Summary
Лакримальная железа (LG) имеет два типа клеток, выражающих атоин(ЗСМА) ( и миоэпителиальные клетки (МЭК) и перициты. MECs имеют эктодермального происхождения, найденные во многих железистых тканях, в то время как перициты являются сосудистыми гладкими мышечными клетками эндодермального происхождения. Этот протокол изолирует МЭЦ и перициты из мурин-ЛГ.
Abstract
Lacrimal железа (LG) является экзокриной трубоацинара железы, которая выделяет aqueous слой слезной пленки. Эпителиальное дерево LG состоит из ацинара, протоковых эпителиальных и миоэпителиальных клеток (МЭК). MECs выражают альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) и имеют сократительный функцию. Они находятся в нескольких железистых органов и имеют эктодермального происхождения. Кроме того, LG содержит SMA' сосудистые гладкие мышечные клетки эндодермального происхождения, называемые перицитами- сократительные клетки, которые окутывает поверхность сосудистых труб. Новый протокол позволяет нам изолировать как МЭЦ, так и перициты от взрослых мурин-ЛГ и субмандибулярных желез (СМГ). Протокол основан на генетической маркировке MECs и перицитов с использованием SMACreErt2 /""Rosa26-TdTomatofl/fl мышь штамма, а затем подготовка LG одноклеточной подвески для флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS ). Протокол допускает разделение этих двух клеточных популяций разного происхождения на основе выражения молекулы эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) мЕК, в то время как перициты не выражают EpCAM. Изолированные клетки могут быть использованы для культивирования клеток или анализа экспрессии генов.
Introduction
Миоэпителиальные клетки (MECs) присутствуют во многих экзокринных желез, включая lacrimal, слюнные, жесткие, пот, простата, и молочные. MECs являются уникальным типом клеток, который сочетает в себе эпителиальный и гладкий мышечный фенотип. MECs выражают а-гладкий мышечный актин (SMA) и имеют сократительной функции1,2. В дополнение к MECs, lacrimal gland (LG) и submandibular железа (SMG) содержит sMA' сосудистые клетки, называемые перицитами, которые являются клетками эндодермального происхождения, которые окутывают поверхность сосудистых труб3. Хотя MECs и перициты выражают много маркеров, SMA является единственным маркером, который не выражается в других lg и SMG ячейки1,3.
В течение последних 40 лет несколько лабораторий сообщали о проведении анализов на диссоциацию различных тканей экзокринной железы, в которых применялись неэнзиматические и ферментативные подходы. В одном из первых докладов, опубликованных в 1980 году, Фриц и соавторы описали протокол для изоляции кошачьих околоунид ацини с использованием последовательного пищеварения в коллагеназе / трипсин решение4. В 1989 году Ханн и соавторы скорректировали этот протокол для изоляции ацини от крыс LGs с помощью смеси коллагеназы, гиалуронидаза и DNase5. В 1990 году Криппс и его коллеги опубликовали метод неферментатической диссоциации лакримальной железы acini6. Позже, в 1998 году, Зухри и его соавторы вернулись к ферментативному протоколу диссоциации для последующей ca2"-изображения на LG и SMG изолированных ацини7. В течение последнего десятилетия исследователи сосредоточили свое внимание на изоляции стволовых/прародителей клеток от экзокринных желез. Pringle и соавторы описали протокол в 2011 для изоляции стволовых клеток мыши SMG8. Этот метод был основан на изоляции стволовых клеток, содержащих салисферы, которые были сохранены в культуре. Авторы утверждали, что размножающиеся клетки, выражающие стволовые клетки связанных маркеров могут быть изолированы от этих салисфер8. Шатос и соавторы опубликовали протокол для изоляции клеток-прародителей от невредимых взрослых крыс LGs с использованием ферментативного пищеварения и сбора "освобожденных" клеток9. Позже, в 2015 году, Акерманн и его соавторы скорректировали эту процедуру, чтобы изолировать предполагаемые «мурин-лакримальные стволовые клетки» («mLGSCs»), которые могут распространяться как монослойная культура в течение нескольких проходов10. Однако ни одна из ранее упомянутых процедур не позволяла различать клеточные подтипы и отдельные популяции изолированных эпителиальных клеток. В 2016 году Громова и его соавторы опубликовали процедуру изоляции клеток LG стволовых/прародителей от взрослых мурин-лгусов с использованием FACS11. Однако этот протокол не был предназначен для изоляции МЭЦ.
Недавно мы показали, что мы можем изолировать клетки СМАЗ от 3 недельных sMA-GFP мышей12. Тем не менее, в это время мы не отделили различные популяции клеток СМАЗ. Здесь мы установили новую процедуру прямой изоляции дифференцированных МЭЦ и перицитов от взрослых ЛГ и СМГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся работа на животных была проведена в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (NIH) и была одобрена Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Научно-исследовательского института Скриппса. Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество мышей и их страдания. Все экспериментальные животные получили стандартную диету с бесплатным доступом к водопроводной воде.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Основные шаги для MEC и изоляции перицитов изложены схематично на рисунке 1A-F. Все реагенты и оборудование, используемые для этой процедуры, описаны в таблице1.
1. Мыши и маркировка клеток SMA
- Используйте взрослых (2-4 месяцев) тамоксифен-индуцированных, "SMA инициативе репортер мышей SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Штамм SMACreErt2 любезно предоставлен доктором Иво Калайзичем13. Роза26-TdTomatofl/fl (B6. Cg-Gt (ROSA)26Sortm9 (CAG-tdTomato)Hze/J, также известный как штамм Ai9) (007909) были приобретены в лаборатории Джексона (Сакраменто, Калифорния). Клетки СМАЗ были помечены интраперитонеальной тамоксифен (ТМ) администрации. -
Приготовление раствора тамоксифена
- Приготовьте фильтрованное кукурузное масло. Используйте 0,22 мкм вакуумный фильтр, так как кукурузное масло вязкое.
- Перенесите 1 г порошка ТМ из бутылки в трубку 50 мл. Добавьте 1 мл этанола в бутылку, крышка и встряхните его, чтобы промыть, затем добавить в трубку 50 мл. Повторите еще раз с другой 1 мл этанола.
- Добавьте фильтруенное кукурузное масло, чтобы сделать 50 мл раствора 20 мг/мл ТМ. Vortex трубки, завернуть его в фольгу, и положить его в встряхивую ванну воды или встряхивая инкубатор при 45 градусах Цельсия.
- Это может занять около 12-24 ч, чтобы растворить TM. Время от времени, удалить трубку и проверить на все оставшиеся кристаллы. Как только ТМ полностью растворится, aliquot и хранить при -80 градусах Цельсия. Размороженое аликот может быть использовано повторно.
-
Для обозначения клеток СМАЗ, вводить мышей интраперитонеально (IP) с ТМ на два последовательных дня.
- Вводят 3-4 недели старого SMACreErt2 /'"(Rosa26-TdTomatofl/f любых гендерных мышей с ТМ на 100 л/20 г (или 2 мг/20 г) массы тела (рисунок1A). Мыши готовы к использованию для клеточной изоляции через 2-3 дня после последней инъекции ТМ. При необходимости, инъекционные мыши могут быть принесены в жертву в более длительные периоды времени после инъекции ТМ.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ В качестве контроля за надлежащей компенсации во время FACS, один дикий тип (C57Bl/6) мышь и один SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl мышь не вводится с ТМ (с "неокрашенными" MECs) того же возраста будет необходимо. Используйте те же расчеты, предусмотренные для 2 SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl мышей. Не вводится SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl позволит оценить фон DSRed. Мышь C57Bl/6 будет служить негативным контролем неокрашенных клеток.
- Вводят 3-4 недели старого SMACreErt2 /'"(Rosa26-TdTomatofl/f любых гендерных мышей с ТМ на 100 л/20 г (или 2 мг/20 г) массы тела (рисунок1A). Мыши готовы к использованию для клеточной изоляции через 2-3 дня после последней инъекции ТМ. При необходимости, инъекционные мыши могут быть принесены в жертву в более длительные периоды времени после инъекции ТМ.
2. Решения и буферы
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ LG является эпителиального происхождения железы, которая содержит внеклеточной матрицы, что делает диссоциацию клеток трудно. Поэтому рекомендуется использовать специальную комбинацию ферментов и многоступенчатый процесс пищеварения, описанный ниже.
-
Раствор акций типа II Dispase (25x)
- Растворите 120 мг порошка диспаса II типа в 2 мл 50 мМ HEPES/150 мМ NaCl для подготовки 25-x бульонного раствора (окончательная концентрация диспаса должна составить 30 единиц/мл). Единицы на миллиграмм могут варьироваться в зависимости от количества мышей и концентрация диспазы должна быть соответствующим образом скорректирована.
- Подготовьте 200 аликотов и храните их при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев или 4 градусов по Цельсию в течение нескольких дней. Не замораживайте/нейтелите аликот диспаса более одного раза, чтобы предотвратить деградацию ферментов.
-
Решение dNase type I
- Растворите 5 мг порошка типа DNase в 5 мл раствора 50% глицерола, буфера Tris 20 мМ (pH 7.5) и 1 мМ MgCl2 (концентрация запасов должна быть приблизительно 2000 единиц/мл). Единицы на миллиграмм могут варьироваться в зависимости от количества мышей и, таким образом, концентрация DNase должна быть скорректирована соответствующим образом.
- Фильтруй штоковое решение с помощью фильтра 0,22 мкм и шприца объемом 10 мл.
- Подготовьте 200 аликотов и храните их при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев или 4 градусов по Цельсию в течение нескольких дней. Не замораживайте/оттепель более одного раза, чтобы предотвратить деградацию ферментов.
-
Среда пищеварения
- До 10 мл DMEM низкой глюкозы без глутамина, добавить 100 л клеточной культуры дополнения (например, Glutamax, см. Таблица материалов) для разбавления 1"100.
- До 2 мл DMEM низкой глюкозы с дополнением клеточной культуры, добавить 6 мг коллагенеза типа I и тщательно перемешать путем трубачирования (фермент на влажном льду), 160 л раствора диспаса (2,4 U/mL конечной концентрации), 16 Л DNase типа I стокового раствора (8 U/mL конечной концентрации) , и 12 кл 1 M CaCl2 (6 мМ окончательная концентрация).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Кальций необходим для увеличения ферментативной активности14,15. Все расчеты предусмотрены для изоляции клеток от четырех лакримальных желез от двух взрослых мышей. Объем среды пищеварения может варьироваться в зависимости от количества ткани и количества репликаций. Не используйте более 4 лакримальных желез от 2-4 месяцев мышей на 2 мл среды.
-
Блокирование среды I
- До 25 мл DMEM/F-12 добавьте FBS (15% конечной концентрации), 250 л добавок клеточной культуры (см. Таблица материалов)для разбавления 1000, и 50 л 0,5 М EDTA pH 8.0 (1 мМ окончательная концентрация).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Из различных типов среды, которые были сопоставлены для этого протокола DMEM/F-12 дал лучшие результаты. Эта среда также была использована другими исследователями для изоляции / культуры эпителиальных клеток16,17.
- До 25 мл DMEM/F-12 добавьте FBS (15% конечной концентрации), 250 л добавок клеточной культуры (см. Таблица материалов)для разбавления 1000, и 50 л 0,5 М EDTA pH 8.0 (1 мМ окончательная концентрация).
-
Блокирование среднего II
- До 25 мл PBS, добавить 50 л 0,5 М EDTA pH 8.0 (1 мМ конечной концентрации).
-
Восстановление среды
- До 2 мл HBSS дополнены 5 мМ MgCl2, добавить 100 л DNase типа I запас раствора до 100 У на 2 мл окончательной концентрации. Относительно высокие концентрации DNase типа I требуется для уменьшения агрегации эпителиальных клеток.
-
Флуоресценция активированная сортировка ячейки (FACS) буфер
- К 486,5 мл PBS добавьте 12,5 мл сыворотки (2,5% конечной концентрации) и 1 мл 0,5 М EDTA pH 8.0 (1 мМ окончательная концентрация).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Буфер может храниться при 4 градусах Цельсия в течение максимум 6 недель.
- К 486,5 мл PBS добавьте 12,5 мл сыворотки (2,5% конечной концентрации) и 1 мл 0,5 М EDTA pH 8.0 (1 мМ окончательная концентрация).
3. Взрослая мышь Lacrimal Gland сбор урожая и микродиссекции
- Анестезия мыши путем вдыхания изофлюран (настроить изофруран скорость потока или концентрации до 5% или больше) и жертвовать шейки вывиха. Выполнять анестезию и эвтаназию в соответствии с рекомендациями институциональных МАКУЦ.
- Используя тонкие щипцы и ножницы, удалить кожу между глазом и ухом(рисунок 2A).
- Чтобы вскрыть LG, осторожно потяните LG с помощью пинцета и в то же время поцарапать соединительной ткани вокруг LG с помощью резкого кончика небольших ножниц, чтобы освободить его (Рисунок 2B).
- Избегайте резки ножницами, так как LG и околоушные слюнные железы расположены очень близко друг к другу и должны быть разделены до вскрытия. Когда LG и околоушные железы разделены, вырезать LG с помощью ножниц. Поместите железы в 35 мм блюдо с 2 мл холодного PBS (держать на льду)(рисунок 1B).
-
Как LG покрыта капсулы соединительной ткани / конверт, обрезать любые окружающие жира и соединительной ткани под рассекающим микроскопом и удалить капсулу LG с двумя щипками.
- Повторите этот шаг для всех желез.
- Проверьте небольшой кусочек ткани под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить маркировку клеток(рисунок 1C).
4. Подготовка подвески lg одноклеточных
- Перенесите все LGs в 35 мм блюдо с 0,5 мл комнатной температуры (RT) пищеварения средств и фарша LGs с помощью небольших ножниц на очень мелкие кусочки (примерно 0,2-1 мкм2). Как правило, это занимает около 3 минут, чтобы фарш 4 LGs(Рисунок 2C).
- Передача измельченных тканей в 2 мл круглой нижней трубки с помощью широкоборного пипетки фильтр анам. Используйте нормальный размер кончика пипетки с наконечником отрезали(Рисунок 2D).
- Добавить до 2 мл пищеварения среды и перемешать путем инвертирования трубки.
- Поместите трубку в трясущемся инкубаторе (или встряхивая водяной баней), при 37 градусах По Цельсию, 100-120 об/мин в течение 90 мин.
- Каждые 30 минут медленно pipette железы штук 20-30 раз с помощью 1000 л фильтра отзыв с уменьшением размера скважины(Рисунок 2D). После инкубации/тритурации возьмите аликот 10 л и проинспектируем под микроскопом кластеры. Если кластеры сохраняются, продолжайте пищеварение.
- После 90 мин, пройти образец 2-3 раза через инсулин шприц иглы (31G) для дальнейшего освобождения клеток в подвеску.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Нет видимых кусочков лакримальной железы должны оставаться в растворе, как только пищеварение завершено(Рисунок 1D). - Перенесите подвеску ячейки на трубку 15 мл и добавьте блокирующий медиатип I в общей сложности 5 мл. Перевернуть трубку 2-3 раза, чтобы перемешать.
- Передайте суспензию клетки через 70 мкм-ситечко, помещенное на трубку 50 мл. Вымойте ситечко с 1 мл блокирующего типа носителя I. Повторите шаг 4.8 снова.
- Образцы центрифуги при 0,4 х г в течение 5 мин на RT.
- Аспирируй супернатанта. Повторно приостановить ячейки в 2 мл блокирования среднего типа II с помощью 1 мл пипетки наконечник и передать подвеску клетки в 2 мл микроцентрифуг трубки.
- Центрифуге клетки на 0,4 х г (24 х 1,5/2,0 мл ротора; см. Таблица материалов) в течение 3 мин на RT.
- Аспирный супернатант и повторно приостанавливайте клетки в 1 мл раствора отслоения клеток (см. ТаблицаМатериалов).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Здесь решением отослаиота клеток является Accutase, фермент морского происхождения с протеолитической и коллагенолитической активностью, который отделяет/разъединяет клетки для анализа маркеров поверхности клеток. - Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, при 100-120 об/мин в течение 2-3 мин. Переварение с раствором отслоения клеток может повредить клеточные мембраны.
- Перенесите суспензию ячейки в трубку 50 мл и сложить 10 мл блокирующего среднего типа I. Центрифуга трубки на 0,4 х г (24 х 1,5/2,0 мл ротора; см. Таблица Материалов) в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и повторно приостановить клетки в 6 мл восстановления средств массовой информации и инкубировать клетки в течение 30 минут на RT.
- Проверьте 10 зл и суспензии клеток под микроскопом, чтобы обеспечить полную диссоциацию клеток(рисунок 3).
- Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и трипан синий. Обычно мы ожидаем 4 х10 -6 х 106 ячеек из четырех LGs (один образец).
- Центрифуги клеток на 0,4 х г (24 х 1,5/2,0 мл ротора; см. Таблица материалов) в течение 3 мин на RT и приступить к окрашиванию антител.
5. Запятнание антител
- Добавьте до 5 x105 ячеек в трубку 2 мл, содержащую 400 л буфера FACS. Добавьте 5 qL Бриллиантовый фиолетовый 421 анти-мышь CD326 (EpCAM) и 0,5 л Ghost Red 780 (Viability Dye).
- Параллельно подготовьте элементы управления для корректировки компенсации FACS.
Отрицательный контроль-1 (клетки из мыши дикого типа)
Фоновый контроль неокрашенных клеток от SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl
Cy7-780 окрашенных клеток (клетки из дикого типа мыши окрашенных с Ghost Red 780 Жизнеспособность краситель)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (клетки из мыши дикого типа, окрашенные антителом EpCAM-Brilliant Violet 421).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для каждого контрольного образца используйте не менее 1 х 105 ячеек на 400 qL буфера FACS. - После добавления каждого реагента смешивают клетки тщательно путем пипетки.
- Оберните трубку (ы) фольгой и поверните трубки в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.
- Образцы центрифуг на 0,4 х г (24 х 1,5/2,0 мл ротора; см. Таблица материалов) в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия.
- Повторно приостановить ячейки в 1 мл буфера FACS. Важно мыть клетки, чтобы уменьшить фон во время компенсации.
6. Флуоресценция активированная сортировка клеток
- Перенесите суспензию ячейки в трубки 5 мл FACS и приступаем к анализу FACS. Держите клетки на льду.
- Отрегулируйте компенсацию с помощью одного цветового управления.
- Сортировать клетки на 20 пси через сопло 100 мкм с использованием соответствующего цитометра потока (см. Таблица материалов). Стратегия Gating18 показана на рисунке 1E и рисунке 4.
- Сбор отсортированных ячеек в средние, РНК-позднее, FACS или лиза буферов в зависимости от процедур вниз по течению(Рисунок 1E,F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышь модели для изоляции SMA- MECs и перицитов
Установленный протокол допускает изоляцию двух чистых популяций- и перицитов из ЛГ и СМГ (см. таблицу1). Эти два типа клеток имеют разный размер и внешний вид. Микрососудистые перициты, развиваются вокруг стенка капилляров(рисунок 5A) и имеют квадратную форму (рисунок5B), в то время как MECs окружают LG секреторные ацини, имеют длительные процессы и занимают относительно большую площадь (рисунок5A,B ). Описанная процедура основана на генетической клеточной маркировке SMA в ТМ-индуцируемом Штамме SMACreErt2/'"(Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain. Кроме того, антитела EpCAM позволяют исследователям различатьэпителиальные SMA -"EpCAM- клетки эктодермального происхождения (MECs) и SMA-EpCAM- клетки эндодермального происхождения (перициты).
Подготовка одноклеточной подвески
LG содержит нитевидные внеклеточной матрицы, которые должны быть переварены тщательно. Предоставленный протокол позволяет подготовить одноклеточное решение для анализа FACS и дальнейшего применения. Пример разобщенных ячеек показан на рисунке 3.
MEC и изоляция перицитов FACS
Чтобы отличить MECs от перицитов, одиночные клетки были окрашены антителами к EpCAM, который обнаруживает только эпителиальные клетки. Основная популяция клеток определялась по области переднего и бокового рассеяния gating(рисунок 4A). Дублы были исключены путем построения области переднего рассеяния по сравнению с шириной и с боковой области рассеяния по сравнению с шириной(рисунок 4B). Мертвая клетка исключение было сделано через Ghost Red 780 (Жизнеспособность краситель) (Рисунок 4C). Немаркированный контроль(рисунок 4E),контроль фона и контроль антител, помеченные одним первичным антителом, использовались для определения фонового шума (неспецифические связывания антител) и для установления надлежащей компенсации для оптимального разделения между сигналами(рисунок 4D). Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения FlowJo.
MECs и перициты были закрыты маркировки DsRed. Обнаружены DsRedи dim (не показано) и DsRed- яркие клетки как в MEC, так и в популяциях персицитных клеток (рисунок4D). Яркость помеченных клеток может зависеть от уровня экспрессии SMA или степени активации репортера при инъекции ТМ19. Только DS Красныйй яркая популяция клеток были собраны, так как только полностью дифференцированные клетки были необходимы. Популяции тусклых клеток DS Redи dim требуют дальнейшего изучения.
Приложения вниз по течению
Хорошо известно, что MECs играют важную функцию контрактуля в экзокринных железах. Кроме того, они очень пластиковые клетки и имеют особенности стволовых клеток. Таким образом, изолированные МТС могут быть использованы в нескольких приложениях. Например, клетки могут быть культивированы, использованы для изоляции РНК или трансплантации(рисунок 1F)12,20,21,22.
| Параметр | Лакримальная железа | Подмандибулярная железа |
| Количество мышей на образец | 2 | 1 |
| Количество желез на образец | 4 | 2 |
| Рассеивание желез | Отдельно от круглостых желез | Отдельно от сублингвальной железы |
| Концентрация коллагенеза на образец | 6 мг/2 мл | 9 мг/2 мл |
| Приблизительный номер ячейки после энзиматической диссоциации | 4x105-6x105 | 9x105-1.5x106 |
| Шаг восстановления (см. раздел "Взрослая мышь Lacrimal Gland Одноклеточная диссоциация", точка 15) | Повторное приостановка клеток в 6 мл восстановительных носителей | Повторное приостановка клеток в 12 мл восстановительных носителей |
| Объем буфера FACS во время окрашивания антител | 400 л | 2 трубки по 400 л; лучше разделить клетки на две или три трубки, что каждая трубка не более 6x105 |
Таблица 1 Г.В.А. Модификация протокола об изоляции клеток от подчелюстной железы (СМГ). В таблице описаны основные изменения, необходимые для изоляции MECs и перицитов от murine SMG по сравнению с процедурой для murine LG.
Рисунок 1. Схематическое представление эксперимента. (A) IP инъекции SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/flмышей с ТМ. (B) Изоляция и фарш LG или SMG. (C) Анализ маркировки клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. (D) Многоступенчатое ферментативное пищеварение для подготовки одноклеточного раствора. Очень важно проверить шаги пищеварения под световым микроскопом, чтобы убедиться, что клетки высвобождаются из кластеров. (E) Пример gating, показывающий SMA-яркий DS Red/EpCAM (MECs) и DS Red'bright/EpCAM- (перициты). (F) Собранные MECs и перициты могут быть подвергнуты различным процедурам вниз по течению, включая культивирование клеток, изоляцию РНК и анализ экспрессии генов и трансплантацию клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Критические шаги изоляции/минчирования LG. (A) Удаление кожи между глазом и ухом, чтобы вскрыть LG. Dashed желтый круг указывает на местоположение LG. (B) ВСКРЫТИе LG. желтая наконечник стрелы указывает области между lacrimal и ованчаемых желез. (C) LG mincing в среде пищеварения с помощью ножниц с изогнутыми, тупыми концами. (D) Передача измельченных тканей в 2 мл трубки. желтая наконечник стрелы изображает широкий размер скважины 1 мл наконечника, необходимых для передачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Confocal и контраст дифференциальной интерференции (DIC) изображения, иллюстрирующие разобщенные одиночные клетки от murine LG. (A-C) одиночные клетки, выделенные из двух LGs одного 4-месячного SMACreErt2 /""Rosa26-TdTomatofl/fl мыши. Ядра окрашены DAPI (синий). Белые наконечники стрел обозначают клетки SMA (DS Red) - MECs или перициты. Шкала бар 15 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Идентификация murine LG MECs и перицитов с помощью FACS. (A) Определение основной популяции клеток LG вперед и назад рассеяния области gating. (B) Исключение дублетов через передний разброс области по сравнению с шириной. (C) Исключение мертвых клеток через Ghost Red 780 (Viability Dye). (D) MEC (SMA- яркий /EpCAM)и перицит (SMA- яркий / EpCAM- )популяции отличаются на основе окрашивания с антителами EpCAM. (E) Немаркированный контроль (клетки из диких мыши типа). На каждом участке предоставляется % закрытых ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Конфокальные изображения, показывающие разницу в распределении и форме между MECs и перицитами, изолированными от murine LG. (A) Целый монтаж подготовки LG с помеченными клетками, показывающими разницу в распределении между MEC и перицитов. (B) Форма MEC и перицита отличается. Перицит относительно небольшой и имеет оруженную форму, в то время как MEC является большим и имеет неправильную форму и несколько длительных процессов. Стрелы - МЕК и перициты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи описан протокол MEC и перицитная изоляция от LG и SMG. Эта процедура была основана на генетической маркировке SMA, единственного надежного биомаркера МЭК и перицитов.
Актуальность разработки этого протокола была обусловлена почти полным отсутствием литературы, подчеркивающей изоляцию МЕК от МУРы и СМГ. Хотя генетическая маркировка была ранее использована, используя SMA-GFP мышей для изоляции клеток SMA от молодых трехнедельных LGs12, он не позволяет использовать эти старые мыши для изоляции клеток из-за частичной потери сигнала у взрослых мышей. Кроме того, gFP-маркированные ячейки дают относительно высокий фон в приложениях FACS23 и требуют дополнительных компенсаций. В отличие от этого, SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl мыши линия показывает нет или низкий фон и высокий уровень SMA маркировки активации на протяжении мыши послеродового развития, взрослой жизни и старения. Использование SMACreErt2 /""Роза26-TdTomatofl/fl мышь особенно важна для исследований, сосредоточенных на прогрессировании заболевания или старения, так как клетки SMA" у этих мышей могут быть помечены до развития болезни и изучены позже, когда болезнь/старение прогрессирует. Другим важным шагом протокола является тщательное измельчение LG и следующее пищеварение. Этот шаг может уменьшить количество клеток, полученных в ходе анализа FACS. В целом, изоляция и немедленный анализ первичных клеток также имеет важное значение в связи со значительными изменениями в транскрипционных профилях клеток, поддерживаемых в культуре24.
Кроме того, описанный протокол для MEC и изоляции перицитов от мурин-ЛГ позволяет проводить различные процедуры ниже по течению. Протеины, РНК и DNA извлечения по возможности от обеих одиночных населенностям, хотя несколько мышей/образцов нужно обрабатывать в параллельно или последовательно для того чтобы увеличить число клеток. В совокупности полученные результаты демонстрируют эффективный и относительно простой способ для MEC и перицитной изоляции от различных мурин железистой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах и не противоречат каким-либо другим интересам.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Иво Калайжича за предоставление нам штамма мыши SMACreErt2, Такеши Умазуме для хвостохранилища и генотипирования, Марка Шелли за приобретение профессиональных фотографий для рисунка 2. Мы также благодарим Совет научных редакторов Скриппса и Марка Шелли за редактирование научного английского языка. Мы благодарны научно-исследовательскому институту Scripps Flow Cytometry core за помощь в сортировке клеток и доктору Робину Уилленбрилу за многочисленные обсуждения/консультации по анализу данных FACS.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом глаз гранты 5 R01 EY026202 и 1 R01 EY028983 до H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
