Summary
Den lacrimal körtel (LG) har två cell typer som uttrycker α-Smooth muskelaktin (αSMA): myoepitelceller (MECs) och pericyter. MECs är av ektodermal ursprung, finns i många körtel vävnader, medan pericyter är vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung. Detta protokoll isolerar MECs och pericyter från murina LGs.
Abstract
Den lacrimal körtel (LG) är en exokrin tubuloacinar körtel som utsöndrar ett vattenhaltigt skikt av tår film. Den LG epitelceller träd består av acinar, duktal epitelial, och myoepithelial celler (mecs). MECs Express alfa glatt muskelaktin (αSMA) och har en kontraktila funktion. De finns i flera körtel organ och är av ektodermal ursprung. Dessutom innehåller LG SMA + vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung kallas pericyter: kontraktila celler som omger ytan av vaskulära rör. Ett nytt protokoll tillåter oss att isolera både MECs och pericyter från vuxna murina LGs och submandibular körtlar (SMGs). Protokollet är baserat på genetisk märkning av MECs och pericyter med hjälp av SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus stam, följt av beredning av LG Single-cell SUS pension för fluorescens AKTIVE rad cell sortering (FACS ). Protokollet tillåter separation av dessa två cell populationer av olika ursprung baserat på uttrycket av epitelial cell adhesionsmolekylen (EpCAM) av MECs, medan pericyter inte uttrycker EpCAM. Isolerade celler kan användas för cell odling eller gen uttrycks analys.
Introduction
Myoepithelial celler (MECs) finns i många exokrin körtlar inklusive lacrimal, salivary, harderian, svett, prostata, och bröst. MECs är en unik cell typ som kombinerar en epitelial och en smidig muskel fenotyp. Mecs Express α-Smooth muskelaktin (SMA) och har en kontraktila funktion1,2. Förutom MECs, den lacrimal körtel (LG) och submandibular körtel (SMG) innehåller SMA + vaskulära celler som kallas pericyter, som är celler av endodermala ursprung som omger ytan av vaskulära rör3. Även om mecs och pericyter uttrycker många markörer, är SMA den enda markör som inte uttrycks i andra LG och SMG-celler1,3.
Inom de senaste 40 åren, flera laboratorier rapporterade analyser för dissociation av olika exokrin körtel vävnader, där icke-enzymatiska och enzymatiska metoder tillämpades. I en av de första rapporter som publicerades i 1980, Fritz och medförfattare beskrev ett protokoll för att isolera felint parotis vindruvor med sekventiell mat smältning i en kollagenas/trypsin lösning4. I 1989, hann och medförfattare justerade detta protokoll för vindruvor isolering från råtta LGs med en blandning av kollagenas, hyaluronidas och DNase5. I 1990, Cripps och kollegor publicerade metoden för icke-enzymatisk dissociation av lacrimal körtel vindruvor6. Senare, i 1998, zoukhri och medförfattare återvände till en enzymatisk dissociation protokoll för att följa upp ca2 +-Imaging på LG och SMG isolerade vindruvor7. Inom det senaste decenniet har forskarna vänt sitt fokus på isolering av stamceller från exokrin körtlar. Pringle och medförfattare beskrev ett protokoll i 2011 för isolering av mus SMG stamceller8. Denna metod baserades på isolering av stamcells-innehållande salispheres, som bibehölls i kultur. Författarna hävdade att prolifererande celler uttrycker stamcells-associerade markörer kan isoleras från dessa salispheres8. Shatos och medförfattare publicerade protokollet för stamcells isolering från oskadade vuxna råtta LGs med enzymatisk mat smältning och samla "befriade" celler9. Senare i 2015, Ackermann och medförfattare justerade detta förfarande för att isolera presumtiva "murina lacrimal körtel stamceller" ("mLGSCs") som kan spridas som en mono-Layer kultur över flera passager10. Emellertid, ingen av de tidigare nämnda förfaranden som tillåts för att särskilja cellulära subtyper och enskilda populationer av isolerade epitelceller. I 2016, Gromova och medförfattare publicerade ett förfarande för isolering av LG stam/stamceller från vuxna murina LGs använder FACS11. Detta protokoll var dock inte avsett att isolera MECs.
Nyligen har vi visat att vi kan isolera SMA + celler från 3 vecka gamla SMA-GFP möss12. Men vid denna tid har vi inte separerat olika populationer av SMA + celler. Här har vi etablerat ett nytt förfarande för direkt isolering av differentierade MECs och pericyter från vuxna LGs och SMGs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djur arbete utfördes enligt National Institute of Health (NIH) rikt linjer och godkändes av institutionell djur vård och användning kommittén av Scripps Research Institute. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet möss och deras lidande. Alla försöks djur fick en standard diet med fri till gång till kran vatten.
Anmärkning: De viktigaste stegen för MEC och pericytbiologi isolering beskrivs schematiskt i figur 1a-F. Alla reagenser och all utrustning som används för detta förfarande beskrivs i tabell 1.
1. möss och märkning av SMA-cellerna
- Använd vuxna (2-4 månader gamla) tamoxifen-inducerbara, αSMA driven reporter möss SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl.
Anmärkning: Den SMACreErt2 stam var vänligt tillhandahålls av Dr Ivo kalajzic13. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. CG-gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/j, även känd som Ai9) stam (# 007909) köptes från Jackson Laboratory (Sacramento, ca). SMA +-celler har märkts med intraperitoneal tamoxifen (TM)-administrering. -
Beredning av tamoxifen lösning
- Förbered filtrerad majsolja. Använd 0,22 μm vakuum filter eftersom majsolja är trög flytande.
- Överför 1 g TM-pulver från flaskan till ett 50 mL-rör. Tillsätt 1 mL etanol i flaskan, locket och skaka det för att skölja sedan Tillsätt i en 50 mL tub. Upprepa igen med ytterligare 1 mL etanol.
- Tillsätt filtrerad majsolja för att göra 50 mL av en 20 mg/mL TM-lösning. Vortex röret, Linda in den i folie, och Lägg den i en skakande vatten bad eller skaka inkubator vid 45 ° c.
- Det kan ta ungefär 12-24 h att lösa upp TM. Från tid till annan, ta bort röret och kontrol lera eventuella kvarvarande kristaller. När TM är fullständigt upplöst, alikvot och förvaras vid-80 ° c. En upptinad alikvot kan återanvändas.
-
För att märka SMA +-celler, injicera möss intraperitonealt (IP) med TM på två sekventiella dagar.
- Injicera 3-4 veckor gamla SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f alla kön möss med TM på 100 μl/20 g (eller 2 mg/20 g) kropps vikt (figur 1a). Möss är redo att användas för cell isolering i 2-3 dagar efter den sista TM-injektionen. Vid behov kan injicerade möss offras vid längre tids perioder efter TM-injektionen.
Anmärkning: Som kontroller för korrekt kompensation under FACS, en vild typ (C57Bl/6) mus och en SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus inte injiceras med TM (med "ofärgade" mecs) i samma ålder skulle krävas. Använd samma beräkningar som för 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl - möss. Inte injiceras SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl gör det möjligt att utvärdera dsred bakgrund. C57Bl/6-musen kommer att fungera som en negativ kontroll av obefläckade celler.
- Injicera 3-4 veckor gamla SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/f alla kön möss med TM på 100 μl/20 g (eller 2 mg/20 g) kropps vikt (figur 1a). Möss är redo att användas för cell isolering i 2-3 dagar efter den sista TM-injektionen. Vid behov kan injicerade möss offras vid längre tids perioder efter TM-injektionen.
2. lösningar och buffertar
Anmärkning: LG är en epitelial ursprung körtel som innehåller en extracellulär matris som gör dissociation av celler svårt. Därför rekommenderas att använda en speciell kombination av enzymer och en fler stegs digestionsprocess som beskrivs nedan.
-
Dispase typ II stam lösning (25x)
- Lös upp 120 mg av dispase typ II pulver i 2 mL 50 mM HEPES/150 mM NaCl för att bereda en 25x stam lösning (slut koncentrationen av dispase bör vara 30 enheter/mL). Enheter per milligram kan variera beroende på antalet möss och koncentrationen av dispase bör justeras i enlighet med detta.
- Bered 200 μL Ali kvoter och förvara dem vid-70 ° c i upp till 6 månader eller 4 ° c i flera dagar. Du får inte frysa/Tina upp alikvot av dispase mer än en gång för att förhindra enzym nedbrytning.
-
DNase typ I lager lösning
- Lös upp 5 mg DNase typ I pulver i en 5 mL lösning av 50% glycerol, 20 mM tris buffert (pH 7,5) och 1 mM MgCl2 (lager koncentrationen bör vara cirka 2000 enheter/ml). Enheter per milligram kan variera beroende på antalet möss och därmed koncentrationen av DNase bör justeras i enlighet med detta.
- Filtrera stam lösningen med hjälp av ett 0,22 μm filter och en 10 mL spruta.
- Bered 200 μL Ali kvoter och förvara dem vid-70 ° c i upp till 6 månader eller 4 ° c i flera dagar. Frys/Tina inte mer än en gång för att förhindra enzym nedbrytning.
-
Mat smältning medel
- Till 10 mL DMEM låg glukos utan glutamin, tillsätt 100 μL av cell kultur tillägg (t. ex. Glutamax, se tabell över material) för en utspädning av 1:100.
- Till 2 mL DMEM låg glukos med cell kultur tillägg, tillsätt 6 mg kollagenas typ I och blanda grundligt genom pipettering (enzym på våt is), 160 μL av dispase stam lösning (2,4 U/mL slutlig koncentration), 16 μL av DNase typ I stam lösning (8 U/mL slutlig koncentration) och 12 μL 1 M CaCl2 (6 mm slutlig koncentration).
Anmärkning: Kalcium krävs för att öka enzymatisk aktivitet14,15. Alla beräkningar tillhandahålls för isolering av celler från fyra lacrimal körtlar från två vuxna möss. Volymen av mat smältnings mediet kan variera beroende på mängden vävnad och antalet replikat. Använd inte mer än 4 lacrimal körtlar från 2-4 månader gamla möss per 2 mL medium.
-
Blockering av medium I
- Till 25 mL DMEM/F-12, tillsätt FBS (15% slutlig koncentration), 250 μL cell kultur tillägg (se tabell över material) för en spädning av 1:100, och 50 μL av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm slutlig koncentration).
Anmärkning: Av de olika typer av medium som jämfördes för detta protokoll DMEM/F-12 gav bäst resultat. Detta medium har också använts av andra forskare för att isolera/kultur epitelceller16,17.
- Till 25 mL DMEM/F-12, tillsätt FBS (15% slutlig koncentration), 250 μL cell kultur tillägg (se tabell över material) för en spädning av 1:100, och 50 μL av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm slutlig koncentration).
-
Blockering av medium II
- Tillsätt 25 mL PBS till 50 μL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM slutlig koncentration).
-
Återvinnings medium
- Till 2 mL HBSS kompletterad med 5 mM MgCl2, tillsätt 100 ΜL av DNase typ I stam lösning till 100 U per 2 ml koncentration. Relativt höga koncentrationer av DNase-typ I krävs för att minska agg regering av epitelceller.
-
Fluorescence aktive rad cell sortering (FACS) buffert
- Till 486,5 mL PBS, tillsätt 12,5 mL serum (2,5% slutlig koncentration) och 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM slutlig koncentration).
Anmärkning: Bufferten kan förvaras vid 4 ° c i högst 6 veckor.
- Till 486,5 mL PBS, tillsätt 12,5 mL serum (2,5% slutlig koncentration) och 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM slutlig koncentration).
3. vuxen mus lacrimal körtel skörd och Microdissection
- Anesthetize musen genom isofluran inandning (justera isofluran flöde eller koncentration till 5% eller högre) och offra genom cervikal Dislokation. Utföra anestesi och eutanasi enligt institutionella IACUCs rekommendationer.
- Ta bort huden mellan ögat och örat med hjälp av fina pincett och saxar (figur 2A).
- Att dissekera en LG, försiktigt dra LG med hjälp av pincett och på samma gång skrapa bindväv runt LG med hjälp av vassa spetsen av små sax för att frigöra den (figur 2b).
- Undvik skärning med sax, som LG och parotis spott körtlar ligger mycket nära varandra och måste separeras före dissektion. När LG och parotis körtlar separeras, skär LG ut med sax. Placera körtlar i en 35 mm mat rätt med 2 mL kallt PBS (förvara på is) (figur 1b).
-
Som LG täcks av en bindväv kapsel/kuvert, trimma eventuella omgivande fett och bindväv under en dissekera Mikroskop och ta bort LG kapseln med två pincett.
- Upprepa detta steg för alla körtlar.
- Kontrol lera en liten bit vävnad under fluorescerande Mikroskop för att säkerställa cell märkning (figur 1c).
4. beredning av LG Single-cell SUS pension
- Överför alla LGs till en 35 mm mat rätt med 0,5 mL av rums temperatur (RT) mat smältning media och finhacka LGs med små saxar i mycket små bitar (ca 0,2-1 μm2). Normalt tar det ca 3 min att finhacka 4 LGs (figur 2C).
- Överför den malda vävnaden till ett 2 mL rundat botten rör med hjälp av en bredbar pipettfilterspets. Använd en normal stor pipettspets med spetsen avskuren (figur 2D).
- Tillsätt upp till 2 mL mat smältning medium och blanda genom att Invertera röret.
- Placera röret i en skakinkubator (eller skaka vatten bad), vid 37 ° c, 100-120 RPM för 90 min.
- Varje 30 min långsamt Pipettera delar 20-30 gånger med hjälp av en 1 000 μL filter spets med minskande hål storlek (figur 2D). Efter inkubation/triturering, ta 10 μL alikvot och inspektera under ett Mikroskop för kluster. Om kluster kvarstår, fortsätta mat smältningen.
- Efter 90 min, passera provet 2-3 gånger genom en insulin spruta nål (31G) för att ytterligare frigöra celler till SUS pension.
Anmärkning: Ingen synlig tår körtel bitar bör förbli i lösningen när mat smältningen är klar (figur 1d). - Överför cell SUS pensionen till ett 15 mL-rör och tillsätt blockerande media typ I till totalt 5 mL. Invertera röret 2-3 gånger för att blanda.
- Passera cell SUS pensionen genom en 70 μm cell sil placerad på en 50 mL tub. Tvätta silan med 1 mL blockerande medietyp I. Upprepa steg 4,8 igen.
- Centrifugera proverna vid 0,4 x g i 5 min vid RT.
- Aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna i 2 mL av blockerande medium typ II med en 1 mL pipettspets och överför cell SUS pensionen till ett 2 mL mikrocentrifugerör.
- Centrifugera cellerna vid 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; se material tabell) i 3 min vid RT.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera celler i 1 mL cell avlossning lösning (se tabell över material).
Anmärkning: Här är cell avlossning lösningen Accutase, en marin-ursprung enzym med proteolytiska och collagenolytic aktivitet som lossnar/separerar celler för analys av cell ytan markörer. - Inkubera cellerna vid 37 ° c, vid 100-120 RPM för 2-3 min. över-uppslutning med cell avlossning lösning kan skada cellulära membran.
- Överför cell SUS pensionen till ett 50 mL-rör och tillsätt 10 mL av blockerande medium typ I. Centrifugera röret vid 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; se material tabell) i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 6 mL återställningsmedia och inkubera cellerna i 30 minuter vid RT.
- Kontrol lera 10 μL cell SUS pension under Mikroskop för att säkerställa fullständig cell dissociation (figur 3).
- Räkna celler med en cell räknare och Trypan blå. Normalt, vi förväntar oss 4 x 105-6 x 106 celler från fyra LGs (ett prov).
- Centrifugera cellerna vid 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; se tabell över material) under 3 min vid RT och fortsätt till anti kropps färgning.
5. färgning av anti kroppar
- Tillsätt upp till 5 x105 -celler till ett 2 ml-rör som innehåller 400 ΜL FACS-buffert. Tillsätt 5 μL briljant violett 421 anti-mus CD326 (EpCAM) och 0,5 μL Ghost Red 780 (livs kraft Dye).
- Parallellt förbereda kontroller för att justera FACS kompensation:
Negativ kontroll-1 (celler från vildtyps-mus)
Bakgrunds kontroll ofärgade celler från SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl
Cy7-780 färgade celler (celler från vild typ mus fläckig med Ghost Red 780 livs kraft Dye)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (celler från vild typ mus färgade med EpCAM-Brilliant Violet 421 anti kropp).
Anmärkning: För varje kontroll prov Använd minst 1 x 105 celler per 400 ΜL FACS-buffert. - När du har lagt till varje reagensblandnings celler grundligt genom pipettering.
- Linda röret (s) med folie och rotera rören för 45 min vid 4 ° c.
- Centrifugera proverna vid 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; se material tabell) i 3 min vid 4 ° c.
- Återsuspendera cellerna i 1 mL FACS-buffert. Det är viktigt att tvätta cellerna för att minska bakgrunden under kompensation.
6. Fluorescence aktive rad cell sortering
- Överför cell SUS pensionen till 5 mL FACS-rör och fortsätt med FACS-analys. Håll cellerna på is.
- Justera kompensation med enkla färg kontroller.
- Sortera cellerna vid 20 psi genom ett 100 μm munstycke med lämpligt flödescytometer (se material tabell). Gating strategy18 visas i figur 1e och figur 4.
- Samla in sorterade celler i medium, RNA-senare, FACS eller lysis buffertar beroende på nedströms förfaranden (figur 1e, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus modell för att isolera SMA + MECs och pericyter
Det etablerade protokollet möjliggör isolering av två rena populationer: MECs och pericyter från LGs och SMGs (se tabell 1). Dessa två typer av celler har en annan storlek och utseende. Microvascular pericyter, utvecklas runt väggarna i kapillärer (figur 5a) och har en fyrkantig form (Figur 5b), medan mecs omger LG sekretoriska acini, har långa processer och upptar ett relativt stort område (figur 5a, B ). Det beskrivna förfarandet är baserat på genetisk cell märkning av SMA + i TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus stam. Additonally, EpCAM anti kroppar gör det möjligt för forskarna att skilja epitelial SMA+: epcam+ celler av ektodermal ursprung (MECS) och sma+epcam- celler av endodermala ursprung (pericyter).
Beredning av encellig SUS pension
Den LG innehåller en trådformiga extracellulär matris som måste smälta grundligt. Det tillhandahållna protokollet tillåter beredning av en enda cell lösning för FACS analys och ytterligare applikationer. Exemplet med dissocierade celler visas i figur 3.
MEC och pericytbiologi isolering av FACS
För att särskilja MECs från pericyter färgas enstaka celler med anti kroppar mot EpCAM, som endast detekterar epitelceller. Den huvudsakliga populationen av celler bestämdes av främre och sido spridnings område gating (figur 4a). Doublets exkluderades genom att plotta fram spridnings området mot bredden och med sido spridnings området mot bredden (figur 4b). Uteslutning av döda celler utfördes via Ghost Red 780 (lönsamhets färg) (figur 4c). En omärkt kontroll (figur 4E), bakgrunds kontroll och anti kropps kontroll märkt med en enda primär anti kropp användes för att fastställa bakgrunds brus (icke-specifik anti kropps bindning) och för att fastställa lämplig kompensation för optimal separation mellan signalerna (figur 4D). Data analyser utfördes med hjälp av FlowJo program vara.
MECs och pericyter var gated av DsRed märkning. DsRed+ Dim (visas inte) och dsred+ Bright-celler inom både MEC och cell populationer med pericyter upptäcktes (figur 4D). Ljus styrkan hos märkta celler kan bero på nivån av SMA-uttryck eller grad av reporter aktivering vid TM-insprutning19. Endast DS Red+ Bright cell population samlades in eftersom endast helt differentierade celler krävdes. DS Red+ Dim cell populationer kräver ytterligare utredning.
Nedströms applikationer
Det är välkänt att MECs spelar en viktig kontraktila funktion i exokrin körtlar. Dessutom är de mycket plast celler och har inslag av stamceller. Därför kan isolerade MECs användas i flera program. Till exempel kan celler odlas, används för RNA-isolering eller transplantation (figur 1f)12,20,21,22.
| Parametern | Lacrimal körtel | Submandibular körtel |
| Antal möss per prov | 2 | 1 |
| Antal körtlar per prov | 4 | 2 |
| Dissektion körtlar | Skild från öronspottkörteln | Skild från sublinguala körtel |
| Koncentration av kollagenas per prov | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Ungefärligt cell nummer efter enzymatisk dissociation | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Recovery steg (se avsnittet "Adult mus lacrimal körtel Single-cell dissociation", punkt 15) | Återsuspendera cellerna i 6 ml återställningsmedia | Återsuspendera celler i 12 mL återställningsmedia |
| Volym av FACS buffert under anti kropps färgning | 400 μL | 2 tuber med 400 μL; Det är bättre att dela upp cellerna i två eller tre rör som varje rör inte har mer än 6x105 |
Tabell 1: ändringar av protokollet för isolering av celler från submandibular körtel (SMG). Tabellen beskriver större ändringar som krävs för att isolera MECs och pericyter från murina SMG i jämförelse med förfarandet för murina LG.
Figur 1: en schematisk representation av experimentet. (A) IP injektioner av SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/flmöss med TM. (B) isolering och malning av LG eller SMG. (C) analys av cell märkning med fluorescensmikroskop. (D) flerstegs enzymatisk mat smältning för att bereda en encellig lösning. Det är viktigt att kontrol lera mat smältningen steg under ett ljus Mikroskop för att säkerställa att cellerna frigörs från kluster. (E) exempel på gating som visar SMA + Bright DS Red +/epcam + (mecs) och DS Red + Bright/epcam-(pericyter). Finsamlade mecs och pericyter kan utsättas för olika nedströms procedurer inklusive cell odling, RNA-isolering och gen uttrycks analys och cell transplantation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kritiska steg av LG isolering/mincing. (A) avlägsnande av hud mellan ögat och örat för att dissekera LG. streckad gul cirkel indikerar LG plats. (B) LG dissektion. Gul pilspets pekar ut området mellan lacrimal och parotis körtlar. (C) LG malning i mat smältningen medium med hjälp av sax med böjda, trubbiga ändar. D) överföring av hackad vävnad till 2 ml tub. Gul pilspets visar bred diameter 1 ml spets som krävs för överföring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Konfokal och differential störnings kontrast (dic) bilder som illustrerar separerade enstaka celler från murina LG. (A-C) enstaka celler isolerade från två LGs av en 4 månader gammal SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus. Kärnor är färgade med DAPI (blå). Vita pilspetsar betecknar SMA + (DS Red) celler: MECs eller pericyter. Skalbar = 15 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: identifiering av murina LG-MECs och pericyter med FACS. (A) bestämning av huvud populationen av LG-celler genom framåtspolning och sido spridnings område gating. (B) uteslutning av dubbletter via spridnings område mot bredd. (C) död cell uteslutning via Ghost Red 780 (livs kraft Dye). (D) MEC-populationer (SMA + Bright/epcam+) och pericytbiologi (SMA+ Bright/epcam-) som är distingerade baserat på färgning med epcam-antikropp. (E) omärkt kontroll (celler från vild typ mus). På varje tomt finns% av gated Cells. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Konfokala bilder som visar skillnad i distribution och form mellan MECs och pericyter isolerade från murina LG. (A) hela Mount beredning av LG med märkta celler visar skillnad i distribution mellan MEC och pericyter. (B) formen på Mec och pericytbiologi är annorlunda. Pericyte är relativt litet och har en squired form, medan MEC är stort och har oregelbunden form och flera långa processer. Arrowheads = MECs och pericyter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskrev ett protokoll över MEC och pericytbiologi isolering från LG och SMG. Detta förfarande baserades på genetisk märkning av SMA, den enda pålitliga bio markör av mecs och pericyter.
Brådskan att utveckla detta protokoll motiverades av den nästan totala frånvaron av litteratur som belyser isoleringen av MECs från murina LGs och SMGs. Även genetisk märkning användes tidigare, med hjälp av SMA-GFP möss för att isolera SMA + celler från unga tre-veckors-gamla LGs12, det tillät inte att använda dessa äldre möss för cell isolering på grund av partiell förlust av signal hos vuxna möss. Dessutom ger GFP-märkta celler en relativt hög bakgrund i FACS applikationer23 och kräver ytterligare kompenseringar. I kontrast, den SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus linjen visar ingen eller en låg bakgrund och höga nivåer av SMA märkning aktivering hela musen postnatal utveckling, vuxen ålder och åldrande. Användning av SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus är särskilt viktigt för studier inriktade på SJUKDOMSPROGRESSION eller åldrande, eftersom SMA + celler i dessa möss kunde märkas före sjukdoms utveckling och studerade senare när sjukdomen/åldrandet fortskrider. En annan kritisk steg i protokollet är grundlig LG malning och följande mat smältningen. Detta steg kan minska det cell nummer som erhålls under FACS-analysen. Övergripande, isolering och omedelbar analys av primära celler är också viktigt på grund av betydande förändringar i transkriptionella profiler av celler som upprätthålls i kultur24.
Dessutom, det beskrivna protokollet för MEC och pericytbiologi isolering från murina LGs möjliggör olika nedströms procedurer. Protein, RNA och DNA-extraktion är möjliga från både encellig populationer, även om flera möss/prover måste bearbetas parallellt eller sekventiellt för att öka antalet celler. Sammantaget, de erhållna resultaten visar ett effektivt och relativt enkelt sätt för MEC och pericytbiologi isolering från olika murina körtel vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen och inga konflikter av andra intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Ivo Kalajzic för att ge oss med SMACreErt2 mus stam, Takeshi umazume för mus tailing och genotypning, mark Shelley för att förvärva professionella bilder för figur 2. Vi tackar också Scripps råd för vetenskapliga redaktörer och mark Shelley för vetenskaplig engelska redigering. Vi är tacksamma för The Scripps Research Institute Flow Cytometry kärna för hjälp med cell sortering och Dr Robin Willenbring för flera diskussioner/råd om FACS data analys.
Detta arbete stöddes av nationella institut för hälsa, nationella ögon Institute Grants 5 r01 EY026202 och 1 r01 EY028983 till H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
