уничтожения клетками крови дрозофилы , hemocytes. Процедура позволяет исследователям точно контролировать концентрации частиц и дозы, что позволяет получить высокую воспроизводимость результатов в короткий промежуток времени. Эксперимент, количественных, легко выполнить и может быть применен к экран для принимающей факторов, что влияние возбудителя признание, поглощение и распродажа.

Introduction

Врожденной иммунной защиты являются первой линией обороны против болезнетворных микробов. Эти ответы могут быть функционально разделена на гуморальный и клеточный врожденного иммунитета, оба из которых являются опосредовано кодировке микрофлорой шаблон признание рецепторов (ПРРС) которые чувствуют патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs)1. В млекопитающих и беспозвоночных, таких как нематода, Caenorhabditis elegans и плодовой мушки Drosophila melanogaster2сохраняются многие из сигнальные пути и механизмы эффекторных врожденного иммунитета. Плодовая муха стала мощной системы для изучения принимающей обороны против инфекционных микроорганизмов3. Дрозофилы генетически шансов справиться с возникающими, легко и недорого, выращенные в лабораториях и имеет время коротких поколения. Кроме того фрукты fly экспонатов высокоэффективных оборону против массив микробов, позволяя рассмотрение принимающих иммунитет против вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарные патогенов.

Дрозофилы иммунологов исторически использовали вперед генетических экраны, геном общесистемной РНК опосредованной вмешательства (RNAi) скрининг насекомых клеточных линий и существующие мутант летать штаммов для изучения врожденного иммунитета – приводит к определение и характеристика несколько эволюционно сохранены гуморального иммунного пути4,5,6,,78. Врожденное гуморальный иммунный ответ, вероятно, лучший характеризуется иммунной обороны в плодовых мух. После инфекции гуморальный ответ приводит к производства и системных выпуска антимикробного пептида (AMP) молекул в гемолимфа, крови, эквивалент в насекомых. Усилители производятся высоко сохранены платных и Imd, сигнальные пути. Путь платных гомологичных для млекопитающих рецепторы TLR/Ил 1R сигнализации, и путь Imd гомологичных млекопитающих фактор некроза опухоли альфа сигнализации. В платных дрозофилы, сигнализации индуцируется грамположительных бактерий, грибов и Виру дрозофилы Xs6,9,10 и Imd сигнализации индуцируется грамотрицательных бактерий11 ,12.

Клеточный иммунитет, состоящая из инкапсуляции, melanization и фагоцитоз инвазивных патогенов, осуществляют специализированные клетки крови, называемые hemocytes13. Существует три класса hemocytes в плодовой мухи: кристалл клетки, lamellocytes и plasmatocytes13. Кристалл клетки, которые составляют 5% циркулирующего hemocytes в личинки, выпуск proPhenoloxidase (редложить) ферментов приводит к melanization патогенов и принимающих тканей на участках раны. Lamellocytes, которые обычно не встречаются в здоровых эмбрионов или личинок, являются адэрентных клеток, которые инкапсулируют посторонних предметов. Эти клетки наведены на pupariation или когда паразитирующих осы яйца залегают в личинки. Фагоцитирующих plasmatocytes, которые составляют 95% циркулирующих hemocytes в личинок и все остальные hemocytes в взрослых, играть определенную роль в ткани, Ремоделирование во время разработки и, в частности, служат в качестве основных эффекторных клеток дрозофилы клеточного иммунитета.

Фагоцитоз немедленное и решающее значение линии иммунной защиты; микробы, которые нарушают принимающей эпителиальных барьер быстро охватил и устраняется фагоцитирующих клеток крови (всеобъемлющий обзор клеточной биологии фагоцитоза см. в Справочник 14). Этот процесс инициируется при кодировке микрофлорой распознавание рецепторов (ПРРС) на hemocytes признать возбудителя связанные молекулярные структуры (PAMPs) микробов. Когда-то привязаны к их цели, РРСС инициировать сигнальных каскадов, которые приводят к образованию ложноножки через ремоделирования Цитоскелет актина. Ложноножки окружают Микроб, который впоследствии охватил и включены в зарождающейся органеллы, фагосомы. Микробы уничтожаются как фагосомы проходит процесс созревания фагосомы, когда фагосомы торговли в глубь кровяные и подкисляет через серию взаимодействий с лизосом. In vitro и ячейки биологии исследования в mammalian клетках первичной играют важную роль в идентификации и установлению характеристик факторов, которые регулируют фагоцитоза, например млекопитающих Fc-гамма-рецептор и C3b рецепторов,1516. Тем не менее возможность выполнения крупномасштабных экраны или в естественных условиях исследования ограничены в mammalian системами.

Здесь мы представляем в естественных условиях assay для фагоцитоза в взрослых плодовых мух, которая основана на процедуре, впервые представленный в лаборатории Дэвида Шнайдер в 2000 году17. Шнайдер лаборатории показали, что скальный hemocytes кластерного вдоль брюшной спинной судна легко фагоцитировать шарики полистироля и бактерий. Чтобы визуализировать фагоцитоза, мух вводят с дневно обозначенные частиц (например, кишечной палочки с флуоресцеин Изотиоцианаты (E. coli -FITC)), инкубировали 30 минут позволить hemocytes время, чтобы поглотить частицы, а затем вводится с Трипановый синий, который утоляет флуоресценции частиц не phagocytosed во время инкубационного периода. Затем весь спинной судов отражаются с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные. Этот семенных бумаги, используя сравнительно простой эксперимент, показали, что hemocytes фагоцитоз бактерий и латексные шарики, что бактериальных фагоцитоза могут тормозится предварительно инъекций летит с латексные шарики, и что летает без клеточных и гуморальных иммунные реакции даже подвержен кишечной палочки. Анализа, представленные в настоящем докладе основывается на результатах работы Шнайдер лаборатории для количественного определения в естественных условиях фагоцитоза путем измерения интенсивности флуоресценции частиц, обхватил спинной судно связанного hemocytes.

Подобно подходу, применяемому в mammalian системами, генетики дрозофилы первоначально используется генома всей в vitro RNAi экраны для идентификации генов, необходимых для клеточный иммунный ответ18,19,20 ,21,22,23. Однако развитие взрослых в естественных условиях фагоцитоза assay включен последующих экспериментов, чтобы легко осуществляться в целом животных, таким образом позволяя исследователям для проверки биологического роль факторов, выявленных в исследования in vitro. Так обстояло дело с трансмембранного рецептор Eater, которая была впервые выявлена как бактериальный рецептор RNAi на экране с помощью S2 клетки24 и затем позднее показано посредником Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, и золотистый стафилококк (S. aureus) фагоцитоза в взрослых25.

Наша лаборатория занятых в естественных условиях фагоцитоза assay вперед генетических экранов и генома всей ассоциации исследований (с использованием дрозофилы группа генетических ссылки (DGRP)) для выявления роман гены, которые регулируют фагоцитоза в взрослых hemocytes. Эти исследования привели к характеристике рецепторов PGRP-SC1A и PGRP-са26, внутриклеточный везикул людьми белка Rab1427, глютамат транспортер Полифем28и RNA-связывая протеин Фокс-129.

Мы ожидаем, что будущие экраны, включения в естественных условиях фагоцитоза может привести к выявлению дополнительных генов, которые являются важными для клеточный иммунный ответ у дрозофилы. Экраны с помощью полностью виртуализированных инбредных линий, таких как DGRP или дрозофилы ресурсов синтетических населения (DSPR), можно определить природные варианты влияющие фагоцитоза или кровяные развития. Кроме того техника может быть принят в других видов дрозофила или используется для экрана нового сообщества ресурсы, такие как коллекции 250 видов дрозофилы , поддерживали центр фондовой (NDSSC видов национальной дрозофилы ) в Корнелльском университете. Эти эксперименты может осуществляться с помощью дневно меченых бактериальной или грибковой стенки bioparticles, которые доступны коммерчески или может осуществляться с помощью любое количество бактериальных или грибковых видов-условии, что микроб выражает флуоресцентные маркеры .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте флуоресцеин частиц для инъекций

  1. Воссоздания 10 мг коммерчески доступных, жар убитые бактерий частицы, помечены флюоресцеином (см. Таблицу материалы) на складе концентрации 10 мг/мл, добавляя 990 мкл стерильные ПБС и азид натрия 50 мм 10 мкл. Вихрь смешивать.
    1. Разделите на 8 мкл аликвоты одноразового использования в 0,2 мл пробирок и хранить в темной коробке при 4 ° C для сведения к минимуму связанного светочувствительность.
      Примечание: Азид натрия предохранитель является необязательным и может быть опущено, если акции 10 мг/мл с 1 мл стерильного ПБС, aliquoted и хранятся при температуре-20 ° C.
  2. Сделайте раствор 10 мл 5% пищевой краситель в однократном ПБС, смешивая 500 мкл шприц фильтруют зеленый food окраску и 9,5 мл стерильного ПБС.
  3. Вымойте частиц до инъекции для удаления азид натрия. Мкл стерильные 1 Mix 42 x PBS и 8 мкл 10 мг/мл в 1,7 мл трубку. Центрифуга на Макс скорость за 2,5 мин при комнатной температуре.
    1. Удалить супернатант, добавьте 50 мкл 1 x PBS и центрифуги на Макс скорость за 2,5 мин при комнатной температуре.
    2. Повторите шаги 1.3 и 1.3.1 2 x, для в общей сложности 3 стирок.
    3. После окончательного вымыть удалить супернатант и вновь приостановить частиц 1,6 мг/мл в 50 мкл 5% пищевой краситель в однократном ПБС.
    4. Оберните трубу в алюминиевой фольги для защиты от света. Хранить при 4 ° C, выбросьте после 1 недели.

2. Подготовьте инъекции станции и мух

  1. Подготовьте площадку инъекции. Придать до 4 генотипов мух в то же время, использование лабораторных Лента разделить прямоугольной Муха2 CO площадку на 4 секции. На скамейке рядом с микроскопом обозначения районов для размещения флаконов после мухи были выстроились на площадку (один для каждого угла площадки).
  2. Подготовить ампул по возрасту совпадают, 4-7 дней-старый, мух для инъекций. Для каждого штамма проверяемый передача 5 кобелей и 5 сук в свежий, обозначенные флакон полуфабрикаты покупать и хранить при температуре 25 ° C.
  3. Подготовить пневматические форсунки (см. Таблицу материалы), установив инструмент в 100 мс (короткие всплески давления газа высылать жидкости – позволяя доставки суб nanoliter томов) временный режим.
  4. Подготовьте скольжениях микроскопа. Вырежьте полоски 1,5 дюймовый изоленты, сложить в петлю с клейкой стороной наружу и место на обозначенные микроскопа.

3. подготовить стеклянные капиллярные иглы

  1. Вытяните стекла иглы (тонкие стены стеклянные капилляры) с помощью иглы съемник.
    1. Удерживая иглу под микроскопом с микрометра и разорвать отзыв, используя пинцет из нержавеющей стали тонкой точке #5. 100 мкм советы являются достаточными для прокалывания мухи кутикулы при сведении к минимуму ранив.
    2. Измерьте объем жидкости, которые будут вводиться в каждом летать. Загрузить игла с стерильных 5% пищевой краситель в однократном ПБС и высылать жидкость на падение минерального масла на стадии микрометра 0,01 мм.
      Примечание: Если жидкие капли имеет сферическую форму, объем в пиколитров рассчитывается как (размер)3/1910. 30 иглы диаметром 100 мкм будет извлечь ~ 2 nL в 100 мс.

4. внедрить мух

  1. Пипетка 10 мкл частиц 1,6 мг/мл на небольшой площади парафина.
    1. Забирают жидкость в иглу и смонтировать в сопло инжектора (см. Таблицу материалы).
    2. Анестезировать мух с CO2 и выстроить их в их участком на flypad, с вентральной стороне вверх и руководителями, ориентированные на передней панели. Место флаконов в соответствующих областях на скамейке.
    3. Придать летит в верхней части живота с 5, 100 мс насосы жидкости (~ 10 nL всего).
    4. Передать соответствующие флаконы вводят мух, обратите внимание на время на флаконе. Хранить при температуре 25 ° C.
  2. Загрузить новый игла с 0,4% Трипановый синий раствор.
  3. Установите пневматические форсунки УСЛОВНЫЙ, который позволяет постоянный поток воздуха, чтобы подтолкнуть жидкость из иглы.
  4. Анестезировать мух, после того, как они отдыхали на 30 минут и вводить с Трипановый синий, до тех пор, пока живот полный и растянутый.
    Примечание: При рассмотрении фагосомы созревания с частицами, помечены с рН чувствительных красителя, позволяют мух на отдых за 1 час и не вводите с Трипановый синий до монтажа мух.
  5. Гору летит на скольжениях микроскопа с изоляционной лентой, вентральной стороне вниз. Нажимай на стороне лету крылья и закрепите их на ленту. Кроме того аккуратно вставьте головку в ленту, чтобы обеспечить, что летать не будет двигаться.
  6. Сразу перейти к шагу 5.

5. Визуализация мух

  1. Изображение плавает, один в то время, 25 x или 32 кратном увеличении с помощью микроскопа Перевернутый флуоресценции придает цифровой камеры и компьютера (см. Таблицу материалы). Сосредоточиться на спинной корабля летать с помощью компьютерного программного обеспечения для цифровой камеры.
  2. Запишите время экспозиции и увеличение между экспериментов.
    Примечание: Теряя генотипов является потенциальным источником ошибки при фотографировании несколько штаммов в один присест. Чтобы избежать неправильной мух, запишите номер изображения первого и последнего летать фотографии для каждого генотипа.

6. Количественная оценка и нормализующее флюоресценция

  1. Откройте программное обеспечение и одного изображения за один раз.
    1. Измеряют интенсивность флуоресценции спинной судна. Нарисуйте многоугольник вокруг спинной судна. Выберите меру и записывать интенсивности флуоресценции внутри полигона.
    2. Определите интенсивность флуоресценции фона. Скопируйте первый полигона и переместить его в районе, прилегающем к спинной корабля летать. Выберите меру и запись флуоресценции интенсивности области фона.
    3. Нормализовать флуоресценции спинной судна по флуоресценции фон:
      Дорсальная судно ÷ фон.
    4. Вычислить среднее нормированный интенсивности флуоресценции спинной судна всех мух в штамм.
    5. Повторите эксперимент 2 еще раз.
    6. Использование студентом непарные t-тест для сравнения средняя относительная флуоресценции интенсивности управления мух и проверить летит из трех экспериментов. Рассчитать размер эффекта, используя формулу: Коэна d = (1M - M2) ÷ SDпула, где M1 среднее генотипа 1 и M2 среднее генотипа 2 &
      SD обобщённые =Equation
      где SD1 — стандартное отклонение генотипа 1 и SD2 — стандартное отклонение генотипа 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема анализа в естественных условиях фагоцитоза, с использованием меченных флуоресцеин частиц показан на рисунке 1A. Мухи вентральной боковых вниз на куском изоленты и первых двух сегментов живота, где находится спинной судно, ясно видны (рис. 1B). Основные источники экспериментальной ошибки возникают на месте инъекции и визуализации шаги процедуры (рис. 1 c). С помощью той же иглой впрыснуть несколько мух может привести к его засоряются с летать ткани или частицы (верхняя левая панель в Рисунок 1 c). Потому что дрозофилы auto флуоресцирует под светом GFP, мух, вводится иглой забиты флуоресцировать слабо, но отсутствие четких, пунктата флуоресценции частиц, относить на счет hemocytes. Еще одним потенциальным источником экспериментальной ошибки могут возникнуть во время инъекции Трипановый синий. Тридцать минут после первой инъекции с дневно меченых частиц, мух получают второй инъекции с Трипановый синий, который утоляет флуоресценции внеклеточная, снимите фагоцитированы частиц. Относительный флуоресценции интенсивности для каждого fly рассчитывается путем деления флуоресценции спинной судна, что одинаково размера прилегающие области на животе. Мух, которые не получают достаточно Трипановый синий флуоресцировать ярко всей их весь живот (нижней левой панели Рисунок 1 c). Этот яркий флуоресцентной может уменьшить соотношение спинной судна для фона флуоресценции, тем самым уменьшая коэффициент интенсивности истинный флуоресценции животного. Наконец, мухи должны быть сфотографированы при иммобилизованных на CO2, как активно двигаться летит производят размытые изображения, которые не могут быть количественно (верхней и нижней, правой панели Рисунок 1 c).

Цукер коллекции является группа этиловый метансульфонат (EMS) лечение летит с аутосомно-мутации. 31 первоначально создана как ресурс сообщества в 2004 году, линии были использованы для проведения прямого и обратного генетического экраны. Наша лаборатория определила линию из коллекции Цукер, которые не могут фагоцитировать грамотрицательных (штаммE. coli K-12) и грамположительных бактерий (S. aureus древесины деформации без белка A) (рис. 2). Этот мутант, называется argus, показывает почти не спинной судно флуоресценции в assay в естественных условиях фагоцитоза. По сравнению с штамм isogenic фон Цукер, cn bw, argus показывает значительно меньше поглощение E. coli (p-значение = 0,019; Коэн d = 1,677) и S. aureus (p-значение = 0,0083; Коэн d = 1.672). Argus, фагоцитоз бактерий является также значительно обесценения, E. coli (p-значение = 0,045; Коэн d = 0.850) и S. aureus (p-значение = 0,0136; Коэн d = 1.422) по сравнению с другой общей Лаборатория управления штамм, кантон-S.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор и представитель изображения в естественных условиях фагоцитоза пробирного. A. схема анализа в естественных условиях фагоцитоза, с использованием меченных флуоресцеин частиц. Две инъекции, 30 минут друг от друга, используются для визуализированных частиц признание и поглощение спинной судна связанных клеток крови. B. белый свет изображения показаны Муха монтируется на ленте, с отчетливо видна передней брюшной сегментами. C. пример в vivo фагоцитоза изображений. (вверху слева) Fly, вводят с забиты иглы имеет без частиц флуоресценции. (внизу слева) Муха с высоким внеклеточного флуоресценции из-за недостаточной Трипановый синий. (вверху справа) Обездвиживания летать с не внеклеточного флуоресценцией – идеальный образ. (внизу справа) Муха движущихся как CO2 анестезии прекратит создает размытые изображения. Линейки, 0.2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Фагоцитоз бактерий в мутанта и управления мух. A. представитель изображений фагоцитоз бактерий, помечены краски флуоресцеин; E. coli (верхней панели) и S. aureus (нижней панели). B. соотношение интенсивности флуоресценции летит вводили с fluorescein -E. coli частиц. C. соотношение интенсивности флуоресценции летит вводили с fluorescein -S. aureus частиц. n = 3 эксперименты для каждого вида бактерий, с 6-8 мух на эксперимент. Ошибка бары, ± SEM. статистического анализа = двустороннее t -теста. Линейки, 0.2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Коммерчески доступных, дневно обозначенные частиц используются для оценки фагоцитоза в целом (0,2 мкм карбоксилат модифицированные микросферы) или фагоцитоза микробов (дневно меченых тепло - или химически убил бактерий или дрожжи). Чтобы оценить фагосомы созревания, исследователи можно выбрать частицы с рН чувствительных краска, которая флуоресцирует когда рН снижается от нейтральных к кислой, как фаголизосом. Кроме того изучить первоначальные шаги фагоцитоза, признание возбудителя и поглощения, исследователи должны выбрать частицы, помечены флуоресцентные метки, которые флуоресцировать внутри и вне клетки.

Тщательно контролируемых экспериментальных условиях являются ключом для обеспечения в естественных условиях фагоцитоза пробирного осуществляется в духе воспроизводимость. Во-первых дрозофила подвергается сотовой immunosenescence32, поэтому мух, используемые в эксперименте должен быть возраст совпадают, оптимально в диапазоне 4-7 дней. Во-вторых в период между инъекциями должно быть последовательным. Фагоцитоз происходит быстро, в течение нескольких минут зондирования Микроб14клетки-хозяина. В течение следующего часа фагосомы созревания занимает место, приводит к подкислению фагосомы и уничтожение интернализированных микроба. Обозначения заданный интервал ожидания между инъекциями снижает экспериментально изменчивость и позволяет проводить сопоставления между штаммов и экспериментов, проведенных в разные дни. Рекомендуется подождать 30 минут, когда с помощью флуоресцеин частиц и один час для assay созревания в естественных условиях фагосомы, с помощью частицы помечены рН чувствительных Люминесцентную краску.

С помощью той же иглой впрыснуть несколько штаммов гарантирует, что все мухи получают ту же дозу частиц и экспериментальной изменчивости могут возникнуть, если стекло иглы перерыв или засоряются. Таким образом Настройка впрыска станции и мух заранее является ключом к обеспечению того, что в естественных условиях фагоцитоза assay осуществляется быстро и эффективно. Перед началом эксперимента, измерить объем жидкости, изгнаны несколько игл и сохранить набор игл того же размера. Таким образом если одна игла перерывы между инъекциями, он может немедленно заменить. Кроме того забитые иглы может привести к ложным отрицательные результаты, что делает его трудно отличить мух, которого hemocytes не могут фагоцитировать микробов и мух, которые не получили флуоресцентные частицы. Краситель решения с зеленый пищевой краситель, сделать его проще отслеживать, какие мухи были введены и для выявления проблем с забиты иглы. В идеале эксперимент должен выполняться несколько раз, с наименее 6-8 мух на штамм в каждом эксперименте, и результаты экспериментов по сравнению с выявления останцы. Наконец достаточно Трипановый синий должно осуществляться полностью утолить флуоресценции внеклеточного частиц, так что фон флуоресценции сопоставима между мух (рис. 1 c).

При визуализации мух, также следует получить ясные, последовательные изображения спинной судна. Черной изоленты используется для создания темный фон и мухи должны быть установлены вентральной стороне вниз, с их крылья и головки, обеспеченных клейкой ленты. Если возможно мух должна оставаться иммобилизованных под CO2 в то время как изображения взяты. Наконец чтобы ограничить возможность экспериментально предвзятости, мы рекомендуем использовать ослепленный экспериментальной установки; где флаконов и штаммов кодируются один исследователь и эксперимент осуществляется и количественно другой исследователь.

В естественных условиях фагоцитоза assay является полезным инструментом для выявления глобальных дефекты в фагоцитозе. Однако он не различает кровяные эффективность фагоцитоза и различия в кровяные номер или место, из-за связанных с возрастом снижение или пороки развития. 32 . Кроме того, процедура не предоставляют информацию о различиях в размер или фагоцитарной способности отдельных hemocytes. Таким образом когда мух с снижение фагоцитоза были определены с использованием assay в естественных условиях фагоцитоза, исследователи следует проводить последующие исследования, возможно с использованием альтернативных частицы, чтобы различать фагоцитоза, связанные с иммунной дефектов и общие дефекты фагоцитов. В конечном счете определение молекулярных механизмов, которые лежат в основе фагоцитарной дефекты в мутантных штаммов требует изучения фагоцитоза в одном hemocytes. Это может быть достигнуто с помощью, например, конфокальная микроскопия, активированных флуоресцированием сортировки или магнитный шарик изоляция клетки взрослого hemocytes27,28,,2932,33 , 34.

В целом дрозофила оказалась эффективной моделью для изучения врожденного иммунитета в живых животных. Здесь мы представили обзор в естественных условиях фагоцитоза assay, метод для изучения глобальных фагоцитоза и клеточный иммунный ответ в взрослых мух. Эта процедура может применяться для блокировки для новых генов, которые могут быть важны для узла обороны, проверки генов, выявленных в крупномасштабных в vitro RNAi экраны и дальнейшей характеризации мутантов с дефектами гуморального, кишки или противовирусными иммунных реакций. Она проста в установке и может дать большое количество надежных данных о нескольких штаммов мух в короткий промежуток времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят доктор Бет Гонсалес и д-р Aprajita Garg за поддержку в проведении экспериментов в естественных условиях фагоцитоза. NSF UMD заранее Грант Seed и UMD NIH T32 учебных грантов, ячейки и молекулярной биологии (CMB) хост-возбудитель взаимодействий (HPI), финансирование этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 146 фагоцитоз бактерии клеточный иммунитет Drosophila melanogaster врожденный иммунитет Взрослый
Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки <em>Drosophila melanogaster</em>, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter