Er wordt een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire varkens aorta endotheel cellen (pAECs) beschreven. De geïsoleerde primaire pAECs kan worden gebruikt om de immuunrespons en coagulatie reactie bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het tekort aan menselijke organen op te lossen voor patiënten met eindstadium orgaanfalen, en het varken wordt beschouwd als een geschikte orgaan bron. Immuun afwijzing en coagulatie zijn twee belangrijke hindernissen voor het succes van xenotransplantatie. Vasculaire endotheliale cel (EC) letsel en dysfunctie zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de ontsteking en coagulatie reacties bij xenotransplantatie. Zo is isolatie van varkens aorta endotheel cellen (pAECs) noodzakelijk voor het onderzoeken van de immuunafstoting en coagulatie reacties. Hier hebben we een eenvoudige enzymatische aanpak ontwikkeld voor de isolatie, karakterisering en uitbreiding van zeer gezuiverde pAECs van miniatuur varkens. Eerst werd het miniatuur varken verdoofd met ketamine, en een lengte van aorta werd weggesneden. Ten tweede werd het endotheliale oppervlak van aorta blootgesteld aan 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing voor 15 min. ten derde werd het endotheeloppervlak van de aorta in slechts één richting met een celscraper (< 10 keer) geschuurd en niet gecomprimeerd tijdens het proces van Schrapen. Tot slot, de geïsoleerde pAECs van dag 3, en na passage 1 en passage 2, werden geïdentificeerd doorstroming cytometrie met een anti-CD31-antilichaam. De percentages van CD31-positieve cellen waren respectievelijk 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% en 92,4% ± 1,7% (gemiddelde ± SD). De concentratie van Collagenase IV, de spijsverterings tijd, de richting, en de frequentie en intensiteit van het schrapen zijn van cruciaal belang voor het verminderen van fibroblast besmetting en het verkrijgen van hoge zuiverheid en een groot aantal ECs. Concluderend, onze enzymatische methode is een uiterst effentieve methode voor het isoleren van ECs van het miniatuur varken aorta, en de cellen kunnen in vitro worden uitgebreid om de immuunrespons en coagulatie reacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Het tekort aan beschikbare organen voor transplantatie is een uitstekend probleem wereldwijd1. Volgens de Rode Kruis vereniging van China, slechts een klein aantal patiënten met eindstadium orgaan falen kreeg een geschikt orgaan in China in 2018.
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het probleem van orgaan tekorten op te lossen. Varkens organen worden beschouwd als de meest geschikte organen voor de mens vanwege anatomische en fysiologische gelijkenissen2,3. Het falen van een varkens xenotransplantaatmodellen is is grotendeels gerelateerd aan de primaat immuunafstoting en coagulatie responsen. Varkens endotheel cellen (ECs) zijn kritisch, omdat deze cellen zijn de eerste om te communiceren met het primaat immuunsysteem, waaronder antilichamen, complement, cytokines, en immune cellen (bv, T-cellen, B-cellen, en macrofagen)4,5. Varkens ECs spelen een vitale rol in varkens orgel en eilandje xenotransplantatie6,7. Dus, ECs zijn belangrijke cellen voor het onderzoeken van de afwijzing en coagulatie reacties op een varken Graft. Isolatie van hoge kwaliteit varkens ECs is vereist voor xenotransplantatie onderzoek.
In pogingen om ECs te isoleren van verschillende organen (bijv. hart, nieren, lever en aorta), zijn verschillende protocollen gerapporteerd in een xenotransplantaat instelling8,9,10,11,12. Echter, het houden van een ultrapuur cultuur van geïsoleerde ECs is een uitstekend probleem in de standaardprotocollen. De verhoogde concentratie van de verteerde oplossing, de ongepaste digestie tijd en de intensiteit van de Schraap kunnen bijdragen aan de verhoogde fibroblast besmetting in de huidige studies8,10,13. Trouwens, de methode van geïsoleerde pAECs van miniatuur varkens is minder bestudeerd. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde enzymatische methode om hooggezuiverde pAECs te isoleren van miniatuur varkens (Wuzhishan of Bama). Verschillende stappen in het protocol zijn ontworpen om fibroblast besmetting te verminderen en hoge zuiverheid ECs te verkrijgen.
Endotheliale cellen worden vaak gebruikt in onderzoek van vasculaire dysfunctie, diabetes, weefselregeneratie, transplantatie, en kankers14,15,16,17,18. Om de biologie en functie van ECs in deze ziekten te begrijpen en te karakteriseren, zijn er talrijke methoden om de ECs van verschillende zieke organen of weefsels te isoleren, gemeld8…
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gesteund door subsidies van Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisch wetenschappelijk onderzoek Stichting van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 en JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua district Stichting van wetenschap en technologie, Grant/Award nummer: 2017013; Nationale sleutel R & D-programma van China, subsidie/Gunnings nummer: 2017YFC1103704; Sanming project van geneeskunde in Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong (2019); Fonds voor medische discipline op hoog niveau bouw van Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Stichting van gezondheid en familie planning Commissie, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 en SZXJ2018059. We bedanken Hancheng Zhang en Zhicheng zou van de Universiteit van Shenzhen voor het assisteren bij de voorbereiding van het manuscript.
BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
Cell scraper | Corning | 3010# | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride:0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride:1mg/2ml | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
ECM | Sciencell | 1001# | |
ECGS | Sciencell | 1052# | |
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
Flowjo v10.0 | |||
Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap (T25) | Corning | 3289# | |
Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
Syringe(5mL) | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |